基于抗氧化活性的抗壞血酸-氨基酸衍生物制備工藝的優(yōu)化

聞霞,李娜,滕右露,范娟林,周婷,喬艷紅，張強(qiáng)

安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蚌埠 233100

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基于抗氧化活性的抗壞血酸-氨基酸衍生物制備工藝的優(yōu)化

聞霞,李娜,滕右露,范娟林,周婷,喬艷紅，張強(qiáng)

安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蚌埠 233100

[摘要]以抗氧化活性(還原力)為考察指標(biāo)，先采用單因素試驗(yàn)探討了氨基酸種類、體積比、pH和加熱時(shí)間4個(gè)因素對(duì)抗壞血酸-氨基酸衍生物制備反應(yīng)的影響，再通過正交試驗(yàn)確定了抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝。結(jié)果表明，抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝如下：抗壞血酸與精氨酸發(fā)生反應(yīng)，二者的體積比為2∶1，pH為10.0，沸水浴90min，此條件下制備的衍生物還原力最強(qiáng)，大約是同濃度抗壞血酸的2.17倍，提示該方法是改善抗壞血酸抗氧化活性的有效方法。

[關(guān)鍵詞]抗壞血酸；精氨酸；抗氧化活性 ；制備工藝

氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧自由基簇(ROS)產(chǎn)生過多或/和機(jī)體抗氧化能力下降、ROS清除不足而導(dǎo)致的活性氧在體內(nèi)增多并引起細(xì)胞氧化損傷的病理過程[1]。從人體的衰老到老年神經(jīng)退行性疾病，從死亡率最高的心腦血管疾病到最可怕的癌癥，人類的許多疾病都與體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[2]。抗氧化劑(天然、人工合成)可預(yù)防機(jī)體因氧化應(yīng)激所造成的生物大分子的系列損傷。由于人工合成的抗氧化劑如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等具有一定的毒性和致癌作用[3，4]，所以評(píng)價(jià)和篩選具有強(qiáng)抗氧化活性的天然抗氧化劑已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢(shì)。L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)又名維生素C，廣泛存在于各種新鮮的蔬菜和水果中，是含有6個(gè)碳原子的酸性多羥基化合物，也是一種重要的以抗氧化功能為特色的水溶性維生素?？箟难峋哂锌拱┗钚裕軌蝾A(yù)防心血管疾病、提高人體的免疫力，還能夠通過清除人體正常代謝產(chǎn)生的自由基而起到延緩衰老的作用[5,6]?？箟难嶙鳛榭寡趸瘎┰谑称贰⒒瘖y品及醫(yī)藥等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。但是，由于抗壞血酸分子中有烯二醇基團(tuán)，在熱、空氣和金屬離子的存在下，易于氧化變質(zhì)，因而不穩(wěn)定性成為其使用過程中的一大障礙[7,8]。對(duì)抗壞血酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性，可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性，甚至可以提高其抗氧化活性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍，已成為當(dāng)前食品科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[9]。除了已成功開發(fā)的抗壞血酸鈣、抗壞血酸鈉、抗壞血酸硬脂酸酯等衍生物外，近年來殼聚糖抗壞血酸鹽[10]、抗壞血酸肉桂酸酯[11]和抗壞血酸沒食子酸酯[12]等一些新的抗壞血酸衍生物合成的研究相繼被報(bào)道，但有關(guān)抗壞血酸-氨基酸衍生物合成的研究報(bào)道鮮見。因此，本研究探討了抗壞血酸-氨基酸衍生物的制備工藝，以期為新型抗壞血酸衍生物的合成與應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

抗壞血酸、精氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、賴氨酸、亮氨酸均為BR(滬試)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑總公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸及三氯化鐵等試劑，除特別注明外均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器

精密pH計(jì)：PHS-3C型，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國華電器有限公司產(chǎn)品；萬分之一電子天平：BT354S-XM型，北京賽爾斯精密儀器有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)：TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的單因素試驗(yàn)

