阿奇霉素對氣管導管內(nèi)流感嗜血桿菌生物被膜的影響

王　瑛,王　東,郭　治,石書梅△

(1.中國人民解放軍濟南軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科，濟南 250033；2.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院呼吸科，北京 100083)

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論著·基礎研究

阿奇霉素對氣管導管內(nèi)流感嗜血桿菌生物被膜的影響

王瑛1,王東2,郭治1,石書梅1△

(1.中國人民解放軍濟南軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科，濟南 250033；2.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院呼吸科，北京 100083)

[摘要]目的觀察流感嗜血桿菌是否可在氣管導管內(nèi)形成生物被膜并評價阿奇霉素對氣管導管內(nèi)流感嗜血桿菌形成生物被膜的影響。方法選取Wistar大鼠120只，分為空白對照組、感染組及給藥組；流感嗜血桿菌制備成瓊脂小珠，接種于氣管插管大鼠，掃描電鏡觀察氣管導管生物被膜形成情況，并通過細菌計數(shù)評價療效。結(jié)果接種細菌后第1天掃描電鏡可見導管壁表面凹凸不平，外被黏液樣物質(zhì)，并可見細長的菌體被覆其中,給予阿奇霉素治療后，感染組和給藥組均可在氣管插管形成生物被膜，但給藥組細菌數(shù)明顯降低。結(jié)論流感嗜血桿菌可在氣管插管形成生物被膜，阿奇霉素對流感嗜血桿菌氣道內(nèi)導管早期生物被膜有一定抑制作用。

[關鍵詞]插管法,氣管內(nèi)；生物被膜；阿奇霉素

機械通氣作為呼吸支持技術在治療呼吸衰竭中被廣泛應用，并取得明顯效果。通過對氣管插管機械通氣患者的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根據(jù)基礎疾病的不同發(fā)生呼吸機相關肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)的概率為9%～27%，在重癥監(jiān)護病房內(nèi)幾乎90%的醫(yī)院獲得性肺炎都發(fā)生于機械通氣，同時VAP也是導致死亡的主要原因[1]。生物被膜(biofilm)是指微生物(如細菌)被包裹在其自身分泌的多聚物中形成的一種特殊細胞群體結(jié)構(gòu)。生物被膜一旦形成,就對抗菌藥物及機體免疫力有著天然的抵抗能力，用抗菌藥物難以徹底清除導致感染的反復發(fā)作[2]。有研究證實氣管導管生物被膜感染是導致VAP發(fā)生不可忽視的因素[3]。本實驗通過對大鼠氣管插管，流感嗜血桿菌氣道滴入，建立氣管插管生物被膜模型，觀察氣管內(nèi)導管生物被膜的形成情況，并通過阿奇霉素灌胃治療氣管插管大鼠流感嗜血桿菌感染，觀察阿奇霉素對氣管導管流感嗜血桿菌生物被膜的影響。

1材料與方法

1.1材料雄性二級Wistar大鼠120只，鼠齡8周，體質(zhì)量(180+20)g(濟南軍區(qū)總醫(yī)院動物中心提供)。流感嗜血桿菌1709由濟南軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科臨床分離菌株，并經(jīng)系統(tǒng)鑒定。

1.2方法

1.2.1流感嗜血桿菌瓊脂小珠制作[4]從新鮮腦心浸液瓊脂平板挑取5個流感嗜血桿菌菌落，接種于10 mL肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃懸搖狀態(tài)180 r/min下培養(yǎng)24 h，比濁儀調(diào)細菌水平至1×109/mL，細菌混懸液2 mL加熱至50 ℃，與50 ℃溶化的4%W/V純化瓊脂等量混合，50 ℃水浴中徹底混勻。5 mL注射器(預熱至50 ℃吸取混合物)，通過23號針頭將3 mL混懸液快速注入27 mL 4 ℃快速攪拌著的肉湯培養(yǎng)基中，形成由瓊脂包裹細菌的流感嗜血桿菌瓊脂珠懸液。取100 μL細菌懸浮液倍比稀釋，接種于改良巧克力培養(yǎng)基，測得懸浮液包含細菌數(shù)為1×108/mL，取200 μL于皮試用1 mL注射器中備用。

1.2.2實驗分組Wistar大鼠到動物室后在新環(huán)境中適應3 d，普通敞式大鼠籠，中顆粒飼料喂養(yǎng)，飲用蒸餾水，稱體質(zhì)量后分為3組，每組40只。每時間點處理大鼠4只。每只大鼠均氣管內(nèi)置入一長約1 cm(靜脈留置針管)硅膠管?？瞻讓φ战M，大鼠插管組；感染組，大鼠氣管插管感染組；給藥組，大鼠氣管插管感染給藥組。

