豬瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表達(dá)與鑒定

周景明，劉芳冰，祁艷華，張改平,2，栗 寧，王愛萍*

(1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭州 450002)

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豬瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表達(dá)與鑒定

周景明1，劉芳冰1，祁艷華1，張改平1,2，栗 寧1，王愛萍1*

(1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭州 450002)

摘要[目的]研究豬瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)特性。[方法]通過PCR方法克隆了E0基因全長681 bp的片段，連接到真核表達(dá)載體pEGFP-C1上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定。[結(jié)果]成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pEGFP-E0。通過雙酶切鑒定，PCR鑒定和測序確定了目的基因大小一致，插入位置完全正確后，利用Lipofecta mine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到豬腎細(xì)胞PK-15中，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察，可以看到大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。通過G418篩選后，在熒光顯微鏡下仍能觀察到部分細(xì)胞能夠呈現(xiàn)出綠色熒光，這表明重組融合蛋白pEGFP-E0在PK-15細(xì)胞中得到了表達(dá)。[結(jié)論]獲得的能夠表達(dá)重組融合蛋白的細(xì)胞克隆，為進一步大量表達(dá)與純化E0糖蛋白、制備其單抗以及研究豬瘟病毒E0糖蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞豬瘟病毒；E0蛋白；增強型綠色熒光蛋白；PK-15細(xì)胞

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性傳染病，臨床上以高熱、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點為主要特征[1]。世界動物衛(wèi)生組織將其列為 A 類傳染病，我國也將其列為一類傳染病。豬瘟病毒是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus),為單股正鏈RNA病毒[2]，其基因組編碼1個多聚蛋白，經(jīng)宿主細(xì)胞和病毒蛋白酶裂解后產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白(C(p14)、E0(gp44/48)、E1(gp33)和E2(gp55))和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[3]。CSFV 自然感染豬后，機體可產(chǎn)生針對結(jié)構(gòu)蛋白E2、E0和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3的抗體[4]。

E0蛋白是CSFV的一個保護性抗原蛋白，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，其抗原性與 E2 相比是能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫力的第二抗原蛋白。E0蛋白由病毒 ORF中 GLu168-ALa494 組成[5]，有 9 個可能的糖基化位點，糖基化前后的分子質(zhì)量分別為 25.7 ku 和 44～48 ku[6]。E0是唯一一個可以分泌到豬瘟病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的糖蛋白[7]。Shen等[8]研究表明 E0可單獨誘導(dǎo)免疫保護，誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗大劑量豬瘟病毒的攻擊。利用在昆蟲細(xì)胞表達(dá)的 E0和 E2進行的抑制試驗表明，E0和 E2 是與不同的細(xì)胞表面受體作用，豬瘟病毒最初是通過E0的介導(dǎo)才能結(jié)合到細(xì)胞上的[9]。另外，在各毒株內(nèi)編碼 E0的氨基酸序列比編碼 E2 的氨基酸序列要更加保守[10]。因此，E0是防治豬瘟的主要靶蛋白之一。筆者利用豬源性的PK-15細(xì)胞作為表達(dá)豬瘟病毒E0糖蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，將豬瘟病毒E0基因在PK-15細(xì)胞中進行表達(dá)，并進行雙酶切鑒定，旨在為E0病毒的基因工程疫苗的實際生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與質(zhì)粒。PK-15細(xì)胞來自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室；真核表達(dá)載體pEGFP-C1購自北京天恩澤公司，含有目的基因E0片段的pET28a-E0(BL21)菌種由鄭州大學(xué)分子免疫學(xué)實驗室保存。

1.1.2工具酶及試劑。質(zhì)粒DNA純化試劑盒，為TaKaRa公司產(chǎn)品；Lipofecta mine 2000試劑盒為invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司；使用的培養(yǎng)基為DMEM(含10%胎牛血清、鏈霉素、青霉素)完全培養(yǎng)基，加入NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0 。限制性內(nèi)切酶Xho1和Kpn1以及T4連接酶，均購自TaKaRa公司。

1.1.3儀器。TP-214分析天平，為美國Denver公司產(chǎn)品； mini-PROTEAN Tetra System電泳儀、GeL DocTMXR+ 凝膠成像系統(tǒng)，為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000c分光光度計、Barnstead Nanopure超純水儀，為美國Thermo公司產(chǎn)品；CMAG HS4加熱磁力攪拌器，為德國IKA公司產(chǎn)品；H1650-W臺式高速離心機，為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；WD-9405B型水平搖床，為北京市六一儀器廠產(chǎn)品；透析袋MD25，為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；IX71倒置式熒光顯微鏡，為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的豬瘟病毒E0序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物擴增E0序列，預(yù)計擴增片段681 bp，設(shè)計其上下游引物：上游引物F為5′A CTCGAGCTGAAAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAACG 3′的5′端含有Xho1酶切位點，下游引物R為5′A GGTACCGGCATAAGCGCCAAACCAGGTTTT 3′的5′端含有Kpn1酶切位點。

