大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片的制作技巧改進(jìn)

董學(xué)美，郭文輝，羅維蕓，許世清，蔡寒青*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，長(zhǎng)春130041；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京100029)

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*通訊作者

大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片的制作技巧改進(jìn)

董學(xué)美1，郭文輝1，羅維蕓1，許世清2，蔡寒青1*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，長(zhǎng)春130041；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京100029)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見(jiàn)而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而增加，是導(dǎo)致糖尿病患者視力下降、甚至失明的主要原因[1]，其微血管結(jié)構(gòu)的改變，臨床大多是通過(guò)檢眼鏡或眼底熒光素血管造影觀察得到[2]。為研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，近年來(lái)通過(guò)制備糖尿病大鼠模型及其視網(wǎng)膜微血管消化鋪片，來(lái)觀察糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變的形態(tài)學(xué)[3]及進(jìn)行糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制的研究越來(lái)越多[4]，但由于制備視網(wǎng)膜鋪片標(biāo)本在技術(shù)操作上存在一定難度，往往難以獲得較大面積的高質(zhì)量視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片，故影響到實(shí)驗(yàn)室觀察和計(jì)量結(jié)果，限制了該實(shí)驗(yàn)方法的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)我們?cè)谥苽浯笫笠暰W(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片過(guò)程中摸索出一些技巧，介紹如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器pH 值為7.4、0.01 mol/L 的PBS液(美國(guó)Amresco公司)；4%多聚甲醛液(美國(guó)Sigma公司)；3%胰蛋白酶液(美國(guó)Amresco公司)；小牛血清(美國(guó)Gibco公司)；Schiff試劑(國(guó)產(chǎn)，碧云天公司)；10%偏重亞硫酸鈉液(美國(guó)Sigma公司)；Mayer’s蘇木素(國(guó)產(chǎn)，碧云天公司)；37℃溫水浴鍋(國(guó)產(chǎn)EYELA公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7-8周齡的Wistar大鼠10只，雌雄各半，體重250-300 g，均自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買[合格證號(hào)：SCXK(京)2006-0009]，并飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。

1.2方法

1.2.1視網(wǎng)膜的消化分離以1%的戊巴比妥一次性腹腔注射麻醉后，經(jīng)靜脈放血處死Wistar大鼠，以眼科剪立即摘取眼球，浸泡于4%的多聚甲醛溶液中，置于室溫下固定達(dá)72 h。然后以濃度0.01 mol/L，pH 值為7.4的PBS緩沖液浸泡過(guò)夜。次日取固定好的眼球，在盛有PBS緩沖液的干凈玻璃平皿中，從角膜緣后0.5 mm處剪開(kāi)，去除眼前節(jié)和玻璃體，從剩下的眼杯內(nèi)壁仔細(xì)剝離出視網(wǎng)膜，轉(zhuǎn)浸入5 ml含有3%胰蛋白酶的溶液中，置于37℃的恒溫水浴中震蕩、消化2 h。此時(shí)加入2 ml冷的10%小牛血清并置于冰上冷卻以中止消化，將其轉(zhuǎn)入干凈平皿，用自制的小圓頭玻璃棒輕輕撥動(dòng)，使視網(wǎng)膜舒展地平鋪并漂浮在水中；再用玻棒從其下方托起，移入另一裝有適量蒸餾水的干凈平皿中。在蒸餾水中反復(fù)輕輕撥動(dòng)震蕩視網(wǎng)膜，直至完全清除神經(jīng)及其他纖維成分。

1.2.2視網(wǎng)膜的鋪片在一潔凈的載玻片上先滴一滴蒸餾水，再用玻璃棒挑起已消化干凈的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，迅速轉(zhuǎn)移至載玻片上的水滴中，不斷輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃棒，使視網(wǎng)膜血管網(wǎng)自然伸展開(kāi)并漂浮在水滴上，注意避免重疊，然后置于平臺(tái)上待蒸餾水在室溫下自然揮發(fā)干燥。

1.2.3PAS染色將完全干燥后伸展鋪于載玻片上的視網(wǎng)膜血管鋪片再次用蒸餾水輕洗，以滴管滴一滴1%的高碘酸，室溫下氧化5 min，然后反復(fù)用蒸餾水清洗5 min，再以Schiff試劑染色15 min。在流水下清洗10 min，再用適量Mayer’s蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核3 min，最后用流水清洗。脫水封片后即可在光鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變，如需計(jì)量，即可在高倍鏡下記數(shù)1000個(gè)毛細(xì)血管細(xì)胞，并計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞/周細(xì)胞(E/P)比值。

2結(jié)果

制備良好的視網(wǎng)膜鋪片，當(dāng)在低倍鏡下觀察時(shí)(圖1a)，可見(jiàn)整張視網(wǎng)膜血管網(wǎng)大而清潔，無(wú)折疊、破損或卷曲成團(tuán)。各級(jí)小血管分布清晰，毛細(xì)血管排列分布自然順暢，結(jié)構(gòu)完整，各毛細(xì)血管之間無(wú)神經(jīng)及其他纖維成分的殘留。當(dāng)在高倍鏡下觀察時(shí)(圖1b)，可見(jiàn)毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)完整，分布無(wú)扭曲；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核呈長(zhǎng)橢圓形，細(xì)胞染色較淡。毛細(xì)血管周細(xì)胞的細(xì)胞核則呈圓形，染色相對(duì)較深。

