GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的影響

焦婷婷，陳金嬋，張燁敏，惠　寧

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 婦產(chǎn)科，上海200433)

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*通訊作者

GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的影響

焦婷婷，陳金嬋，張燁敏，惠寧*

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 婦產(chǎn)科，上海200433)

摘要：目的探討促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-α)對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法原代體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，加入不同濃度的GnRH-α，MTT法檢測(cè)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的變化情況，Transwell小室法檢測(cè)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移的變化情況。結(jié)果與空白對(duì)照組相比較，GnRH-α處理細(xì)胞后，人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在10-7g/ml濃度組和10-6g/ml濃度組增殖減少(*P<0.05，**P<0.01 vs 空白對(duì)照組)，在10-8g/ml、10-7g/ml和10-6g/ml濃度組細(xì)胞遷移均增加(*P<0.05，**P<0.01 vs 空白對(duì)照組)。結(jié)論GnRH-α可以抑制人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移，從而影響胚胎的著床過程。

關(guān)鍵詞：GnRH-α；人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞；增殖；遷移；胚胎著床

(ChinJLabDiagn,2016,20:0722)

胚胎著床是胚胎與母體相互作用的復(fù)雜過程。當(dāng)胚胎著床時(shí)，開始母嬰對(duì)話，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞相互作用。人的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞具有增殖和遷移的能力，它們對(duì)胚胎植入時(shí)子宮內(nèi)膜容受性的起著關(guān)鍵作用。目前對(duì)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎著床的作用研究主要集中在兩方面，一是在超聲下觀察內(nèi)膜的運(yùn)動(dòng)情況并進(jìn)行分型研究；二是從細(xì)胞層面研究子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和遷移能力。目前的研究認(rèn)為子宮內(nèi)膜的增殖和遷移能力是影響IVF-ET術(shù)中移植術(shù)的重要因素，它可以有效的預(yù)測(cè)妊娠的結(jié)局[1]。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-α)是將天然GnRH十肽結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸進(jìn)行置換或去除，形成人工合成的化合物，提高與受體結(jié)合的親和力，從而作用于下丘腦-垂體-卵巢性腺軸，影響激素的合成和分泌。目前GnRH-α制劑已廣泛應(yīng)用于婦科子宮內(nèi)膜異位癥患者的治療以及輔助生殖技術(shù)的控制性超排卵當(dāng)中。但是關(guān)于GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移能力的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，探討其在胚胎著床中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞(經(jīng)長(zhǎng)海醫(yī)院和中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在病人知情同意的前提下，子宮內(nèi)膜組織獲取自2012年12月1日至2013年10月31日在長(zhǎng)海醫(yī)院生殖中心因不孕癥行宮腔鏡檢查的患者，共14例。年齡23-35歲，平均(29.63±6.17)歲，需術(shù)后病理證實(shí)為增殖期子宮內(nèi)膜)，DNA酶Ⅰ型購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Ⅱ型膠原酶購(gòu)于WASHINGTON公司，胎牛血清、 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibcol公司，MTT試劑盒(購(gòu)于北京碧云天生物公司)，Transwell 小室購(gòu)于美國(guó)corning公司，曲普瑞林(Triptorelin)購(gòu)于德國(guó)輝凌制藥公司。

1.2人體外子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代取宮腔鏡下刮取的少量人子宮內(nèi)膜組織，反復(fù)沖洗3次，標(biāo)本剪碎成 1 mm3的小塊組織。將內(nèi)膜置于F12 DMEM培養(yǎng)液配置的消化液中(DNA酶，終濃度為0.5 mg/ml；Ⅱ型膠原酶，終濃度為1.5 mg/ml；BSA，終濃度為1 mg/ml)，37℃，120-130轉(zhuǎn)/分，搖動(dòng)水浴消化40-60 min。收集上層液體，用胎牛血清終止消化，600 rpm×3 min離心沉淀未消化完全的組織。棄沉淀，收集上清液，以1 100 rpm×10 min離心沉淀細(xì)胞。棄上清液，重懸細(xì)胞沉淀，經(jīng)400目(孔徑38 μm)不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過濾(在培養(yǎng)皿中進(jìn)行) 。網(wǎng)上細(xì)胞團(tuán)主要為腺上皮細(xì)胞。將濾液(主要為基質(zhì)細(xì)胞)接種25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于37℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁30-40 min后，全量更換培養(yǎng)液以去除不貼壁的腺上皮細(xì)胞和血細(xì)胞(基質(zhì)細(xì)胞在40 min內(nèi)貼壁，腺上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間大于30 min)。48 h后全量更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到瓶底的80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3MTT法檢測(cè)GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P1代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞用胰酶消化傳代，以2000/孔的密度接種于96 孔板中培養(yǎng)，加藥48 h后終止反應(yīng)，每孔入10 μl MMT，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀450/650 nm測(cè)定每孔OD值，每孔設(shè)5個(gè)平行副孔。