1.2.2載體構(gòu)建。以提取的pET28a-E0基因組DNA為模板，以F/R為引物，擴增E0基因，向50 μL體系中加入ExTaq酶25 μL、引物各0.5 μL、模板1 μL，然后加超輕水補足50 μL，PCR程序為：95 ℃變性5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物,并用DNA純化回收試劑盒回收純化681 bp的E0 基因片段,將回收片段進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定條帶是否正確。以Xho1和Kpn1 2個限制性內(nèi)切酶同時對載體和E0片段進行雙酶切，酶切后產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳電泳并用DNA純化回收試劑盒回收，用T4連接酶進行連接反應(yīng)，連接條件為4 ℃過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含Amp的LB培養(yǎng)基平板上挑取陽性單克隆，對質(zhì)粒分別進行PCR鑒定、雙酶切鑒定，鑒定成功后送交公司測序。并將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-E0。

1.2.4PK-15細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。用質(zhì)粒DNA純化試劑盒純化pEGFP-E0質(zhì)粒后供轉(zhuǎn)染用。細(xì)胞重懸以后，進行細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)12孔板底面積大小，每孔鋪5×105個，鋪4孔，添加DMEM完全培養(yǎng)基補至3 mL，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞密度90%以上，DMEM不完全培養(yǎng)基沖洗每孔。最后，每孔加入2 mL DMEM，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染液，A液為240 μL DMEM﹢10 μL脂質(zhì)體2000，B液為230 μL DMEM﹢20 μL(4 μg)質(zhì)粒，將A液混勻后室溫放置5 min后，再將A液、B液混勻，室溫放置20 min。將轉(zhuǎn)染液逐滴加入試驗孔中，輕搖。

1.2.5G418篩選。轉(zhuǎn)染6 h后觀察并記錄熒光情況，并將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后更換為G418篩選培養(yǎng)基，通過預(yù)試驗確定G418篩選濃度為600 μg/mL。每3～5 d更換1次篩選培養(yǎng)基，以除去死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片。約21 d后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光情況。

2結(jié)果與分析

2.1載體構(gòu)建PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在681 bp左右的位置出現(xiàn)特異性片段，與預(yù)期結(jié)果一致。將此片段與真核表達(dá)載體pEGFP-C1進行雙酶切與連接(圖1)，獲得了重組質(zhì)粒pEGFP-E0。經(jīng)Xho1和Kpn1雙酶切，可獲得681 bp左右的特異性片段(圖2)；以pEGFP-E0為模板，以F/R為引物，可擴增出681 bp大小的片段(圖3)。重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定，無氨基酸突變和堿基突變，表明重組載體構(gòu)建成功。

注：M1.DL2 000 Marker; 1.E0基因的雙酶切產(chǎn)物；2.載體pEGFP-C1雙酶切產(chǎn)物；M2.DL 15 000 Marker.Note:M1.DL2 000 Marker; 1.Double enzyme digestion of E0 gene; 2.Double enzyme digestion of vector pEGFP-C1; M2.DL 15 000 Marker.圖1　將載體pEGFP-C1和質(zhì)粒E0同時進行雙酶切與連接Fig.1　The double enzyme digestion and connection of pEGFP C1 and E0 plasmid

注： M.DL2000 Marker; 1.重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。Note:M.DL2000 Marker; 1.Double enzyme digestion of recombinant plasmid.圖2　重組質(zhì)粒pEGFP-E0的雙酶切鑒定Fig.2　Double digestion of recombinant plasmid pEGFP - E0

注： M.DL2000 Marker; 1.重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物。Note:M.DL2000 Marker; 1.PCR products of recombinant plasmid.圖3　重組質(zhì)粒pEGFP-E0的PCR鑒定Fig.3The PCR identification of recombinant plasmid pEGFP-E0

圖4　轉(zhuǎn)染6 h后觀察到的熒光現(xiàn)象(A)、轉(zhuǎn)染過程的熒光現(xiàn)象(B)和最終篩選出來穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上重組質(zhì)粒的PK-15細(xì)胞(C)Fig.4　The fluorescence phenomenon after transfection 6 h(A)，fluorescence phenomenon in the process of transfection(B)，final filtered PK 15 cells stable transfected with recombinant plasmid(C)

2.2E0基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測轉(zhuǎn)染6 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察到大面積的熒光，后期G418篩選過程中熒光數(shù)量在逐步減少，約14 d后對照組細(xì)胞全部死亡，約7 d后仍有約10%的細(xì)胞有熒光，由此獲得了穩(wěn)定整合有外源基因的PK-15細(xì)胞克隆(圖4)。

