廣西百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因特征分析*

韋紅玉,隆昕穎,凌　俊,黃衍強(qiáng),楊　珊,李曉華,陳源紅,黃干榮,曾　怡△

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；2.廣西壯族自治區(qū)百色市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核科　533000；3.廣西壯族自治區(qū)百色市婦幼保健院　533000)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

廣西百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因特征分析*

韋紅玉1,隆昕穎2,凌俊3,黃衍強(qiáng)1,楊珊1,李曉華1,陳源紅1,黃干榮1,曾怡1△

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；2.廣西壯族自治區(qū)百色市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核科533000；3.廣西壯族自治區(qū)百色市婦幼保健院533000)

[摘要]目的分析百色市地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因KatG、inhA的突變特征。方法收集128例結(jié)核病患者痰液標(biāo)本，采用改良羅氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，絕對(duì)濃度法檢測(cè)異煙肼耐藥性，提取耐藥菌株DNA，PCR擴(kuò)增耐藥結(jié)核分枝桿菌katG、inhA基因序列并分析異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征。結(jié)果分離培養(yǎng)出98例結(jié)核分枝桿菌，34株對(duì)異煙肼耐藥，耐藥率為36.7%，耐藥菌株KatG基因突變率為44.1%(15/34)，其中315位點(diǎn)突變率為66.7%(10/15)，出現(xiàn)兩個(gè)新的突變位點(diǎn)為279(4/15)和427(1/15)。inhA 5位點(diǎn)突變率為13.3%(2/15)，inhA 16位點(diǎn)突變率為6.7%(1/15)，3株均為katG和inhA聯(lián)合突變。結(jié)論百色地區(qū)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌耐藥性產(chǎn)生與katG和inhA基因突變相關(guān)，檢測(cè)本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌katG和inhA基因突變可預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的耐藥性。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌；異煙肼；KatG；inhA

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性傳染病，結(jié)核病在全球許多地區(qū)發(fā)病率再次升高[1-2]，成為增加艾滋病感染的重要因素[3]。導(dǎo)致結(jié)核病高發(fā)病率和病死率的重要因素之一是耐多藥結(jié)核病的產(chǎn)生，耐多藥(multidrug resistance,MDR)即至少對(duì)異煙肼和利福平同時(shí)耐藥。異煙肼自1952年上市以來(lái)，一直是治療結(jié)核病的主要藥物之一，但是隨著耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)，目前異煙肼耐藥率約為17.6%[4]，且呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌常見突變基因?yàn)閗atG及inhA，常見突變位點(diǎn)為katG315及inhA啟動(dòng)子區(qū)域。百色市結(jié)核病的異煙肼耐藥率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，本研究擬闡明百色市地區(qū)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌臨床分離株katG及inhA基因突變特征及其與耐藥的關(guān)系。為本地區(qū)耐藥結(jié)核的防治和制訂有效的預(yù)防及干預(yù)措施提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1一般資料收集2013年在百色市疾病控制中心結(jié)核病防治所就診的結(jié)核痰液涂片陽(yáng)性患者128例(包括新發(fā)和復(fù)發(fā)患者，年齡19～88歲;男96例，女32例)的痰標(biāo)本。

1.2方法

1.2.1結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及耐藥性檢測(cè)痰液涂片陽(yáng)性細(xì)菌采用改良的羅氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株采用絕對(duì)濃度法進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。

1.2.2基因組DNA提取和katG、inhA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序基因組DNA提取采用北京Andybio公司生產(chǎn)的分枝桿菌DNA提取試劑盒(柱式)提取，擴(kuò)增katG基因引物：正向引物5′-GTC GGC GGT CAC ACT TTC-3′，反向引物：5′-GCT ACC ACG AAC GAC GAC-3′[5]，序列大小為660 bp；inhA基因引物：正向引物：5′-TCG CAG CCA CGT TAC GCT C-3′，反向引物：5′-CCA GCC GCT GTG CGA TC-3′[6]，序列大小為175 bp，引物由華大基因公司合成。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：5.0 μL模板，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 17.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25.0 μL(購(gòu)自北京全式金生物公司)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；94 ℃變性1 min，58.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3DNA序列測(cè)定與分析PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。用BLAST與H37RV相應(yīng)基因進(jìn)行序列比對(duì)，通過(guò)DNAman軟件判斷突變基因突變位點(diǎn)及形式。

2結(jié)果

2.1異煙肼耐藥基因鑒定從128例痰液涂片陽(yáng)性標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得98例結(jié)核分枝桿菌菌株，34株對(duì)異煙肼耐藥。提取耐藥菌株DNA進(jìn)行PCR，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致，部分PCR 產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。

2.2測(cè)序比對(duì)結(jié)果34株耐藥菌株中，15株katG或inhA基因出現(xiàn)突變，15株katG突變位點(diǎn)有3個(gè)；3株inhA突變位點(diǎn)有2個(gè)，均屬于聯(lián)合突變，其中2株為katG 315與inhA 5聯(lián)合突變，1株為katG 315與inhA 16，單個(gè)突變位點(diǎn)突變特征結(jié)果見表1。