1.4Transwell小室法檢測(cè)GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響，P1代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，加藥處理，種板前血清饑餓24小時(shí)。用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，以含 1%胎牛血清的 F12DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5× 105個(gè)/ml。迅速加入200 μl 細(xì)胞懸液于 transwell 上室，于下室加入1 ml含 10%胎牛血清的F12DMEM培養(yǎng)基以及各組藥物。將 24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃孵箱中培養(yǎng) 48 h，取出小室，用 PBS 液輕洗小室濾膜兩側(cè)，PBS 浸濕的無(wú)菌棉簽輕拭去濾膜上室面的細(xì)胞。將transwell小室微孔濾膜用固定液固定10 min ，DEPI染色后，在熒光顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，取上、下、左、右、中心選 5個(gè)視野，計(jì)數(shù)濾膜下室面的細(xì)胞數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間差別用單因素方差分析 (ANOVA) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05和P<0.01均表示差異顯著。

2結(jié)果

2.1體外原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞

在顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，呈梭形排列,胞質(zhì)薄而透明,核橢圓,呈分散形生長(zhǎng)。如圖 1所示，A圖為普通光學(xué)顯微鏡 100×放大。B圖為普通光學(xué)顯微鏡 200×放大。

2.2不同濃度GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

對(duì)P1代的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞加入不同濃度的Triptorelin進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，10-8g/ml濃度組，10-7g/ml濃度,10-6g/ml濃度組；MTT法檢測(cè)GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示基質(zhì)細(xì)胞的增殖隨著Triptorelin濃度的升高而降低，其中在10-7g/ml濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05 vs 空白對(duì)照組)，在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對(duì)照組)。如圖2所示。

圖1原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞圖2不同濃度GnRH-α對(duì)人子宮圖3不同濃度GnRH-α對(duì)人子宮

內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

2.3不同濃度GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

對(duì)P1代的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞加入不同濃度的Triptorelin處理，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，10-8g/ml濃度組，10-7g/ml濃度,10-6g/ml濃度組；Transwell法檢測(cè)GnRH-α對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示基質(zhì)細(xì)胞的遷移隨著GnRH-α濃度的升高而增加，在10-8g/ml濃度組(*P<0.05 vs 空白對(duì)照組)和10-7g/ml濃度組(*P<0.05 vs 空白對(duì)照組)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在10-6g/ml濃度組差異顯著(**P<0.01 vs 空白對(duì)照組)。如圖3、4所示。

A：空白對(duì)照組；B：10-8g/ml濃度組；C：10-7g/ml濃度；D:10-6g/ml濃度組

圖4熒光顯微鏡下細(xì)胞遷移情況圖

3討論

胚胎植入是指從胚胎著床到胎盤形成的復(fù)雜的一個(gè)生理過程。在這一過程中，胚胎發(fā)育到胚泡階段開始著床，子宮內(nèi)膜增殖分化到容受性狀態(tài)，胚胎和母體間相互協(xié)作，共同完成。多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和激素等參與該過程。胚胎植入失敗是臨床上早期流產(chǎn)和IVF-ET術(shù)中胚胎移植失敗的關(guān)鍵因素。

目前對(duì)于胚胎植入過程分子機(jī)制的研究尚不是十分清楚。Paria等人認(rèn)為胚胎在著床時(shí)向母體子宮內(nèi)膜發(fā)出的第一個(gè)信號(hào)分子可能是運(yùn)動(dòng)信號(hào)，而非化學(xué)信號(hào)。隨后子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞將這一運(yùn)動(dòng)信號(hào)分子轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號(hào)分子[2-4]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞一方面開始增殖和遷移，與絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的定位形成互動(dòng)，另一方面分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素等促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲[5-10]。

