外源ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及評價

馬芳芳+蔣明義

摘要：為深入研究ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制以及篩選該信號途徑中相關(guān)重要蛋白的相互作用，利用Gateway技術(shù)，以外源ABA處理的玉米葉片為材料首先構(gòu)建了cDNA初級文庫，初級文庫再通過LR重組的方式最終構(gòu)建成以pDEST22為目的載體的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)質(zhì)量鑒定，該文庫的滴度為3.9×106 CFU/mL，文庫總?cè)萘窟_到1.17×107 CFU，平均插入cDNA片段長度大于800 bp，重組率大于95%。結(jié)果表明所獲酵母雙雜交文庫質(zhì)量較高，符合文庫構(gòu)建的標準，保證了文庫的覆蓋度，為進一步開展互作蛋白篩選的后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：ABA；玉米；酵母雙雜交；cDNA文庫；滴度；重組率；互作蛋白

中圖分類號： S513.01；Q78

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0058-04

脫落酸（ABA）是一種重要的植物激素，它在植物生長發(fā)育的各個方面，包括種子發(fā)育、萌發(fā)和休眠、營養(yǎng)生長及對各種生物、非生物脅迫的響應(yīng)等方面起作用[1-2]。水分脅迫下（包括干旱、鹽漬），植物體通過迅速積累ABA以促進氣孔關(guān)閉以及調(diào)節(jié)眾多基因的表達，從而使植株對逆境環(huán)境做出適應(yīng)反應(yīng)[3-6]。大量研究表明，ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，許多重要的中間組分如胞內(nèi)鈣離子、鈣調(diào)素、磷酸肌醇、cADPR、H+、活性氧、一氧化氮以及蛋白可逆磷酸化等都在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用[7]。然而ABA參與的許多信號途徑的詳細過程特別是具體的分子作用機理仍有待闡明，鑒定參與ABA信號途徑的細胞組分，并對其功能進行闡明分析，將有助于我們提高對ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認識。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種用來研究蛋白質(zhì)間相互作用的簡便、快速而有效的方法[8]，該方法由Fields和Song于1989年首先建立，至今被廣泛應(yīng)用于生物研究的各個領(lǐng)域[9-10]。它的一個很重要的功能就是發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)以及發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能，即從cDNA文庫中篩選出與已知蛋白相互作用的未知蛋白，進而為探索該蛋白的相關(guān)特性及功能奠定基礎(chǔ)[11-15]。所以，高質(zhì)量酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建是利用酵母雙雜交技術(shù)進行大規(guī)?；プ鞯鞍缀Y選的前提和保障[16]。近年來，針對許多重要農(nóng)作物如水稻[17]、小麥[18]、大麥[19]、玉米[20]等，眾多學(xué)者構(gòu)建了以不同組織、器官、細胞類型或分化時期為材料的酵母雙雜交cDNA文庫，為相關(guān)作物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。然而國內(nèi)外關(guān)于外源ABA處理的玉米cDNA文庫的相關(guān)研究還未見報道，本研究以施用外源ABA的玉米為材料，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫，旨在有效地分離與已知蛋白相互作用的靶蛋白，以期為深入研究ABA信號網(wǎng)絡(luò)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 以玉米（Zea mays L.）雜交種農(nóng)大108為材料，將玉米種子浸泡12 h后，25 ℃催芽，挑取發(fā)芽一致的種子播于含有營養(yǎng)液的沙土中培養(yǎng)[晝/夜溫度28 ℃/22 ℃，光照度200 μmol/（m2·s），相對濕度75%，晝/夜光周期14 h/10 h]。當(dāng)幼苗的第2片真葉完全展開時，用鋒利的刀片將玉米幼苗從莖基部快速切割下來，放在純水中2 h以消除傷害脅迫[21]，然后用100 μmol/L外源ABA進行處理[溫度25 ℃、光強200 μmol/（m2·s）]，在不同的處理時間點（0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h），分別剪取第2片葉，迅速置于液氮中冷凍，將最終所得材料混合均勻，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌DH10B、文庫載體pDONR222（用于構(gòu)建初級文庫）、pDEST22（用于構(gòu)建酵母雙雜交文庫）均購自Invitrogen公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol Reagent、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit、1 kb Plus DNA Ladder、UltraPureTMPhenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol （體積比25 ∶24 ∶1） 購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、卡那霉素為Sigma公司產(chǎn)品；Taq DNA Polymerase、DNA Marker Ⅲ、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.1.4 引物 M13 Forward，5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′； M13 Reverse，5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′； pDEST22 Forward，5′-TATAACGCGTTTGGAATCACT-3′； pDEST22 Reverse，5′-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3′。所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建

