3.5mg/L水楊酸誘導(dǎo)斜生柵藻積累蝦青素的分子機(jī)理

凌善鋒+蔡福歡+劉彥文+朱勇+韓梁+程淼

摘要：在自然條件下，向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）培養(yǎng)液中加入3.5 mg/L的水楊酸溶液，進(jìn)行脅迫培養(yǎng)以誘導(dǎo)藻類(lèi)細(xì)胞內(nèi)蝦青素的合成與積累。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔3 d對(duì)藻液取樣制片，然后用顯微鏡觀察其生長(zhǎng)狀況及細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)3.5 mg/L水楊酸誘導(dǎo)的藻的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，該水楊酸溶液對(duì)于斜生柵藻細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種逆境脅迫因子，藻細(xì)胞內(nèi)通過(guò)積累高達(dá)1.123 mg/g的蝦青素來(lái)形成一種自我保護(hù)機(jī)制。八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和β-胡蘿卜素加氧酶（crtO）基因表達(dá)水平上調(diào)是藻細(xì)胞合成蝦青素的主要調(diào)控機(jī)制。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，藻細(xì)胞生物量呈時(shí)間依賴性增加（除15 d外），最高達(dá)2.08×106個(gè)/mL。

關(guān)鍵詞：水楊酸；斜生柵藻；形態(tài)；生物量；蝦青素；分子機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào)： S917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0287-04

蝦青素是類(lèi)胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于酮式類(lèi)胡蘿卜素，具有增強(qiáng)免疫功能等生理作用，是一種極具應(yīng)用潛力的次生代謝物質(zhì)，在食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前蝦青素主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的色素添加劑，售價(jià)高達(dá)1 200萬(wàn)元/t，估計(jì)全球每年需求量超過(guò)20億美元。天然蝦青素的主要生產(chǎn)來(lái)源是雨生紅球藻提取以及從紅法夫酵母菌發(fā)酵液中提取，但這些蝦青素的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是一種廣泛分布于溫暖地區(qū)的池塘、溝渠及河流中的淡水單細(xì)胞綠藻，其生命力強(qiáng)、繁殖快，對(duì)環(huán)境條件變化反應(yīng)敏感，是培養(yǎng)蝦青素的另一種理想來(lái)源[2]。

藻體內(nèi)蝦青素的生物合成過(guò)程主要是由一些關(guān)鍵酶催化完成的，一般有異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（IPI）、八氫番茄紅素合成酶（PSY）、番茄紅素-β-環(huán)化酶（LYC）、β-胡蘿卜素羥化酶（crtR-b）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、β-胡蘿卜素酮化酶（BKT）和β-胡蘿卜素加氧酶（crtO）等[3-5]。例如，PDS和ZDS催化無(wú)色的八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化成紅色的番茄紅素，crtO催化β-胡蘿卜素形成蝦青素的部分氧化反應(yīng)。但是，缺乏藻體內(nèi)蝦青素合成的分子調(diào)控機(jī)理的研究使得蝦青素大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用受到限制。為了更好地理解蝦青素生物合成的酶基因調(diào)控機(jī)理，近年來(lái)，學(xué)者們運(yùn)用熒光定量PCR來(lái)研究所測(cè)定的類(lèi)胡蘿卜素基因表達(dá)和蝦青素的積累之間的關(guān)系，Gao等從分子水平分析得到，25 mg/L 水楊酸（SA）誘導(dǎo)條件下雨生紅球藻中蝦青素的生物合成主要是通過(guò)ipi-1、ipi-2、psy、crtR-B、bkt、crtO基因在翻譯水平和lyc在翻譯后水平的上調(diào)實(shí)現(xiàn)的，pds同時(shí)在翻譯和翻譯后2個(gè)水平的上調(diào)實(shí)現(xiàn)。而且，ipi、crtO、bkt基因的5′上游側(cè)翼序列中可能包含水楊酸（SA）調(diào)控相關(guān)的順式反應(yīng)元件TCA-element（水楊酸反應(yīng)元件），這意味著水楊酸作為蝦青素合成的有效調(diào)控子刺激形成蝦青素[6]。茉莉酮酸甲酯和赤霉素誘導(dǎo)開(kāi)啟了3種bkt基因的表達(dá)，并且學(xué)者們?cè)谠摶虻?'側(cè)翼序列中識(shí)別出了順式作用元件，因此形成了蝦青素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子信號(hào)[7]。在氮缺乏和強(qiáng)光等脅迫條件下，雨生紅球藻體中pds基因表達(dá)水平明顯上調(diào)[8]。最近的研究表明，在0.17 mol/L鹽誘導(dǎo)10 d后，雨生紅球藻QLD株產(chǎn)生17.7 mg/g干質(zhì)量蝦青素，其主要原因是ipi-1、ipi-2、psy、lyc、bkt2、crtR-B、crtO共7個(gè)蝦青素的生物合成基因上調(diào)，其中前5個(gè)酶基因上調(diào)更明顯，即：由酶IPI催化丙酮酸鹽形成二甲基丙烯焦磷酸，由PSY催化牻牛兒焦磷酸合成四十碳的八氫番茄紅素，由LYC催化番茄紅素環(huán)化形成β-胡蘿卜素，由BKT催化β-胡蘿卜素形成蝦青素的部分氧化反應(yīng)的酶促反應(yīng)能力均得到明顯加強(qiáng)[9]。

