肝癌患者與健康人外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增前后比例及分化亞型對(duì)比

馬 俊 趙浩亮 田 偉 賀杰峰 李高鵬

肝癌患者與健康人外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增前后比例及分化亞型對(duì)比

馬 俊 趙浩亮 田 偉 賀杰峰 李高鵬

目的 探討肝細(xì)胞癌（HCC）患者外周血的Vγ9Vδ2T細(xì)胞比例，成熟分化亞型與健康人的差別，經(jīng)體外擴(kuò)增后上述指標(biāo)的變化。方法 選取健康捐獻(xiàn)者（n=10）和HCC患者（n=20）的外周血共10mL，采用不連續(xù)密度梯度離心法分離單核細(xì)胞層，借助流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Vγ9Vδ2T細(xì)胞占總T細(xì)胞比例，成熟分化亞型，并在體外加入唑來(lái)膦酸和IL-2進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，12～14d后收集細(xì)胞再次檢測(cè)上述指標(biāo)。結(jié)果 培養(yǎng)前HCC組患者外周血中Vγ9Vδ2T細(xì)胞占總T細(xì)胞比例的平均值比健康人低（P<0.05，P=0.009），在經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后其比例明顯升高（P<0.0001），而在體外擴(kuò)增后患者與健康人的Vγ9Vδ2T細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，P=0.3408）?；颊遃γ9Vδ2T細(xì)胞的分化與成熟亞型作體外培養(yǎng)的前后對(duì)比發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后Tn、Tcm、Temra的比例較培養(yǎng)前有明顯下降（P<0.05，P=0.0045，P=0.0236，P=0.0162）；患者和健康人Tem比值均較培養(yǎng)前明顯升高（P<0.0001）；而在擴(kuò)增前、擴(kuò)增后患者和健康人的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的成熟分化比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 肝癌患者外周血Vγ9 Vδ2T細(xì)胞比例雖然低于健康人，但其分化成熟亞型的分布比例與健康人相似，且經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后Vγ9Vδ2T細(xì)胞和總效應(yīng)細(xì)胞比例，均與健康人無(wú)差異。其增殖功能得到恢復(fù)，肝癌患者和健康人中應(yīng)用這種體外擴(kuò)增方法外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞的效果相似。

肝細(xì)胞癌；Vγ9Vδ2T細(xì)胞；過(guò)繼免疫治療；唑來(lái)膦酸

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居前列[1]，雖然已逐步形成外科手術(shù)、局部消融治療，放化療、經(jīng)肝動(dòng)脈或門靜脈灌注化療等綜合治療模式，但是肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)問(wèn)題仍未完全解決。隨著分子免疫和生物學(xué)的發(fā)展，生物免疫治療日益受到關(guān)注，尤其是以γδT細(xì)胞為基礎(chǔ)的過(guò)繼性細(xì)胞治療免疫應(yīng)用在肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌等多種實(shí)體腫瘤的細(xì)胞和臨床實(shí)驗(yàn)中取得具有顯著療效而成為研究熱點(diǎn)[2]。

γδT細(xì)胞根據(jù)δ鏈的亞型可分為Vδ1 T細(xì)胞和以Vγ9Vδ2T細(xì)胞為主的Vδ2 T細(xì)胞。其中Vδ2 T細(xì)胞主要參與人體免疫反應(yīng)和防御功能。據(jù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子刺激而發(fā)生增殖和分化的功能不同，Vγ9Vδ2T細(xì)胞又可分為幼稚型(Tn，CD45RA(+)CD27(+))、中心記憶型[Tcm，CD45RA(-)CD27(+)]、效應(yīng)記憶型[Tem，CD45RA(-) CD27(-)]和終末分化型[Temra，CD45RA(+)CD27(-)]4型。其中Tem和Temra主要分布于感染及腫瘤組織部位，在人體內(nèi)抗感染和抗腫瘤免疫方面起主要作用[3]，稱之為總效應(yīng)型。而γδT細(xì)胞總效應(yīng)型的變化必然影響到其免疫功能的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者體內(nèi)持續(xù)存在嚴(yán)重的免疫抑制現(xiàn)象[4]，這種免疫抑制狀態(tài)是否和到γδT細(xì)胞有相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致肝癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，我們不得而知，所以本研究旨在將肝癌患者外周血的Vγ9Vδ2T細(xì)胞比例、分化亞型與健康人對(duì)比和分析，以期初步了解肝癌患者體內(nèi)的某些免疫狀態(tài)。并在體外使用唑來(lái)膦酸加IL-2擴(kuò)增γδT細(xì)胞[5]，并與健康人對(duì)比分析，了解肝癌患者外周血γδT細(xì)胞增殖能力和增殖后細(xì)胞亞型，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HCC患者（n=20）和健康捐獻(xiàn)者（n=10）在被告知知情同意書后登記入名單，患者納入標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)病理診斷或臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)（原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部）[6]確診的原發(fā)性肝癌患者，無(wú)全身免疫疾病，既往無(wú)全身化療史。材料：Ficoll分離液，美國(guó)GE Healthcare公司；GT-T551淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，日本TaKaRa公司；0.4% Trypan Blue Stain，美國(guó)Life Technologies公司；無(wú)菌PBS，武漢博士德生物工程有限公司；CD3-PC5，美國(guó)eBioscience公司；TCR-Vγ9-PE，CD45RA-FITC，CD27-PC7，美國(guó)BD Biosciences公司；TCR-γδ-FITC，美國(guó)Beckman Coulter公司；唑來(lái)膦酸，瑞士諾華制藥有限公司；IL-2，北京四環(huán)生物制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Vγ9Vδ2T細(xì)胞的分離 清晨取健康志愿者和HCC患者的外周血2份，每份5mL，3000轉(zhuǎn)/min(RPM)離心5min，用等量生理鹽水稀釋后，輕輕加于(Ficoll)淋巴細(xì)胞分離液(5mL)上，2000r/min離心20min，取中間層細(xì)胞，生理鹽水洗2遍后，計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 Vγ9Vδ2T細(xì)胞與分化表型鑒定 收集分離出的淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，每個(gè)樣本取100μL個(gè)2份，按抗體說(shuō)明書于第1管加入CD3-PC5抗體，TCRVγ9-PE抗體，TCR-γδ-FITC抗體；于第2管加入CD3-PC5抗體，CD45RA-FITC抗體，CD27-PC7抗體，4℃避光孵育20～30min，PBS洗2次，用PBS 500μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.3 Vγ9Vδ2T細(xì)胞體外培養(yǎng) 在山西省腫瘤醫(yī)院的特定GMP級(jí)實(shí)驗(yàn)室的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范條件下進(jìn)行細(xì)胞制備和培養(yǎng)，用GT-T551淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（添加滅活的自體血清，慶大霉素）進(jìn)行培養(yǎng)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1天加入唑來(lái)膦酸5μmol/L和人重組IL-2 1000IU/mL，每2～3天觀察細(xì)胞增殖情況，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況加入10mL新鮮培養(yǎng)基（含人重組IL-2 1000IU/mL），培養(yǎng)12～14d收獲γδT細(xì)胞。