A：1,H37RV；2～5,部分耐異煙肼菌株inhA基因PCR產(chǎn)物； B：1，H37RV；2～5，部分耐異煙肼菌株katG基因PCR產(chǎn)物；M:DNA分子標(biāo)記物。

圖1　　部分耐異煙肼菌株inhA、katG基因PCR電泳圖

3討論

異煙肼屬前體藥物，需由結(jié)核桿菌體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶激活，從而產(chǎn)生一系列的活性氧及活性有機(jī)自由基攻擊桿菌的多個(gè)靶點(diǎn)，結(jié)果造成一些蛋白靶點(diǎn)某些基團(tuán)氧化或?；沟鞍资Щ睿瑥亩鴮?dǎo)致菌體一些生理功能喪失。耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌可能與過(guò)氧化物酶的編碼基因(katG)和一種與分枝菌酸生物合成有關(guān)的酶編碼基因(inhA)操縱子改變有關(guān)。katG基因的變異少數(shù)是由于katG基因的全部缺失引起，大多數(shù)為katG基因的點(diǎn)突變，堿基的插入和缺失等。目前發(fā)現(xiàn)最常見的突變位點(diǎn)為第315位。

本實(shí)驗(yàn)98例結(jié)核分枝桿菌菌株出現(xiàn)34株異煙肼耐藥，耐藥率為36.7%，檢測(cè)耐藥菌katG及inhA基因序列，突變菌株為15株，突變率為44.1%，相比國(guó)內(nèi)外眾多研究結(jié)果稍低[7-9]。其中katG出現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)，315位點(diǎn)突變率為66.7%(10/15)，超過(guò)50%，與Hazbon等[10]研究結(jié)果無(wú)明顯差異，另與深圳市報(bào)道的 68.9%無(wú)太大差異[11]，但高于浙江省報(bào)道的46.8%[12]、廣東省報(bào)道的54.3%[5]及福建省報(bào)道的54.35%[13]，低于武漢報(bào)道的88.71%[14]、貴州遵義報(bào)道的92.3%[9]及Guo等[6]與陳曦等[15]的研究結(jié)果。279位點(diǎn)突變率為26.7%(4/15)，427位點(diǎn)突變率為6.7%(1/15)，這兩個(gè)突變位點(diǎn)目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，沒有發(fā)現(xiàn)有katG全基因缺失的情況。3例出現(xiàn)inhA基因突變，占耐藥突變株的20%，與吳雪瓊等[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，而Hazbon等[10]的研究結(jié)果顯示inhA基因突變占耐藥菌株的12%，朱中元等[17]的研究結(jié)果為65%，陳楊等[9]的研究結(jié)果為30%，由此可知耐藥株中inhA 基因突變具有明顯的地區(qū)差異性。inhA出現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，inhA 5位點(diǎn)突變率為13.3%(2/15)，inhA 16位點(diǎn)突變率為6.7%，突變率與陳楊等[9]的研究不同，且未檢測(cè)到inhA 6、7、8、23等位點(diǎn)的突變，可能與研究的樣本量、引物設(shè)計(jì)所覆蓋片段不同及基因突變存在地區(qū)差異有關(guān)。34例耐藥菌株中3例為katG和inhA雙基因聯(lián)合突變，占耐藥菌株的8.82%(3/34)，耐藥突變株的20.0%(3/15)，說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌katG和inhA基因突變與耐異煙肼相關(guān)。34例耐藥株中有19例(55.9%)未出現(xiàn)katG和(或)inhA基因突變，說(shuō)明可能還有其他基因或機(jī)制可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼產(chǎn)生耐藥性。

根據(jù)上述，雖然各地區(qū)katG基因突變率有所不同，但通過(guò)檢測(cè)可知katG基因315位突變形式在我國(guó)常見，且最常見的突變形式還是點(diǎn)突變[18]，各地區(qū)的差異可能與標(biāo)本量的采集及地域有關(guān)。本研究闡明了本地區(qū)耐異煙肼結(jié)核菌的產(chǎn)生主要是因?yàn)閗atG基因的315位點(diǎn)密碼子發(fā)生改變，inhA基因突變也是百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生異煙肼耐藥性的主要分子機(jī)制，新發(fā)現(xiàn)的katG 279和427突變位點(diǎn)與異煙肼結(jié)核分枝桿菌耐藥性的相關(guān)性還有待研究。katG 315位點(diǎn)作為異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌診斷的分子標(biāo)記靶點(diǎn)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌新突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制及耐藥結(jié)核病的快速檢測(cè)提供依據(jù)，檢測(cè)本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌katG和inhA基因突變可預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。

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doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.031

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071345、81160535)；廣西高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(201204LX323)。

作者簡(jiǎn)介:韋紅玉(1975-)，講師，碩士，主要從事微生物學(xué)與免疫學(xué)研究。△通訊作者，E-mail:zengyirr@163.com。

[中圖分類號(hào)]R378.911

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0093-03

(收稿日期：2015-08-18修回日期：2015-09-12)