1.2.3動物的處理空白對照組：大鼠以45 mg/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉后,仰臥位固定，頸部、胸部脫毛，作頸部正中切口，約2～3 cm，分離頸前肌，暴露并固定氣管，在環(huán)甲軟骨處剪一V型切口，以靜脈留置針管(1 cm)替代氣管導管行氣管插管,并向大鼠氣管內(nèi)緩慢注入注入無菌瓊脂小珠100 μL，完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s,使瓊脂均勻分布于肺部。感染組：插管感染組將大鼠以45 m/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉后,仰臥位固定，頸部、胸部脫毛，消毒，鋪無菌洞巾，作頸部正中切口，暴露并固定氣管，在環(huán)甲軟骨處剪一V型切口，以靜脈留置針管(1 cm)替代氣管導管行氣管插管,并向大鼠氣管內(nèi)緩慢注入流感嗜血桿菌瓊脂小珠100 μL，完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s,使菌液均勻分布于肺部。給藥組：大鼠以45 m/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉后,以靜脈留置針管(1 cm)替代氣管導管行氣管插管,并向大鼠氣管內(nèi)緩慢注入流感嗜血桿菌瓊脂小珠100 μL，完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s,使菌液均勻分布于肺部。第1～3天，按52.5 mg/kg給予大鼠阿奇霉素溶液灌胃，連續(xù)3 d。

1.2.4標本采集(1)掃描電鏡標本制作[4]。將大鼠以3%戊巴比妥腹腔麻醉后,常規(guī)消毒，行腹主動脈放血處死小鼠，在無菌條件下開胸完整取出肺臟，沿氣管將留置導管推出氣管，滅菌生理鹽水沖洗3遍，將導管縱向剖開，剪成0.5 cm2小塊，戊二醛固定,掃描電鏡觀察。(2)氣管導管生物被膜的活菌計數(shù)[5]。將大鼠在無菌條件下開胸完整取出肺臟，沿氣管將氣管內(nèi)導管推出，超聲震蕩15 min，使生物被膜完全脫落，漩渦震蕩1 min，打勻菌落，再以滅菌生理鹽水做10倍系列稀釋，分別取各稀釋度標本10 μL接種于血瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，次日以最低可數(shù)的稀釋倍數(shù)計算菌落數(shù)，然后換算每1 cm導管中有多少個細菌集落形成單位(CFU)。每1 cm導管CFU數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

2結(jié)果

2.1掃描電鏡觀察大鼠氣管導管生物被膜生長情況接種細菌后第4天掃描電鏡低倍可見感染組導管壁上有大片膜樣物質(zhì)黏附，高倍可見菌體聚集，外被黏液樣物質(zhì)，并可見細長的菌體被覆其中；給藥組可見導管散點樣分布小片樣物質(zhì)，高倍鏡可見菌體聚集成團，密度稀疏。見圖1。

A：給藥組(×1 000)；B：感染組(×1 000)；C：給藥組(×5 000)；D：感染組(×5 000)。

圖1掃描電鏡觀察大鼠氣管導管生物被膜生長情況

2.2氣管導管菌落計數(shù)整個實驗過程空白對照組導管內(nèi)未培養(yǎng)檢出細菌。其他兩組大鼠菌落計數(shù)見圖1及表1，感染組菌落計數(shù)趨勢可見細菌數(shù)在接種第1天后有上升趨勢，但2周至1個月，細菌維持在1 000 CFU/cm2左右。給藥組細菌計數(shù)可見給藥后細菌數(shù)前第1周無明顯變化，但與感染組相比數(shù)值上有所降低，特別是在第4天開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，至1周時，相差較大，到1個月細菌數(shù)有所上升，維持在1×103/mL左右，與感染組相近。