人的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖和遷移能力。在女性的月經(jīng)周期中，月經(jīng)過后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖，在內(nèi)膜增殖期時(shí)形成新的內(nèi)膜層。月經(jīng)期，基質(zhì)細(xì)胞在多種因素的作用下遷移到子宮腔以外，并種植形成子宮內(nèi)膜異位癥[11-14]，在妊娠中，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲的研究也受到了重視。Brosens等人認(rèn)為妊娠后的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力較前有所提高[14]。子宮內(nèi)膜異位癥患者易形成不孕，可能與月經(jīng)期基質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能不同所致[11]。在研究絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，F(xiàn)erreira等人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和人絨毛促性腺激素(HCG)可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移[15,16]。 總之子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移能力對(duì)胚胎植入的過程具有非常重要的意義。

GnRH-α在注射初始時(shí)可以使垂體的GnRH數(shù)量增加，12小時(shí)內(nèi)發(fā)生“flare-up”效應(yīng)，持續(xù)作用4-5天后，垂體對(duì)其產(chǎn)生的刺激不再反應(yīng)，呈現(xiàn)去敏感引起相反作用，用藥21天后，體內(nèi)激素水平可以達(dá)到絕經(jīng)期水平。子宮內(nèi)膜細(xì)胞，內(nèi)膜萎縮,內(nèi)異癥病灶縮小。由GnRH-α的這一特殊作用，目前已廣泛用于臨床子宮內(nèi)膜異位癥的治療和輔助生殖技術(shù)中控制性超排卵長(zhǎng)方案的應(yīng)用。Meresaman發(fā)現(xiàn)GnRH-α可以抑制子宮內(nèi)膜異位癥患者體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[17]。Borroni等發(fā)現(xiàn)GnRH-α可在體外對(duì)內(nèi)異癥異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖起直接抑制作用[18]。這種作用可能是通過下調(diào)VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，并且這一作用可以被促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-A)逆轉(zhuǎn)。在GnRH-α與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)中的作用的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)外并不多見，Arver認(rèn)為GnRH-α可能通過激活cAMP通道作用促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)互動(dòng)[19,20]。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示GnRH-α可以在體外直接抑制人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的遷移。說(shuō)明GnRH-α不僅可以通過影響性激素的改變進(jìn)而作用于子宮內(nèi)膜，還可能直接影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移能力。這一結(jié)果為GnRH-α用于治療子宮內(nèi)膜異位癥引起的不孕癥提供了的新理論支持，也為胚胎著床的研究提供了新的研究方向，從而進(jìn)一步為IVF-ET術(shù)中反復(fù)胚胎移植失敗的病人提供了新的治療思路。但是GnRH-α是通過怎樣的機(jī)制作用于人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移仍然需要我們進(jìn)一步的研究。

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Effects of GnRH-α on proliferation and migration of human endometrial stromal cells

JIAOTing-ting,CHENJin-chan,ZHANGye-min,etal.

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of GnRH-α(gonadotropin-releasing hormone agonist) on proliferation and migration of human endometrial stromal cells.Methodsculture the primary human endometrial stromal cells (ESCs),We added different concentrations of GnRH-αinto ESCs.The proliferation of ESCs was examined by MTT assay,and the transwell chamber assay was used to detect the migration of ESCs.ResultsCompared with the blank control group,GnRH-α significantly reduced the proliferation of human endometrial stromal cells,and increased cell migration(*P<0.05，**P<0.01 vs blank).ConclusionGnRH-α can inhibit the proliferation of human endometrial stromal cells and promote the migration of human endometrial stromal cells,which may affect the process of embryo implantation.

Key words:GnRH-α；human endometrial stromal cells；proliferation；migration；embryo implantation

基金項(xiàng)目：上海市科委基金項(xiàng)目(09411966600)

文章編號(hào)：1007-4287(2016)05-0722-04

中圖分類號(hào)：R711.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：惠寧，女，碩士，主任醫(yī)師。研究方向：婦科腫瘤與生殖醫(yī)學(xué)。

(收稿日期：2015-09-15)