3討論

目前應(yīng)用于蛋白表達(dá)的系統(tǒng)大多為原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌類表達(dá)系統(tǒng))，大腸桿菌類原核表達(dá)系統(tǒng)雖然較為成熟，但其表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，因為缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，所以無翻譯后的加工修飾過程，其內(nèi)源性蛋白酶易降解表達(dá)的蛋白質(zhì)分子且細(xì)胞膜間隙含有大量的內(nèi)毒素。后來，真核表達(dá)系統(tǒng)是最具發(fā)展前景的蛋白質(zhì)產(chǎn)生方式，目前研究較多的是酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)。酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)存在不正確糖基化，并且還有產(chǎn)物復(fù)雜不易純化、表達(dá)量較低、病毒污染等問題。據(jù)報道，單個細(xì)胞表達(dá)蛋白量達(dá)20 pg/d的工程細(xì)胞株[11],分批補料式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)2 000萬/mL以上,蛋白產(chǎn)量高達(dá)10 g/L[12-13]。 利用豬源性的PK-15細(xì)胞作為表達(dá)豬瘟病毒E0糖蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，一方面是為了提高E0蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，因為PK-15細(xì)胞對豬瘟病毒的遺傳密碼子具有嗜好性。另一方面，該系統(tǒng)對E0蛋白的后期加工可以使得該蛋白的反應(yīng)原性和免疫原性得到很大提高，為將該病毒的基因工程疫苗投入實際生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

重組質(zhì)粒pEGFP-E0穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞系時，只有部分質(zhì)粒能夠通過細(xì)胞質(zhì)的阻礙進入到細(xì)胞核內(nèi)，而最多只有80%進入細(xì)胞核內(nèi)的外源DNA能夠得到瞬時表達(dá)。只有極少數(shù)進入細(xì)胞的外援基因在通過一系列非同源分子間重組和連接后整合到細(xì)胞染色體中，細(xì)胞基因組的自由部分進行表達(dá)。此外，在此整合的過程中，并不一定所有整合到細(xì)胞染色體的外源基因都能夠表達(dá)，因為整合的區(qū)段是不同的。只有整合到了表達(dá)區(qū)段的基因才能夠表達(dá)，所以要篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)染體，篩選的依據(jù)為共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素的抗性基因所提供的新表型。

G418是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的篩選試劑，它是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與慶大霉素、新霉素、卡那霉素相似，它能夠阻斷蛋白質(zhì)的合成，因此對原核和真核細(xì)胞都具有不同的毒性 ,其中包括細(xì)菌、植物、酵母、哺乳動物細(xì)胞以及一些原生動物和蠕蟲。但是，當(dāng)pEGFP-C1載體所攜帶的neo抗性基因被整合到細(xì)胞基因組正確的位置后，它能夠啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而使得neo抗性產(chǎn)物——氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶高效表達(dá)，進而將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式，使得細(xì)胞獲得足夠的抗性，并且能夠在含有G418的篩選培養(yǎng)基中生長。連續(xù)使用篩選培養(yǎng)基篩選14～21 d,在此過程中要及時更換培養(yǎng)基，去除死亡細(xì)胞的細(xì)胞碎片，以免死細(xì)胞產(chǎn)生的有害物質(zhì)影響正常細(xì)胞的生長。約21 d后，就能夠得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞克隆，將此克隆用胰酶消化至培養(yǎng)板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，并收集表達(dá)的重組蛋白。

由于PK-15細(xì)胞本身沒有綠色熒光蛋白基因,將PEGFP和豬瘟病毒E0基因的編碼區(qū)相連得到的重組基因可以用來研究基因的表達(dá)情況和活細(xì)胞內(nèi)外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)的定位。筆者成功地表達(dá)了PEGFP-E0融合蛋白,為進一步大量表達(dá)和純化E0糖蛋白、制備其單抗以及研究豬瘟病毒E0糖蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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Expression and Identification of E0 Protein of Classical Swine Fever Virus in PK-15

ZHOU Jing- ming，LIU Fang-bing，QI Yan-hua，WANG Ai-ping*et al

(School of Life Science，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001)

Abstract[Objective] The aim was to study the characteristic how gene E0 of classical swine fever virus (CSFV) expressed in PK-15.[Method] E0 gene whose full length was 681 bp fragment was cloned by PCR，and then a recombinant plasmid was constructed with eukaryotic expression vector of pEGFP-C1，double enzyme digestion was conducted.[Result] A recombinant plasmid pEGFP-E0 was sucessfully constructed，by restriction enzyme digestion，PCR identification and sequencing，the size of the target gene and insertion position was determined and was right，then recombinant plasmid were transformed into pig kidney-derived cells PK-15 by the Lipofecta mine 2000 transfection kit，after transfection 48h，many cells showed green fluorescence under a fluorescence microscope，which indicated the transfection was successful.After screening by geneticin，there were still green fluorescent cells under the fluorescence microscope，which indicated that the recombinant fusion protein of pEGFP-E0 was expressed in the cell PK-15.[Conclusion] The obtain of expressing recombinant fusion protein of cell clones lay a foundation for further mass production of soluble glycoprotein E0，preparing its monoclonal antibody epitope screening and researching the biological function of protein E0.

Key wordsCSFV; E0 protein; Enhanced green fluorescent protein; PK-15 cell

基金項目國家自然科學(xué)基金項目(31172331)。

作者簡介周景明(1972- )，男，河南南陽人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子免疫學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事分子免疫學(xué)研究。

收稿日期2016-03-11

中圖分類號S 852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)10-160-03