1.2.1 玉米葉片總RNA的提取和mRNA的純化 取玉米葉片，在預(yù)冷的研缽中將其用液氮研磨成細粉，用Trizol提取其總RNA，具體過程參照說明書進行。得到的總RNA經(jīng)過質(zhì)量及純度檢測之后，用于下一步的mRNA純化操作，具體的純化過程參照FastTrack2.0 Kit說明書進行。得到的mRNA經(jīng)質(zhì)量及純度檢測之后，用于下一步的文庫構(gòu)建操作。

1.2.2 cDNA初級文庫的構(gòu)建 參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書，按以下步驟進行：首先將上步純化得到的mRNA進行cDNA第1鏈的合成；然后進行cDNA第2鏈的合成及純化；cDNA與三框重組接頭attB1 Adapter連接后進行cDNA的分級分離及收集；利用Gateway技術(shù)將收集得到的cDNA與入門文庫載體質(zhì)粒pDONR222混合進行BP重組反應(yīng)；重組反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Proteinase K處理以及純化之后，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B；加入1 mL SOC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h，即為cDNA初級文庫菌液；加甘油至終濃度20%，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建 參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書，將上述得到的cDNA初級文庫菌液接種于含有卡那霉素抗性的肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)；第2天中抽質(zhì)粒并檢測吸光度；將中抽得到的質(zhì)粒稀釋到終濃度300 ng/μL，取出其中1 μL，利用Gateway技術(shù)將其與酵母雙雜交文庫載體質(zhì)粒pDEST22（含GAL4 Transcriptional-Activation Domain）混合進行LR重組反應(yīng)；重組反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Proteinase K處理以及純化之后，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B；加入3 mL SOC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h，即為酵母雙雜交cDNA文庫菌液；加甘油至終濃度20%，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 文庫質(zhì)量的鑒定

1.2.4.1 庫容量的鑒定 分別從“1.2.2”節(jié)和“1.2.3”節(jié)得到的轉(zhuǎn)化后文庫細菌原液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，從中吸出50 μL涂布于含有相應(yīng)抗性的LB平板上（初級文庫鑒定平板使用卡那霉素抗性、酵母雙雜交文庫鑒定平板使用氨芐青霉素抗性），37 ℃培養(yǎng)12～16 h后進行計數(shù)，根據(jù)公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）=文庫滴度×文庫總體積，計算出文庫的滴度以及總?cè)萘俊?/p>

1.2.4.2 重組率和插入片段長度鑒定 從平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，初級文庫菌落PCR使用的引物Primer 1和引物Primer 2分別是M13 Forward和M13 Reverse，酵母雙雜交文庫菌落PCR使用的引物Primer 1和引物Primer 2分別是pDEST22 Forward和pDEST22 Reverse，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，鑒定插入片段大小和陽性克隆重組率。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米葉片總RNA和純化的mRNA質(zhì)量分析