圖1　大鼠視網(wǎng)膜鋪片(PAS染色，1a ×20；1b ×100 )

3討論

1960年Kuwabara和Cogan[5]發(fā)明了視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)，1963年Ashton[6]又對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)。參照一些文獻(xiàn)的介紹[3,5-7]，我們摸索了一些制做高質(zhì)量大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管網(wǎng)鋪片的經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)總結(jié)如下：

3.1視網(wǎng)膜的消化分離多聚甲醛對(duì)組織穿透性強(qiáng)，能保持組織抗原性，且引起組織的收縮性小，較適合于光鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)的研究。我們?cè)谔幩来笫笕⊙矍蚝?，?jīng)多次摸索的組織固定條件為4%多聚甲醛室溫下固定72 h后再分離視網(wǎng)膜的效果最佳。為充分去除視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)組織又不過(guò)度損害微血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)，我們采用將視網(wǎng)膜浸于含3%胰酶的溶液于37℃水浴中不斷震蕩進(jìn)行消化共2 h而非單純靜置消化，使消化分離過(guò)程更加充分；當(dāng)消化結(jié)束時(shí)則迅速加入冷的小牛血清并迅速轉(zhuǎn)入冰浴中冷卻中止消化，防止因消化過(guò)度而損傷毛細(xì)血管網(wǎng)的完整性；之后可以通過(guò)反復(fù)在蒸餾水中機(jī)械漂洗經(jīng)胰酶消化過(guò)的視網(wǎng)膜，幫助充分去除殘存的神經(jīng)組織和基質(zhì)成分。

3.2鋪片時(shí)需注意的問(wèn)題實(shí)驗(yàn)操作中動(dòng)作應(yīng)輕柔、迅速、準(zhǔn)確，并事先做好相應(yīng)的準(zhǔn)備：如從平皿蒸餾水中托出消化好的血管網(wǎng)后，要及時(shí)、快速地將其轉(zhuǎn)移浸入載玻片的蒸餾水水滴中，注意應(yīng)避免將其在干燥的空氣中晾置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使視網(wǎng)膜血管網(wǎng)風(fēng)干而粘附于玻棒上造成破壞；另外，移動(dòng)視網(wǎng)膜前必須在平皿中順一個(gè)方向輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)玻棒，使視網(wǎng)膜血管網(wǎng)能充分展開(kāi)漂浮于水中再移動(dòng)其轉(zhuǎn)入玻片；轉(zhuǎn)入玻片的水滴后應(yīng)再次輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)玻棒將其再次自然展開(kāi)鋪在小水滴上，避免干燥后出現(xiàn)折疊的現(xiàn)象。

3.3制備良好的操作工具視網(wǎng)膜經(jīng)胰酶消化后，神經(jīng)及纖維組織清除干凈，使之變得十分菲薄稀疏，暴力操作極易造成其破損或粘連，因此需要有合適的工具進(jìn)行所有操作。我們?cè)?jīng)先后試用過(guò)如眼科鑷、自制燒彎的玻璃吸管等工具，均易造成了血管網(wǎng)的破損和粘連，制作效果不盡人意。最終參照項(xiàng)曉人等[7]的方法，自行制備了小圓頭玻璃棒用于剝離和轉(zhuǎn)移大鼠視網(wǎng)膜，大小適合的玻璃棒光滑的圓面不會(huì)造成粘連和血管網(wǎng)的破損，因此大大提高了視網(wǎng)膜鋪片的成功率及質(zhì)量。

總之，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)摸索和技術(shù)改進(jìn)，我實(shí)驗(yàn)室目前能夠成功制備高質(zhì)量的大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片，為進(jìn)行糖尿病微血管病變的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Frank RN.Diabetic Retinopathy[J].New England Journal of Medicine,2004,35(1):48.

[2]Gerald Liew,Jie Jin Wang,Paul Mitchell,et al.Retinal Vascular Imaging:A New Tool in Microvascular Disease Research[J].Circ Cardiovasc Imaging，2008，1;156.

[3]潘琳，周水平，郭艷茹，等.糖尿病視網(wǎng)膜微血管形態(tài)學(xué)改變的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華眼科雜志，2004，40(6):416.

[4]許世清，姜永瑋，王慧，等.糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表型和功能改變[J].中華糖尿病雜志，2010，2(5):262.

[5]Kuwabara T,Cogan DG.Studies of retinal vescular patterns.I.Normal architecture[J].Arch Ophthalmol，1960，64:904.

[6]Ashton N.Studies of the retinal capillaries in relation to diabetic and other retinopathies[J].Brit J Ophthal，1963，47:521.

[7]項(xiàng)曉人，王堅(jiān)，朱荃.視網(wǎng)膜毛細(xì)血管鋪片制作技巧.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2002，18(5)：564.

基金項(xiàng)目:吉林省科技廳基金項(xiàng)目(編號(hào)：201215054)

文章編號(hào)：1007-4287(2016)05-0710-02

作者簡(jiǎn)介：董學(xué)美(1990-)，在讀碩士研究生；蔡寒青(1972-)，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及內(nèi)分泌代謝疾病的診治。

(收稿日期：2015-09-17)