利用斜生柵藻生產(chǎn)天然蝦青素具有誘人的探索前景；但是至今還未見(jiàn)用水楊酸誘導(dǎo)斜生柵藻生產(chǎn)蝦青素的嘗試。本試驗(yàn)是首次試圖利用水楊酸脅迫斜生柵藻培養(yǎng)蝦青素，利用熒光定量PCR分析蝦青素合成關(guān)鍵酶基因的新穎表達(dá)水平譜，并且得出與之緊密相關(guān)的蝦青素產(chǎn)量，本研究為水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和蝦青素生物合成通路之間的關(guān)系提供證據(jù)，而且揭示出水楊酸在類(lèi)胡蘿卜素形成中起到的新多功能作用，將為水楊酸在蝦青素產(chǎn)業(yè)化中的大規(guī)模應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)踐知識(shí)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水楊酸，斜生柵藻藻種，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，攝影顯微鏡，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)，GYB30-6A高壓均質(zhì)機(jī)（上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠），超聲細(xì)胞破碎儀等。

1.2 斜生柵藻的培養(yǎng)

斜生柵藻株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，每個(gè)250 mL錐形瓶中加入培養(yǎng)基150 mL，以及稀釋的接種藻液30 mL。自然光照，強(qiáng)度為1 000～1 500 lx，35.5 ℃靜止培養(yǎng)，直至培養(yǎng)到生長(zhǎng)期，然后用3.5 mg/L水楊酸進(jìn)行脅迫培養(yǎng)。

1.3 3.5 mg/L水楊酸對(duì)斜生柵藻生物量的影響試驗(yàn)

每500 mL瓶中裝200 mL藻液，加入水楊酸使終濃度達(dá)到3.5 mg/L進(jìn)行培養(yǎng)，共培養(yǎng)18 d，每隔3 d考察3.5 mg/L水楊酸對(duì)斜生柵藻生物量的影響，以不加水楊酸的相應(yīng)處理作為對(duì)照（表1），每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間3次重復(fù)。

由表1可知，18 d內(nèi)，各培養(yǎng)時(shí)間的藻細(xì)胞生物量均高于對(duì)照，說(shuō)明3.5 mg/L水楊酸能夠促進(jìn)斜生柵藻細(xì)胞生物量的增加。且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，藻細(xì)胞生物量呈時(shí)間依賴性增加（除15 d外），培養(yǎng)15 d時(shí)藻細(xì)胞生物量最大，是對(duì)照的231倍，但差異不顯著（P>0.05）。該研究結(jié)果對(duì)于蝦青素生產(chǎn)具有極其重要的意義。

1.4 顯微觀察

水楊酸脅迫培養(yǎng)后，每隔3 d取少量處理的藻細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下觀察1次（按18 d計(jì)）并拍照，以不加水楊酸的相應(yīng)處理作為對(duì)照，觀察藻細(xì)胞的形態(tài)、顏色變化及細(xì)胞聚集情況等。

1.5 蝦青素提取、含量測(cè)定

利用新型的高壓均質(zhì)破壁和蝦頭殼內(nèi)源酶輔助提取蝦青素相結(jié)合的方法提取蝦青素，具體如下：藻種預(yù)處理、高壓均質(zhì)按照陳興才等的方法[10]并進(jìn)行了優(yōu)化，GYB30-6A高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓均質(zhì)破壁的條件為：28 ℃，42 MPa，循環(huán)3次；蝦頭中的內(nèi)源酶豐富，有活性很高的水解酶系，能有效地解離出蝦青素，利用姜淼等的方法[11]獲得內(nèi)源酶粗酶，51 ℃、pH值4.2條件下酶解2 h進(jìn)行輔助提取，提取后采用高政權(quán)等的方法[3]測(cè)定蝦青素含量，共3次重復(fù)。

