吉林地區(qū)人群HPA-1～6，15系統(tǒng)基因多態(tài)性分析

楊　帆，韓　瑜，焦立新△，魯　威，金成日，陳　琳△，牛　潼，李俊瑋

(1.吉林省血液中心，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

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△共同通訊作者

吉林地區(qū)人群HPA-1～6，15系統(tǒng)基因多態(tài)性分析

楊帆1，韓瑜1，焦立新1△，魯威1，金成日1，陳琳1△，牛潼2，李俊瑋2

(1.吉林省血液中心，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的調(diào)查吉林地區(qū)人群人類血小板抗原(HPA)基因多態(tài)性。方法采用PCR-SSP方法對419名血小板捐獻志愿者進行血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型，通過統(tǒng)計方法對分型結(jié)果進行基因多態(tài)性分析。結(jié)果血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因頻率分別為HPA-1aa 0.984，HPA-1ab 0.016，HPA-2aa 0.872，HPA-2ab 0.123，HPA-2bb 0.004，HPA-3aa 0.350，HPA-3ab 0.483,HPA-3bb 0.166，HPA-4aa 0.992，HPA-4ab 0.008，HPA-5aa 0.996，HPA-5ab 0.004，HPA-6aa 0.984，HPA-6ab 0.016，HPA-15aa 0.318，HPA-15ab 0.492，HPA-15bb 0.190。結(jié)論吉林地區(qū)人群HPA-1～6和HPA-15系統(tǒng)基因多態(tài)性具有本地區(qū)特點，HPA-3和HPA-15系統(tǒng)不配合率最高，HPA-2系統(tǒng)次之。

關(guān)鍵詞：人類血小板抗原；基因型;PCR-SSP

(ChinJLabDiagn,2016,20:0750)

人類血小板抗原(human platelet antigen，HPA)均存在于血小板膜糖蛋白上(GP)，由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)血小板獨特的遺傳多態(tài)性，血小板多態(tài)性是由單一核苷酸改變或一對堿基置換引起個別氨基酸的不同形成的，采用基因定型方法可以對HPA抗原進行鑒定。至今被國際輸血協(xié)會組織確認的血小板特異性抗原已有28個，除1個抗原(Moua抗原)尚未達到命名要求，有12個抗原被列入6個遺傳系統(tǒng)，分別命名HPA-1～5 和HPA-15，還有15個抗原尚未達到系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)(http://www.ebi.ac.uk/ipd/hpa/)[2]。這幾個系統(tǒng)與血小板輸注無效、輸血后紫癜、新生兒同種免疫血小板減少性紫癜等疾病有關(guān)。因此，我們對本血液中心機采血小板固定獻血者的HPA-1～6、15系統(tǒng)基因多態(tài)性做了研究，并對這419名漢族人群做HPA-1～6、15基因型及基因頻率統(tǒng)計分析，報道如下。

1材料與方法

1.1研究對象為本血液中心固定獻血者419名，定期捐獻機采血小板，籍貫分布在吉林省內(nèi)各個地區(qū)，均為漢族，男性284名、女性135名，年齡18-55 歲(平均35歲)。獻血者捐獻血小板時留取全血標(biāo)本3-5 ml/(人)份(EDTA抗凝)，備用。

1.2試劑與儀器人類血小板抗原HPA-1～6，15基因分型試劑盒(201403004，天津秀鵬公司)；PCR 儀(C1000 Touch型，美國Bio-Rad公司)；DNA提取試劑盒(Lot N2905，德國 QIAGEN公司)；凝膠成像分析儀(UVP，JY04S-3C，北京六一儀器)；超微量微孔板分光光度計(Epoch，美國 Bio-Tek 公司)。

1.3DNA提取從EDTA抗凝試管中取標(biāo)本全血500 μl/份，用試劑盒提取DNA，按說明書操作，DNA濃度(50-100)ng/μl、純度1.6-1.8。

1.4HPA1-6,15基因的PCR擴增按照試劑盒說明書操作：配制 Buffer-酶-樣本混合液，分別向每個引物孔各加入10 μl，上PCR擴增儀擴增，首先96℃變性3 min，變性、退火、延伸，循環(huán)35次，最后72℃延伸3 min至4℃；取擴增產(chǎn)物10 μl，在2% 瓊脂糖凝膠中(含溴化乙錠1 μg/μl)電泳15 min，電泳緩沖液為0.5%TBE溶液，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果并拍照。

1.5統(tǒng)計分析通過統(tǒng)計方法對分型結(jié)果進行基因多態(tài)性分析。計算公式如下：等位基因頻率：f(a)=〔2×純合子數(shù)+雜合子數(shù)〕/〔2×總的個體數(shù)〕，f(b)=1- f(a)，表現(xiàn)型頻率 ：f(aa)=〔f(a)〕2,f(ab) =2 f(a) f(b),f(bb) =〔f(b)〕2；不配合率=2ab(1-ab)；a、b分別代表a和 b基因頻率。

2結(jié)果

在HPA-1～6和HPA-15系統(tǒng)基因頻率分布具有多態(tài)性，其中HPA-3和HPA-15系統(tǒng)雜合度最高，HPA-2系統(tǒng)雜合度較高。值得注意的是HPA-2基因多態(tài)性分布具有吉林地區(qū)特點(見表1)。

