20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞自噬作用的影響

陳凱云 何潔 梁文麗

20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞自噬作用的影響

陳凱云 何潔 梁文麗

目的 觀察20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）自噬作用的影響，并探討20(R)-人參皂苷Rg3誘導(dǎo)MCF-7自噬作用的最佳劑量。方法 人乳腺癌細(xì)胞株分為20(R)-人參皂苷Rg3實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組。采用MTT法觀察20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并依據(jù)計(jì)算出的IC50值確定20(R)-人參皂苷Rg3的有效濃度。結(jié)果 當(dāng)20(R)-人參皂苷Rg3濃度在37.5～600.0mg/L時(shí)，MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率最高，并隨其濃度的增加而增大，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞所含自噬泡明顯增多，說(shuō)明20(R)-人參皂苷Rg3可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：LC3蛋白，特別是LC3-II的表達(dá)量與細(xì)胞自噬程度呈正相關(guān)，隨著20(R)-人參皂苷Rg3干預(yù)濃度的增大，LC3-I和LC3-II蛋白表達(dá)量亦明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 20(R)-人參皂苷Rg3能顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)良好的劑量、時(shí)間依賴性；20(R)-人參皂苷Rg3有誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬作用。

20(R)-人參皂苷Rg3；人乳腺腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞自噬

中藥人參中的四環(huán)三萜皂苷，又稱20(R)-人參皂苷Rg3。以往研究證實(shí)20(R)-人參皂苷Rg3具有抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)移植腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移作用[1-3]，一些抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的[4-7]。20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）是否也具有同樣作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）購(gòu)于上海細(xì)胞研究所；20(R)-人參皂苷Rg3購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（Hyclone公司，AQC23410）；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液（華舜生物試劑公司）、3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine，3-MA)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)于Sigma公司；抗LC3單抗（包括LC3-I和LC3-II）購(gòu)自MBL CO.(Woburn，MA，USA，131220)。

1.2 方法

1.2.1 20(R)-人參皂苷Rg3溶液的制備 首先將20(R)-人參皂苷Rg3用DMSO溶解為100mg/mL濃度的溶液10mL，備用；使用前用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的濃度(37.5，75.0，150.0，300.0，600.0μg/mL)，DMSO終濃度＜0.1%。

1.2.2 人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的培養(yǎng) 在人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）培養(yǎng)液中融入100μL青霉素、100μL鏈霉素后，將MCF-7細(xì)胞貼壁置于DMEM培養(yǎng)液中，要求在37℃、5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)[5]，生長(zhǎng)至80%～90%融合后傳代，隔天換液1次。

1.2.3 MTT法測(cè)MCF-7細(xì)胞活性 觀察組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞加入96孔板內(nèi)，每孔200μL，常規(guī)培養(yǎng)24h后，加入稀釋后的20(R)-人參皂苷Rg3溶液，其終濃度分別為37.5，75.0，150.0，300.0及600.0mg/L；對(duì)照組加入含相應(yīng)濃度乙二醇的10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，72h。向各孔內(nèi)加入MTT溶液20μL(5mg/L)，37℃、5%CO2孵育4h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)上清液100μL DMSO，震蕩10min，待沉淀完全溶解后用Bio-red550酶標(biāo)儀測(cè)定490nm的吸光度值(A值)[5]；每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值，對(duì)不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3誘導(dǎo)后的MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行計(jì)算。

通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及藥物濃度作曲線求出IC50值。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=對(duì)照組細(xì)胞A值-加藥組細(xì)胞A值/對(duì)照組細(xì)胞A值×100%。

1.2.4 在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來(lái)示蹤自噬形成 在轉(zhuǎn)染前12h將所需細(xì)胞經(jīng)20（R）-人參皂苷Rg3處理

6d后的培養(yǎng)液，取1mL/L加入1μL MDC（50μmol/L）染液，37℃反應(yīng)10min，去上清夜，PBS漂洗3次，用DAPI染色并封片。制作好的細(xì)胞切片以熒光顯微鏡觀察GFP-LC3熒光聚集情況并拍照。