1.6 熒光定量PCR分析

按照Gao等的方法[9]并作改進(jìn)，具體如下：mRNA用SVRNA抽提試劑盒（Promega，USA）按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，RNA的濃度用NanoDrop@ND-1000 （Nan oDrop，USA ）測(cè)定，cDNA在20 μL體系中用SuperScript Ⅲ第一鏈合成試劑盒進(jìn)行合成。用作擴(kuò)增特異基因 （蝦青素生物合成路線中的酶）的引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或庫(kù)中的同源序列用Primer Premier 5.0合成，如表2所示。qRT-PCR產(chǎn)物用自動(dòng)移液器移到384孔的板上，在ABI StepOne Plus System （Applied Biosystems，USA）中用SYBR熒光綠進(jìn)行定量，act作為內(nèi)標(biāo)基因。每個(gè)PCR反應(yīng)包括5 μL SYBR熒光綠、1 μL的引物復(fù)合物（包括正向和反向，濃度為5 μmol/L）、4 μL cDNA、2 μL PCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2+）、0.3 μL Taq DNA聚合酶（Promega公司）、0.3 μL dNTP（濃度為15 mmol/L）、超純水。qRT-PCR的擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，退火30 s（退火溫度如表2），72 ℃ 15 s，42個(gè)循環(huán)。同一個(gè)樣品同一個(gè)基因的qRT-PCR試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微觀察

顯微觀察得到： 對(duì)照組（不加水楊酸）細(xì)胞兩端尖細(xì)變橢，并且以4個(gè)或2個(gè)為群體的形式存在（圖1-1）。3.5 mg/L水楊酸培養(yǎng)3 d后，藻細(xì)胞形態(tài)變化較明顯（圖1-2）。3.5 mg/L處理組培養(yǎng)6 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞變大變圓甚至出現(xiàn)不規(guī)則形狀，并有微紅色出現(xiàn)（圖1-3），說(shuō)明蝦青素開(kāi)始逐漸在斜生柵藻細(xì)胞中積累。培養(yǎng)9 d后，原本的青綠色細(xì)胞逐漸變淡，最后轉(zhuǎn)為微紅色，同時(shí)藻類(lèi)數(shù)量明顯增多，細(xì)胞的形態(tài)也由兩端尖細(xì)逐漸膨脹、變圓甚至有不規(guī)則形態(tài)（圖1-4）；而且，以4個(gè)細(xì)胞的群體形式存在的細(xì)胞群體解散，分為單個(gè)細(xì)胞。3.5 mg/L水楊酸培養(yǎng)12 d后，培養(yǎng)液中藻細(xì)胞內(nèi)有明顯的紅色，推測(cè)蝦青素積累在增加（圖1-5）。培養(yǎng)15 d后，細(xì)胞繼續(xù)脹大變橢、變紅，一些細(xì)胞開(kāi)始聚堆，而且細(xì)胞內(nèi)紅色明顯加深（圖1-6）。培養(yǎng)18 d后，細(xì)胞中蝦青素的積累少量增加，仍然是3.5 mg/L培養(yǎng)液中藻細(xì)胞內(nèi)紅色積累最多，但細(xì)胞出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象（圖1-7）。

2.2 蝦青素含量測(cè)定

在3.5 mg/L 水楊酸脅迫培養(yǎng)組，隨著藻細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（除了15 d），蝦青素的積累量在逐漸增加。方差分析表明，12、15、18 d斜生柵藻體內(nèi)蝦青素含量與對(duì)照相比有顯著差異（P<0.05）（圖2）。

2.3 熒光定量PCR分析

與蝦青素含量相對(duì)應(yīng)，熒光定量PCR分析表明：15、18 d斜生柵藻體內(nèi)蝦青素合成基因pds和crtO的表達(dá)水平與對(duì)照相比有顯著差異（P<0.05），12 d后crtO和18 d后ipi基因表達(dá)水平與對(duì)照相比都有顯著差異（P<0.05）（圖3）。圖4分析表明：bkt和psy基因表達(dá)水平隨著水楊酸處理呈現(xiàn)時(shí)間依賴性地增加。