利用Trizol Reagent提取了外源ABA處理的玉米葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28S和18S條帶明亮清晰，亮度比約2 ∶1，表明該總RNA完整性好且基本上未發(fā)生降解（圖1）。經(jīng)總RNA紫外分析測定，結(jié)果顯示D260 nm/D280 nm為1.95，表明總RNA純度好，符合實驗要求，可用于后續(xù)實驗操作?？俁NA樣品經(jīng)過分離純化后得到了mRNA，電泳圖結(jié)果可見其在較大范圍內(nèi)呈涂布狀分布（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符，說明純度較高，完整性較好。

2.2 cDNA初級文庫的質(zhì)量鑒定

2.2.1 庫容量測定 從cDNA初級文庫原始菌液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，吸出50 μL涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后計菌落數(shù)，結(jié)果為643個（圖3），菌液量為1 mL。根據(jù)公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）=文庫滴度×菌液總體積，計算得出：cDNA初級文庫的滴度=643×1 000/0.05=1.28×107 CFU/mL；cDNA初級文庫的總?cè)萘?1.28×107 CFU/mL×1 mL=1.28×107 CFU。

2.2.2 重組率和插入片段大小測定 從平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，PCR產(chǎn)物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳圖，可以看出所有克隆的PCR結(jié)果都呈陽性，重組率達100%，插入cDNA片段長度大小不等，主要分布在500～3 000 bp范圍內(nèi)，多態(tài)性較好，且平均插入片段長度大于1 000 bp（圖4）。

2.3 酵母雙雜交文庫cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

2.3.1 庫容量測定 從酵母雙雜交cDNA文庫原始菌液中取出10 μL，稀釋1 000倍后，吸出50 μL涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后計菌落數(shù)，結(jié)果為195個（圖5），菌液量為3 mL。根據(jù)公式：文庫滴度（CFU/mL）=平板克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂板體積；文庫總?cè)萘浚–FU）=文庫滴度×菌液總體積，計算得出：酵母雙雜交文庫的滴度=195×1 000/0.05=3.9×106 CFU/mL；酵母雙雜交文庫的總?cè)萘?3.9×106 CFU/mL×3 mL=1.17×107 CFU。

2.3.2 重組率和插入片段大小測定 從平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，PCR產(chǎn)物用1% Agarose 凝膠電泳檢測，從電泳圖中可以看出24個克隆中有23個為陽性結(jié)果，重組率大于95%，cDNA插入片段長度大小不等，主要分布在500～3 000 bp范圍內(nèi)，多態(tài)性較好，且平均插入片段長度大于800 bp（圖6）。

3 討論

一個高質(zhì)量酵母雙雜交 cDNA 文庫的獲得，能夠為我們進行大規(guī)?；プ鞯鞍椎暮Y選提供前提和保障，對于我們研究相關(guān)生物的功能蛋白質(zhì)組學(xué)具有重要意義。目前很多生物種類的cDNA文庫已經(jīng)獲得，并且在此基礎(chǔ)上獲得了大量的信息[17-20]，然而關(guān)于外源ABA處理的玉米cDNA文庫的相關(guān)研究還未見報道。已有的研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白激酶如MAPK[22]、CCaMK[23-25]、CDPK[26]等在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護過程中發(fā)揮著重要的作用，我們擬利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與這些蛋白相互作用的靶蛋白，進而探究該蛋白在ABA信號途徑中的具體作用機制，因此，外源ABA處理的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的建立就成為了不可或缺的重要基礎(chǔ)工具。

RNA質(zhì)量的好壞直接影響文庫質(zhì)量的高低，本研究中提取的玉米葉片總RNA純度高、完整性好且基本上未發(fā)生降解，經(jīng)分離純化后得到的mRNA在較大范圍內(nèi)呈涂布狀分布，具有較高的純度和完整性，可用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。本研究在構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫的過程中使用了Gateway技術(shù)，一種基于已研究的非常清楚的λ噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠高效而快速地將DNA定向重組進入不同的載體系統(tǒng)中，進而應(yīng)用于蛋白的表達與功能分析[27-29]。由于在載體構(gòu)建時無需經(jīng)歷限制性內(nèi)切酶的酶切和酶連等過程，并且通過引入3種不同的接頭使得插入片段能夠包含3種不同的讀碼方式，這樣既降低了嵌合克隆出現(xiàn)的概率、保證了插入片段的序列完整性，同時又克服了由于插入片段中非編碼區(qū)帶有終止密碼子而造成的蛋白提前終止翻譯，有效地提高了文庫的完整性和覆蓋性[30]。

