巨線粒體DNAND6基因克隆及多態(tài)性分析

牛寶珍+杜民+劉艷紅+白莉+艾家靈

摘要：利用GenBank數(shù)據(jù)庫中科魚線粒體ND6基因序列保守區(qū)設計引物，采用PCR技術克隆并測序，共得到12尾巨ND6基因全序列。用DNAMAN 5.0軟件比對序列，MEGA 5.0軟件分析科不同魚類的進化關系，結果表明：巨ND6基因序列全長為516 bp，堿基含量分別為14.20%、34.50%、40.20%、11.00%，其中“A+T”含量（54.40%）高于“G+C”含量 （45.50%），存在4個單倍型，發(fā)生3次顛換；12個個體4個單倍型間的平均相對遺傳距離為0.003；將巨與其他14種魚類的ND6基因用Neighbore-Joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)巨單獨聚為1支。研究將為今后魚類線粒體基因組的研究提供科學依據(jù)。

關鍵詞：巨；線粒體；ND6基因；多態(tài)性；系統(tǒng)進化

中圖分類號： S917.4

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0062-04

巨（Bagarius yarrelli Sykes）是云南省特有魚類，主要分布于元江、瀾滄江、怒江流域，屬于鲇形目（Siluriforme）科（Sisoridae）屬（Bagarius）。巨個體很大，體質量約 50 kg，全身無鱗，皮膚表面布滿細密的微小顆粒物，使其皮膚極為粗糙，此外其體表無黏液，身體背面顏色為灰黃色，腹面為白色，肌肉為黃色，所以又稱“黃魚”[1]。巨為底棲肉食性魚類，具有口寬、上下頜都有齒帶、牙齒呈錐形且排列緊密、鰓耙粗短、胃大、腸短等特點，主要食物為魚類、蝦、泥鰍、水生昆蟲[2]。田樹魁等通過比較巨、叉尾鲇、斑點叉尾3種魚肌肉中常規(guī)營養(yǎng)成分和氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)巨肌肉中蛋白質、粗脂肪和必需氨基酸的含量比常規(guī)魚類高，是一種具有較高營養(yǎng)價值的有待馴養(yǎng)開發(fā)的野生魚類[3]。杜民等研究表明，野生巨具有較高的遺傳多樣性[4]。但是由于地理環(huán)境的改變和人為因素的影響，野生可利用的巨資源越來越少。為了保護該魚類，薛晨江等開展了巨的人工馴養(yǎng)，并取得初步成功[5]。

魚類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是細胞核外（細胞質中）具有轉錄、自主復制和翻譯能力的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA[6]。魚類的mtDNA主要包括37個基因（22個tRNA編碼基因、13個疏水蛋白基因、2個rRNA基因）；其中13個疏水蛋白基因編碼的多肽中包含了7個氫化輔酶 Ⅰ （nicotinamide adenine diuncleotide hydrogen，NADH）脫氫酶的亞單位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）。ND6蛋白編碼基因位于L鏈上，處于細胞色素b與ND4之間的連續(xù)區(qū)域，是線粒體內膜呼吸鏈的重要組成成分[7]。在氫化輔酶中，由于ND6基因序列不易發(fā)生變異，進化速度一般，且基因片段不長，因此常用來研究物種的遺傳多樣性、種群之間的親緣關系以及系統(tǒng)進化關系[8]。方月琴等用復合擴增體系，選擇線粒體ND6基因進行種屬鑒定，結果表明，該方法可以將13種不同的動物區(qū)分開來[9]。也有研究表明，ND6基因與人類疾病帕金森氏癥等發(fā)生有關[10]，ND6基因還被用于研究鳥類的親緣關系[11]，但是大多應用于魚類群體和亞種間的遺傳變異研究[12-13]。對巨的線粒體ND6基因全序列進行檢測分析，進而分析巨遺傳結構、變異及與其他物種之間的同源差異，可為今后巨魚種研究提供一定的試驗數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的12尾巨采自云南省河口縣。剪取肌肉組織放于1.5 mL EP管中，貼上對應標簽，再加入無水乙醇，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及多態(tài)性引物篩選 DNA的提取參考Sambrook等的酚/氯仿抽提法[14]。用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相記錄后，將提取的DNA貯存在-20 ℃冰箱中備用。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的科巨魚線粒體基因組ND6基因序列（登錄號：NC_021606，JQ026260），用Primer Premier 5軟件設計簡并引物：上游引物：5′-GCACCTCAGAAKGATATTTGWCCYC-3′；下游引物：3′-TYTAAACAGCCCGAAGCGC MC-5′，在PCR擴增儀上進行擴增，反應體系見表1。

PCR反應條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠在120 V電壓下電泳35 min，最后通過凝膠成像系統(tǒng)得到PCR產物條帶并照相。

檢測后的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外分析儀下切下目的片段，用DNA凝膠回收試劑盒（天根生物科技有限公司）進行回收純化，具體步驟參照回收試劑盒說明書進行。