1.2.5 自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)檢測(cè) 選擇傳代貼壁后細(xì)胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%CCFBS）培養(yǎng)48h，再分別加入含SPG-Rg3培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h后吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次，裂解細(xì)胞。將內(nèi)容物移入離心管，離心15min(4℃，10000r/ min)。上清液置－20℃保存?zhèn)溆?。用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。定量取樣品蛋白50ug，電泳后移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，棄溶液，每張膜分別加入兔抗ERKl／2、兔抗Phospho—ERKl／2、兔抗LC3B多克隆抗體、鼠抗GAPDH鼠單克隆抗體，4℃搖床12h，TBST洗膜3次，加辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，TBST洗膜3次。在膜上加HRP和AP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物，用熒光／化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件。計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果表明，20(R)-人參皂苷Rg3作用后的不同時(shí)間階段（24，48，72h）后，20(R)-人參皂苷Rg3均能有效抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，其不同濃度與作用時(shí)間有依賴性。見(jiàn)表1。

表1 20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用(n=54)

2.2 GFP-LC3融合蛋白示蹤自噬形成 在熒光顯微鏡下觀察到，對(duì)照組高亮陽(yáng)性細(xì)胞較少，細(xì)胞所含高亮顆粒也很少，而實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明細(xì)胞所含自噬泡也明顯增多。說(shuō)明20(R)-人參皂苷Rg3可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬。見(jiàn)圖1A和1B。

2.3 20(R)-人參皂苷Rg3對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞膜標(biāo)記水平的影響 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的MCF-7細(xì)胞中的LC3蛋白、LC3-II蛋白表達(dá)上調(diào)，有顯著性采用（P＜0.05），說(shuō)明20(R)-人參皂苷Rg3可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬，并且隨著20(R)-人參皂苷Rg3濃度的增大，MCF-7細(xì)胞中的LC3-I和LC3-II蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），并提示LC3蛋白，特別是LC3-II的表達(dá)量與細(xì)胞自噬程度呈正相關(guān)，即20(R)-人參皂苷Rg3能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬。見(jiàn)圖1C。

圖1 20(R)-人參皂苷Rg3與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的自噬體注：(A)在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來(lái)示蹤自噬形成；(B)20(R)-20(R)-人參皂苷Rg3處理6d后觀察到的自噬體(黑箭頭)；(C)利用Western Blot法檢測(cè)自噬體膜上LC3-II/I比值的變大

3 討論

細(xì)胞自噬(autophagy)是一種程序化的細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)程，細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解自身胞質(zhì)成分實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝以及細(xì)胞器的更新，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[1-3]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，細(xì)胞自噬功能可防止有毒或致癌物質(zhì)在胞內(nèi)的累積，抑制細(xì)胞癌變。近年來(lái)一些抗腫瘤藥物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的報(bào)道日益增多[4-9]。

研究結(jié)果證實(shí)，20(R)-人參皂苷Rg3能顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的增殖，且呈現(xiàn)良好的劑量、時(shí)間依賴性。采用GFP-LC3融合蛋白示蹤細(xì)胞自噬形成，利用Western Blot法檢測(cè)自噬體膜上LC3-II/I比值的變化以此評(píng)價(jià)20(R)-人參皂苷Rg3誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞自噬水平，本研究為20(R)-人參皂苷Rg3用于臨床乳腺癌治療打開(kāi)新的思路。

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Objective To observe effect of autophagy of 20(R) - ginsenosides Rg3 on human breast cancer cell (MCF-7) and best dose of 20(R) -Rg3 ginsenosides induced MCF-7 autophagy function. Methods Human breast cancer cell lines was divided into experimental group of 20(R) -ginseng saponin Rg3 and the control group. Observe growth-inhibition of 20(R)-Rg3 ginsenosides on MCF-7 cell by MTT and according to the IC50 calculated determine the effective concentration of 20(R)-Rg3 ginsenosides. Results The MCF - 7 cell growth inhibition rate is highest and increases with the increasing of 20(R)-Rg3 ginsenosides concentration when the concentration of SPG-Rg3 was from 37.5 to 600.0mg/L.the cell growth was greatly inhibited compared with control group (P＜0.05).Increasing of cell autophagy bubble was observed under fluorescence microscope, which showed that 20(R)-Rg3 ginsenosides could induce autophagy breast cancer cells. Results showed that the expression of LC3 proteins, especially LC3-II was positively associated with the degree of cell autophagy, with 20(R) - ginseng saponin Rg3 intervention with the increasing of concentration and amount of LC3-I and LC3-II protein expression also increased significantly by protein imprinting method , there was difference compared with control group (P＜0.05). Conclusion 20(R)-Rg3 ginsenosides could inhibit the MCF-7 cell proliferation, and good dose and time relation of MCF-7 cell autophagy induced by 20(R)-Rg3 ginsenosides.

20(R)-Rg3 ginsenosides; Human breast tumor cells; Cell autophagy

江西 330003 南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院 （陳凱云 梁文麗）330000 南昌市第一醫(yī)院 （何潔）