表1　血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因頻率

3討論

輸血、妊娠或器官移植后有些患者可產(chǎn)生抗HLA或血小板抗原的抗體，這些抗體可縮短血小板生存時間，導(dǎo)致患者在接受隨機獻血者的血小板時發(fā)生輸注無效[1]。血小板輸注無效主要由同種異體免疫因素造成，由于反復(fù)輸注血小板，血小板特異性抗原的多態(tài)性使患者體內(nèi)發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生血小板同種抗體。血小板特異性抗原(HPA)不合可導(dǎo)致輸血后紫癜(PTP)、血小板輸注無效(PTR)、新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜(NAITP)等。根據(jù)近幾年研究以及以往的研究數(shù)據(jù)表明[3]血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型存在明顯的多態(tài)性并具有普遍臨床意義，本研究采用PCR-SSP方法對419例吉林地區(qū)人群做血小板抗原HPA-1～6，15系統(tǒng)基因分型并進行基因多態(tài)性的分析，依據(jù)結(jié)果得出本地區(qū)HPA基因多態(tài)性及分布特點，HPA-3、HPA-15系統(tǒng)雜合子ab頻率高于aa純合子，HPA-l、HPA-4、HPA-5、HPA-6系統(tǒng)均則以aa純合子居多，經(jīng)統(tǒng)計分析HPA-15系統(tǒng)不配合率最高，HPA-3系統(tǒng)次之。其中值得注意的是HPA-2系統(tǒng)不配合率僅低于前兩者，結(jié)果表明吉林地區(qū)(2a基因型頻率為0.934，2b基因型頻率為0.066，不配合率為0.116)均高出廣東地區(qū)[4](2a基因型頻率為0.9，2b基因型頻率為0.05，不配合率為0.0905)，具有吉林地區(qū)特點。

在臨床血小板輸注過程中，如果血小板同種抗原不相匹配，可導(dǎo)致受血者機體產(chǎn)生血小板同種抗體，HPA抗原不配合的比例越高，產(chǎn)生抗體的機會就會越多。血小板輸注無效時，應(yīng)尤其注意HPA-3和HPA-15配合性輸注，患者如為aa或bb純合應(yīng)盡量選擇同型供者。另外，此次實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下基因型頻率較低：HPA-1ab 0.016、HPA-2bb 0.004、HPA-4ab 0.008、HPA-5ab 0.004、HPA-6ab 0.016，為HPA低頻率基因型的血小板輸注無效患者提供了保障，可以根據(jù)患者病情選擇同型(或配合型)單采血小板，避免輸注后發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。

此次實驗中的捐獻者均為固定機采血小板捐獻者，并且均已加入血小板資料庫，本研究為建立吉林地區(qū)HPA基因多態(tài)性資料數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)，進一步為HPA同種免疫導(dǎo)致血小板輸注無效患者提供HPA基因型相合的血小板，最終使血小板庫為臨床能夠更安全、更有效地輸注血小板提供保障。

參考文獻：

[1]張欽輝.臨床輸血學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2000：12.

[2]Kim HO，J in Y，Kickler TS，et al．Gene frequencies of the five major humanplatelet antigens in African American，white，and Korean populations[J]．Transfusion,1995,35：863.

[3]于江虹,楊帆,焦立新,等.長春地區(qū)無償獻血者HPA1-6,15基因分型及頻率調(diào)查[J].中國實驗診斷學(xué)，2011,15(4):680.

[4]陳莉.廣東地區(qū)漢族人群血小板HPA基因庫的建立和初步應(yīng)用的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2009：1-41．

HPA-1～6,15 system gene polymorphism analysis in jilin

YANGFan,HANYu,JIAOLi-xin,etal.

(ChangchunBloodstation,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveSurvey the crowd in jilin area human platelet antigen (HPA) gene polymorphism.MethodsThe PCR-SSP method in 419 platelet donors for genotyping antigen HPA_1-6,15 system,the statistical method to classification results for gene polymorphism analysis.ResultsThe frequency of HPA pherotype is HPA-1aa 0.984,HPA-1ab 0.016,HPA-2aa 0.872,HPA-2ab 0.123,HPA-2bb 0.004,HPA-3aa 0.350,HPA-3ab 0.483,HPA-3bb 0.166,HPA-4aa 0.992,HPA-4ab 0.008,HPA-5aa 0.996,HPA-5ab 0.004,HPA-6aa 0.984,HPA-6ab 0.016,HPA-15aa 0.318,HPA-15ab 0.492,HPA-15bb 0.190.ConclusionHPA-1～6,15 system are polymorphic gene frequency distribution,the HPA-3 and 15 system,high heterozygosity,it is worth noting that the HPA -2 gene.

Key words:HPA;genotype;PCR-SSP

基金項目：吉林省衛(wèi)生青年科研課題(2013Q016)、吉林省自然科學(xué)基金項目(201015186)、吉林省衛(wèi)生自籌經(jīng)費課題(2013ZC010)

文章編號：1007-4287(2016)05-0750-02

中圖分類號：R558

文獻標(biāo)識碼：A

(收稿日期：2015-10-07)