3 結(jié)論與討論

近些年來(lái)，蝦青素一直是國(guó)際學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)之一。學(xué)者們從雨生紅球藻、甲殼類(lèi)等生物中提取蝦青素已經(jīng)取得一些較好的研究成果[4-5]。自從2008年Qin等發(fā)現(xiàn)斜生柵藻能在逆境脅迫條件下迅速合成和積累蝦青素以來(lái)[2]，斜生柵藻可能就是下一個(gè)天然蝦青素產(chǎn)業(yè)化的熱點(diǎn)藻類(lèi)。水楊酸作為一種新的植物內(nèi)源激素，它不僅能調(diào)節(jié)植物的一些生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而且是一種能夠激活植物一系列防御防衛(wèi)反應(yīng)的重要內(nèi)源信號(hào)分子，藻體內(nèi)可能存在蝦青素合成基因調(diào)控相關(guān)的水楊酸反應(yīng)元件[3]。學(xué)者們研究了水楊酸對(duì)雨生紅球藻抗氧化系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)500 μmol/L水楊酸使受光線脅迫的雨生紅球藻體內(nèi)的超氧化物歧化酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性分別增加4.5和15.5倍[12]，5.0 mg/L水楊酸能明顯促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素，一方面加快蝦青積累進(jìn)程，另一方面蝦青素產(chǎn)量顯著提高[3]。近年來(lái)，對(duì)雨生紅球藻中蝦青素合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)脅迫、光線脅迫等逆境條件下，通過(guò)運(yùn)用熒光定量PCR等技術(shù)得出雨生紅球藻體內(nèi)控制蝦青素合成的多個(gè)關(guān)鍵酶基因如β-胡蘿卜素酮基化酶、β-胡蘿卜素水解酶、番茄紅素-β-環(huán)化酶等明顯上調(diào)[8，13-14]。一定質(zhì)量濃度的水楊酸作為一種誘導(dǎo)因子能促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素，水楊酸構(gòu)筑了蝦青素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子信號(hào)。從分子水平分析得到，水楊酸誘導(dǎo)了8個(gè)類(lèi)胡蘿卜素基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，其中β-胡蘿卜素酮基化酶基因和β-胡蘿卜素羥化酶基因表達(dá)水平的上調(diào)是水楊酸壓力脅迫下雨生紅球藻大量積累蝦青素的原因之一[6]。在本研究中，八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和β-胡蘿卜素加氧酶（crtO）的5′上游側(cè)翼序列中可能包含水楊酸調(diào)控相關(guān)的順式反應(yīng)元件即水楊酸反應(yīng)元件，水楊酸對(duì)斜生柵藻中蝦青素的積累具有一定影響，推測(cè)3.5 mg/L的水楊酸的加入會(huì)誘導(dǎo)開(kāi)啟這些作用元件，誘導(dǎo)這2個(gè)非關(guān)鍵限速酶基因大量表達(dá)，從而明顯增加了藻細(xì)胞蝦青素的積累量，這也是它積累蝦青素比雨生紅球藻少的原因之一。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，分析得出如下3點(diǎn)結(jié)論：（1）在3.5 mg/L 水楊酸脅迫培養(yǎng)下，斜生柵藻的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化；（2）用3.5 mg/L的水楊酸誘導(dǎo)18 d后斜生柵藻細(xì)胞脹大變橢圓且顏色呈紅褐色，此時(shí)蝦青素積累最快、最多、最佳；（3）3.5 mg/L的水楊酸溶液對(duì)于斜生柵藻細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種逆境脅迫因子，藻細(xì)胞內(nèi)積累高達(dá)1.123 mg/g的蝦青素來(lái)形成一種自我保護(hù)機(jī)制。

在產(chǎn)業(yè)化實(shí)踐中，除了對(duì)產(chǎn)蝦青素的斜生柵藻藻種進(jìn)行培育[15]外，可以考慮在誘導(dǎo)初期添加3.5 mg/L的水楊酸溶液來(lái)提高斜生柵藻的飼料用價(jià)值。

致謝：本論文在美國(guó)費(fèi)城完成，感謝美國(guó)農(nóng)業(yè)部 （USDA）東部研究中心（ERRC）John Nghiem研究員的指導(dǎo)和幫助。

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