1)氨基酸種類對(duì)制備反應(yīng)的影響0.02mol/L的抗壞血酸分別與0.02mol/L的亮氨酸、脯氨酸、賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸等體積混合于具塞試管中，然后用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，反應(yīng)體系總體積為10mL，將試管置于沸水中加熱30min，于冰浴冷卻，測(cè)定產(chǎn)物的還原力。

2)抗壞血酸與氨基酸的體積比對(duì)制備反應(yīng)的影響分別按體積比4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3移取0.02mol/L的抗壞血酸和0.02mol/L精氨酸，用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至9.0，反應(yīng)體系的總體積為10mL，將試管置于沸水中加熱30min，于冰浴冷卻，測(cè)定產(chǎn)物的還原力。

3)pH對(duì)制備反應(yīng)的影響按體積比2∶1分別取0.02mol/L的抗壞血酸和0.02mol/L的精氨酸于試管中，然后用1mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)溶液的pH至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，反應(yīng)體系的總體積為10mL，將試管置于沸水中加熱30min，于冰浴冷卻，測(cè)定產(chǎn)物的還原力。

4)加熱時(shí)間對(duì)制備反應(yīng)的影響按體積比2∶1分別取0.02mol/L的抗壞血酸和0.02mol/L的精氨酸于試管中，然后用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至10.0，反應(yīng)體系總體積為10mL。將各試管置于沸水中分別加熱30、60、90、120、150、180min，于冰浴冷卻，測(cè)定產(chǎn)物的還原力。

1.2.2抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素、水平的設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平表

1.2.3還原力的測(cè)定

參照Duan等[13]的方法并略作修改。于試管中加入樣品液0.5mL，用0.2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液補(bǔ)足至2.5mL，再加入5mL 1%鐵氰化鉀，混勻。各試管置于50℃水浴20min，然后加入10% 的三氯乙酸(TCA)2.5mL，搖勻，3500r/min離心10min。吸取上清液2.5mL，加入0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液和2.5mL蒸餾水，搖勻，靜置3～5min，于700nm處測(cè)定光密度，光密度值越大，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性也越強(qiáng)。

1.2.4紫外光譜掃描

為判定反應(yīng)的發(fā)生，分別對(duì)抗壞血酸、氨基酸和最佳反應(yīng)條件下制備的抗壞血酸-氨基酸衍生物溶液于波長190～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

2結(jié)果與分析

2.1抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的單因素試驗(yàn)2.1.1氨基酸種類對(duì)制備反應(yīng)的影響

不同的氨基酸所含有的基團(tuán)不同，酸堿性不同，極性大小也不同，從而會(huì)影響制備反應(yīng)的發(fā)生。從圖1可以看出，在6種氨基酸中，精氨酸與抗壞血酸反應(yīng)產(chǎn)物的還原力最大，6種氨基酸與抗壞血酸反應(yīng)后產(chǎn)物還原力的大小順序依次為：精氨酸>賴氨酸>亮氨酸>谷氨酸>脯氨酸>酪氨酸。

圖1　氨基酸種類對(duì)制備反應(yīng)的影響

2.1.2抗壞血酸與氨基酸的體積比對(duì)制備反應(yīng)的影響

抗壞血酸與氨基酸的體積比會(huì)影響二者間的碰撞，從而影響反應(yīng)的發(fā)生。從圖2可知，隨著反應(yīng)體系中氨基酸所占比例的增加，產(chǎn)物抗氧化活性呈先增后減的變化趨勢(shì)，當(dāng)抗壞血酸與精氨酸的體積比為2∶1時(shí)，產(chǎn)物的抗氧化性最強(qiáng)。

圖2　體積比對(duì)制備反應(yīng)的影響

2.1.3pH對(duì)制備反應(yīng)的影響

pH會(huì)影響反應(yīng)物分子上各種基團(tuán)的解離，從而會(huì)對(duì)反應(yīng)的發(fā)生產(chǎn)生影響。從圖3可以看出，隨著反應(yīng)體系pH的增加，產(chǎn)物的抗氧化活性呈先增后減的變化，在pH為10.0時(shí)，產(chǎn)物的抗氧化性也最強(qiáng)。