通常一個高質(zhì)量的cDNA文庫，其庫容量應(yīng)至少大于 1×106 CFU，這樣才能保證cDNA種類的完整性以及文庫的代表性。本試驗對構(gòu)建的玉米葉片酵母雙雜交cDNA文庫的分析結(jié)果表明，庫容量為1.17×107 CFU，保證了文庫的覆蓋度。而平均插入cDNA片段長度則體現(xiàn)了文庫遺傳信息的完整性，如果大部分克隆插入了全長cDNA序列，則說明文庫的完整性好。本試驗構(gòu)建的文庫重組率大于95%，平均插入cDNA 片段長度大于800 bp，說明該文庫達到了高質(zhì)量文庫的標準，可以用來進行后續(xù)的大規(guī)?；プ鞯鞍椎暮Y選試驗。

參考文獻：

[1]Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants [J]. Annu Rev Plant Biol，2002，53：247-273.

[2]Xu Z Y，Kim D H，Hwang I. ABA homeostasis and signaling involving multiple subcellular compartments and multiple receptors [J]. Plant Cell Rep，2013，32：807-813.

[3]Cutler S R，Rodriguez P L，F(xiàn)inkelstein R R，et al. Abscisic acid：emergence of a core signaling network [J]. Annu Rev Plant Biol，2010，61：651-679.

[4]Fujita Y，F(xiàn)ujita M，Shinozaki K，et al. ABA-mediated transcriptional regulation in response to osmotic stress in plants [J]. J Plant Res，2011，124：509-525.

[5]Hubbard K E，Nishimura N，Hitomi K，et al. Early abscisic acid signal transduction mechanisms：newly discovered components and newly emerging questions [J]. Genes Dev，2010，24：1695-1708.

[6]Umezawa T，Nakashima K，Miyakawa T，et al. Molecular basis of the core regulatory network in ABA responses：sensing，signaling and transport [J]. Plant Cell Physiol，2010，51：1821-1839.

[7]Wasilewska A，Vlad F，Sirichandra C，et al. An update on abscisic acid signaling in plants and more [J]. Mol Plant，2008，1：198-217.

[8]張雨良，張樹珍，王健華，等. 感染高粱花葉病毒甘蔗葉片cDNA文庫構(gòu)建及評價 [J]. 熱帶作物學(xué)報，2012，33（6）：1096-1100.

[9]Fields S，Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions [J]. Nature，1989，340：245-246.

[10]Song O，Dolan J W，Yuan Y L，et al. Pheromone-dependent phosphorylation of the yeast STE12 protein correlates with transcriptional activation [J]. Genes Dev，1991，5：741-750.

[11]Walhout A J，Boulton S J，Vidal M. Yeast two-hybrid systems and protein interaction mapping projects for yeast and worm [J]. Yeast，2000，17：88-94.

[12]Ito T，Ota K，Kubota H，et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome [J]. Mol Cell Proteomics，2002，1：561-566.

[13]Auerbach D，Thaminy S，Hottiger M O，et al. The post-genomic era of interactive proteomics：facts and perspectives [J]. Proteomics，2002，2：611-623.

[14]Chen Y，Xu D. Computational analyses of high-throughput protein-protein interaction data [J]. Curr Protein Pept Sci，2003，4：159-181.

[15]Cho S，Park S G，Lee D H，et al. Protein-protein interaction networks：from interactions to networks [J]. J Biochem Mol Biol，2004，37：45-52.