1.2.2 目的DNA片段的連接與轉化 用pMD18-T載體與目的DNA進行連接、轉化，具體步驟參照載體連接試劑盒說明書進行，用LB培養(yǎng)基進行擴大養(yǎng)后用M13進行陽性克隆篩選，送交南京金斯瑞科技生物公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNAMAN 5.0軟件將測得的巨線粒體ND6基因部分序列與參照物種ND6基因部分序列進行比對。利用MEGA 5.0軟件中的Kimura2-parameter方法計算遺傳距離，采用鄰接法（Neighbore-Joining，NJ）中的Maximum Composite Likelihood法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉檢驗（Bootstrap）獲得系統(tǒng)分支的置信度（重復1 000次）。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

從巨魚鰭條或肌肉提取DNA，結果見圖1。可以看出，DNA條帶清晰。

2.2 引物退火溫度的優(yōu)化

用設計的Bayam18引物退火溫度的±10 ℃范圍進行梯度PCR（圖2），所用marker為BM2000，Bayam18引物的退火溫度梯度見表2。由圖2可知，Bayam18號引物能擴增出條帶的溫度為55、55.6、56.4、57.5、59.2、60.7、61.9 ℃，根據(jù)條帶明亮度，初步確定Bayam18引物最適的退火溫度。

2.3 擴增產物與DNA回收

利用凝膠回收試劑盒對PCR產物（圖3）進行回收，回收產物（圖4）于-20 ℃保存。

2.4 菌液退火溫度優(yōu)化

通過梯度PCR優(yōu)化M13通用引物的退火溫度（圖5）。M13通用引物序列見表3，退火溫度梯度見表4。由圖5可知，M13通用引物在每個泳道都擴增出了明亮條帶。

2.5 巨魚ND6基因序列的堿基含量

本試驗中，利用下載序列通過DNAMAN 5.0軟件對比排位，得到ND6基因片段長度516 bp，12條序列中發(fā)現(xiàn)4個單倍型，其中6號、7號、11號個體序列相同，為1#單倍型；1號、3號、4號、5號、8號、9號、12號個體序列相同，為2#單倍型；10號個體為3#單倍型；2號個體為4#單倍型。采用 MEGA 5.0軟件計算它們的堿基組成（表5），可以得出T、C、A、G 4種堿基含量分別為14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A+T”含量（ 54.20%）高于“G+C”含量（45.80%）。

2.6 巨魚ND6基因12個個體的相對遺傳距離

用MEGA 5.0軟件中的雙參數(shù)法，通過轉換加顛換、轉換比顛換分別計算12個個體之間的相對遺傳距離[15]，詳見表6。由表6可知，12個個體的4個單倍型之間的差異（轉換加顛換）為0.002～0.004。

2.7 基于ND6基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹

將巨魚ND6基因與其他14物種（表7）進行比對，用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹[16-17]，從圖6可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩大支，巨單獨聚為1支。

3 討論與分析

本試驗通過從GenBank數(shù)據(jù)庫中查詢已公布的科巨線粒體基因組中ND6基因序列保守區(qū)設計引物，采用PCR反應擴增、克隆及測序巨ND6基因，共得到12條ND6基因全序列。對巨線粒體ND6基因序列進行研究，得到ND6基因全序列長516 bp。

利用MEGA 5.0軟件分析對巨魚線粒體ND6基因12個個體進行分析，得到T、C、A、G這4種堿基含量分別為14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A+T”含量（54.20%）高于“G+C”含量（45.80%），說明ND6基因序列中富含堿基A、T。共發(fā)現(xiàn)4個單倍型，3個變異位點，都為單突變位點，表明ND6基因序列多態(tài)性貧乏，序列之間差異不大，這與賴瑞芳等比較魴屬魚類線粒體基因組，研究魴屬魚類系統(tǒng)發(fā)育的結果[18]是一致的。ND6基因序列共發(fā)生3次顛換，表明本研究的4個單倍型的ND6基因核苷酸變異類型以

顛換為主。12個個體的4個單倍型之間平均相對遺傳距離為0.003，轉換和顛換的比值為0.667，表明這12個個體之間親緣性近，ND6基因序列變異并不顯著，這與于美玲等對科魚類系統(tǒng)發(fā)育關系的研究結果[19]一致。

此外，由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩大支，其中巨單獨聚成1支，置信值為100%，表明與其他14種科魚親緣性遠。另一支又分為2支，分別是細尾、長絲黑先聚為1支，黃石爬、黑斑原先聚為1支后，這4個種類進而聚為一個大的分支后與本研究的4個巨聚在一起。大鰭異齒和中華先聚為1支，二者與三線紋胸聚在一起后與中華紋胸聚為1支，再與藏聚在一起，然后與黃斑褶聚為較大的分支。巨單獨聚成1支，這與形態(tài)學分類結果與基于細胞色素b（Cytochrome b）、rpS7基因研究的遺傳進化是一致的[20-21]。本研究通過研究巨魚ND6基因序列多態(tài)性，可為以后研究巨與其他魚類的親緣性、系統(tǒng)進化等研究提供科學依據(jù)。

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