表1　　阿奇霉素對氣管導管內(nèi)生物被膜

3討論

VAP是機械通氣過程中常見，同時又是導致病死率上升的重要原因之一，并在很大程度上增加了治療難度和醫(yī)療費用[6]。有研究顯示概械通氣患者出現(xiàn)氣管內(nèi)導管生物被膜的概率要比其他患者高得多[7-8]，因為機械通氣患者病情危重，大劑量抗菌藥物、激素的使用會導致機體系統(tǒng)免疫力下降，當氣管切開或氣管插管等人工氣道建立時，上氣道分泌物不僅易經(jīng)氣管導管進入下呼吸道導致VAP,而且易黏附在氣管內(nèi)導管，細菌一旦黏附在附著物上，在12 min內(nèi)，就會上調(diào)產(chǎn)生胞外多糖和黏蛋白基因的高表達，使細菌牢牢黏附在導管上，形成生物被膜[9]，當吸痰或氣流動力學原因，生物被膜內(nèi)的微菌落會脫落至下呼吸道，引起VAP。所以早期VAP致病菌中多以上氣道定植菌為主，其中包括流感嗜血桿菌。而隨著機械通氣時間延長，反復侵入性操作如吸痰、呼吸機管路污染等增加了感染率，使VAP致病菌發(fā)生改變。阿奇霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，有研究顯示可抑制導尿管銅綠假單胞菌生物被膜的形成[10]。本實驗通過掃描電鏡、菌落計數(shù)，觀察對氣管導管流感嗜血桿菌生物被膜的影響，結(jié)果顯示，感染組、給藥組在氣管插管感染后第1天導管上均有生物被膜形成，細菌數(shù)均在100 CFU左右，感染組細菌數(shù)逐漸上升，但在2周至1個月其間維持在1×103/mL左右；給藥組在1周時菌落數(shù)明顯減低，在1個月時與感染組比無明顯差異。在對機械通氣患者氣管導管內(nèi)生物被膜形成情況的研究表明機械通氣后第2天導管內(nèi)壁就可見點片狀生物被膜形成[11]，在感染組1周后細菌數(shù)持續(xù)在1×103～1×104/mL，分析1周時導管內(nèi)生物被膜已進入成熟期，膜內(nèi)細菌呈穩(wěn)定狀態(tài)，故菌落數(shù)差別不大。而給藥組，菌落計數(shù)3 d至1周時有時下降，與阿奇霉素對流感嗜血桿菌生物被膜內(nèi)活菌的抑制有關，2周后至1個月時細菌數(shù)與感染組相比較無明顯差異，分析與1周后隨阿奇霉素的代謝，在體內(nèi)水平降低，對生物被膜內(nèi)細菌的抑制作用減小，使生物被膜恢復乃至趨于成熟所致。給藥組導管生物被膜內(nèi)細菌數(shù)在2周內(nèi)均比感染組低(P<0.05)，提示阿奇霉素對生物被膜的作用在早期較為明顯。

氣管內(nèi)導管生物被膜是導致VAP難治性和高病死率的原因之一，特別是對危重病等患有慢性基礎性

疾病的患者，及時控制VAP對疾病的預后和轉(zhuǎn)歸有重要意義。本實驗通過對大鼠氣管插管，給予流感嗜血桿菌氣道滴入，觀察氣管內(nèi)導管生物被膜的形成情況，并通過阿奇霉素灌胃治療氣管插管流感嗜血桿菌感染大鼠，觀察阿奇霉素對氣管內(nèi)導管生物被膜內(nèi)流感嗜血桿菌的影響。提示流感嗜血桿菌可在氣道導管內(nèi)形成生物被膜，阿奇霉素對流感嗜血桿菌氣道內(nèi)導管早期生物被膜有一定抑制作用，為臨床治療VAP提供有力依據(jù)。

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Effects of azithromycin on the formation of nontypeable haemophilus influenzae biofilm on endotracheal tubes

WangYing1,WangDong2,GuoZhi1,ShiShumei1△

(1.DepartmentofPneumology,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan,Shandong250033,China;2.DepartmentofPneumology,GeneralHospitalofAirForce,Beijing100142,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the formation of biofilms on endotracheal tubes,and to determine the effect of azithromycin on Haemophilus influenzae in biofilms.MethodsOne hundred and twenty Wistar rats were intubated with a silicone tube,80 of them(40 rats were model group and 40 were medicine group) were infected by bacteria to establish the animal models of endotracheal tube infections the others were ues as control gruop.Formation of biofilms was detected by scanning electron microscope.Viable cells counting was carried out to evaluate the effect of azithromycin orally on biofilms on endotracheal tubes.ResultsUneven biofilms were formed on the surface of endotracheal tubes,and slim bodied of bacteria enclosed by a lot of extracellular matrix.Viable cells counting was reduced in medicine group compared with model group.ConclusionHaemophilus influenzae can form biofilms on endotracheal tubes.Azithromycin can exert inhibitory effect on haemophilus influenzae biofilms formed on endotracheal tubes.

[Key words]intubation,ilntratracheal;biofilms;azithromycin

作者簡介：王瑛(1971-)，博士，副主任醫(yī)師，主要從事臨床感染研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：shumei_shi131@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.014

[中圖分類號]R96

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)01-0040-02

(收稿日期：2015-06-10修回日期：2015-09-28)