圖3　pH對(duì)制備反應(yīng)的影響

2.1.4加熱時(shí)間對(duì)制備反應(yīng)的影響

加熱時(shí)間會(huì)影響反應(yīng)的進(jìn)程，從而會(huì)影響產(chǎn)物的抗氧化活性。從圖4可知，隨著加熱時(shí)間的延長，產(chǎn)物的抗氧化活性呈先增后減的變化，在加熱時(shí)間為60min時(shí)，產(chǎn)物的抗氧化性最強(qiáng)。

圖4　加熱時(shí)間對(duì)制備反應(yīng)的影響

2.2抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的正交實(shí)驗(yàn)

抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的正交試驗(yàn)結(jié)果分別如表2和表3所示。從表2的極差分析和表3的方差分析可知，影響抗壞血酸-氨基酸衍生物制備的各因素的排列順序?yàn)椋築>C>D>A，即體積比>pH>加熱時(shí)間>氨基酸種類；體積比和pH對(duì)制備反應(yīng)的影響極顯著(P<0.01)，加熱時(shí)間對(duì)制備反應(yīng)的影響顯著(P<0.05)；抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝為A2B1C2D3，即抗壞血酸與精氨酸進(jìn)行反應(yīng)，二者的體積比2∶1、pH為10.0、加熱時(shí)間為90min，在此條件下制備的產(chǎn)物的還原力最強(qiáng)。

表2　正交試驗(yàn)的極差分析表

注：*表示顯著水平在0.05，**表示顯著水平在0.01。

表3　正交試驗(yàn)的方差分析表

2.3抗壞血酸反應(yīng)前后抗氧化活性的比較

圖5　抗壞血酸-氨基酸衍生物與抗壞血酸還原力的比較

由圖5可知，抗壞血酸在與氨基酸發(fā)生反應(yīng)前后抗氧化活性的差異很大，在最佳制備工藝條件下制備的抗壞血酸-精氨酸衍生物的還原力大約是反應(yīng)前的2.17倍，表明抗壞血酸經(jīng)過氨基酸的衍生反應(yīng)以后抗氧化性得到明顯提高。

2.4產(chǎn)物鑒定

由圖6的紫外掃描圖譜可知，與精氨酸和抗壞血酸相比，抗壞血酸-精氨酸衍生物的紫外掃描圖譜有明顯的不同，精氨酸在205nm附近有最大吸收峰，抗壞血酸在230nm附近有最大吸收峰，而抗壞血酸-精氨酸衍生物在200nm和255nm附近分別有2個(gè)最大吸收峰，說明精氨酸與抗壞血酸反應(yīng)后生成了全新的物質(zhì)，即本研究所制備的抗壞血酸-精氨酸衍生物。

圖6　抗壞血酸、精氨酸及抗壞血酸-精氨酸衍生物的紫外掃描圖譜

3結(jié)論

抗壞血酸-氨基酸衍生物的最佳制備工藝為：抗壞血酸與精氨酸發(fā)生反應(yīng)，二者的體積比為2∶1,pH為10.0，沸水浴90min，此條件下所獲得的衍生物的還原力最大；抗壞血酸-氨基酸衍生物的抗氧化性較原抗壞血酸有大幅度的提高，還原力大約是反應(yīng)前的2.17倍，表明本方法是改善抗壞血酸抗氧化活性的有效方法。此外，抗壞血酸-精氨酸衍生物是在沸水浴條件下制備的，因此，熱穩(wěn)定性較抗壞血酸已明顯增強(qiáng)，但空氣、金屬離子等其他方面因素對(duì)于抗壞血酸-精氨酸衍生物的影響還有待于進(jìn)一步的研究。

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[收稿日期]2015-11-12

[基金項(xiàng)目]大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(108792015048)；大學(xué)生創(chuàng)新科研基金項(xiàng)目(15XSZ36)。

[作者簡(jiǎn)介]聞霞(1995-)，女，現(xiàn)從事食品生物技術(shù)研究。通信作者：張強(qiáng)，zq7964@163.com。

[中圖分類號(hào)]TS201.2+4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)03-0048-06

[引著格式]聞霞,李娜,滕右露,等.基于抗氧化活性的抗壞血酸-氨基酸衍生物制備工藝的優(yōu)化[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(3)：48～53.