1.2.4 培養(yǎng)后Vγ9Vδ2T細(xì)胞的鑒定和亞型檢測(cè) 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，再次采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行Vγ9Vδ2T細(xì)胞與分化表型鑒定，方法同前。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，配對(duì)樣本間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法，非配對(duì)樣本間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)方法，P<0.05（雙尾）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，健康人組10例全部培養(yǎng)成功，無(wú)細(xì)胞污染?；颊呓M20例有2例經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后細(xì)胞無(wú)擴(kuò)增，未能收獲細(xì)胞。HCC患者外周血中Vγ9Vδ2T細(xì)胞占總T細(xì)胞比例的平均值在培養(yǎng)前比健康人低（P<0.05），在經(jīng)過(guò)體外藥物擴(kuò)增培養(yǎng)后其比例明顯升高（P<0.05），與健康人相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1A、圖2。

2.2 Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化亞型分析 培養(yǎng)前測(cè)定患者外周血中Tn、Temra、Tcm、Tem的比例與健康人相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1B。在經(jīng)過(guò)體外藥物擴(kuò)增培養(yǎng)后與健康人相比，患者Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化亞型Tn、Temra、Tcm、 Tem的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1C。即在擴(kuò)增前、后患者和健康人2組之間的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的成熟分化比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而患者的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的分化亞型體外擴(kuò)增前、后對(duì)比發(fā)現(xiàn)。見圖1D。Tn的比例在培養(yǎng)后較培養(yǎng)前有明顯下降（P<0.05），Tcm比例在培養(yǎng)后較培養(yǎng)前下降（P<0.05），患者和健康人的Tem比值均較培養(yǎng)前明顯升高（P<0.05），患者和健康人的Temra比例均較培養(yǎng)前下降（P<0.05），總效應(yīng)型較擴(kuò)增前明顯升高（P<0.05）。見表1。

圖1 A 肝癌患者與健康人擴(kuò)增前、后Vγ9Vδ2T細(xì)胞/總T細(xì)胞比例；圖1B 肝癌患者與健康人擴(kuò)增前Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化亞型比例；圖1C肝癌患者與健康人擴(kuò)增后Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化亞型比例；圖1D 肝癌患者擴(kuò)增前、后Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化亞型比例(x×s，P＜0.05)

圖2 Vγ9Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增前后典型流式細(xì)胞圖

3 討論

腫瘤的發(fā)展不是獨(dú)立事件，其中免疫逃逸與免疫抑制對(duì)腫瘤的發(fā)展具有十分重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)在先天或獲得性免疫缺陷的患者中誘發(fā)或自發(fā)腫瘤的發(fā)生率明顯高于健康人，這個(gè)證據(jù)證明當(dāng)機(jī)體的免疫監(jiān)視和防御功能被抑制或低下時(shí)，可能發(fā)生患者體內(nèi)局部腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[7]。肝癌是一種免疫原性弱的腫瘤，其腫瘤細(xì)胞具有免疫逃避和對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用，機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)和免疫細(xì)胞會(huì)受到抑制和忽視腫瘤細(xì)胞，所以直接輸入具有直接特異免疫力的過(guò)繼性細(xì)胞治療可以避免患者機(jī)體內(nèi)的免疫抑制環(huán)境，而起到直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而且其可以與手術(shù)、化療、區(qū)域灌注化療、免疫調(diào)節(jié)劑等聯(lián)合或輔助使用，具有廣闊的前景[8]。

表1 肝癌患者與健康人擴(kuò)增前后Vγ9Vδ2T細(xì)胞/總T細(xì)胞比例，Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化亞型比例（x±s，%）

研究證實(shí)，磷酸抗原激活Vγ9Vδ2T細(xì)胞是目前γδ T細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤研究最常用方法[9]。Nicol AJ等[5]發(fā)現(xiàn)健康捐獻(xiàn)者的Vγ9Vδ2T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)同時(shí)使用唑來(lái)膦酸加上IL-2時(shí)會(huì)大量擴(kuò)增，但是對(duì)來(lái)自惡性腫瘤患者的Vγ9 Vδ2T細(xì)胞在體外擴(kuò)增其擴(kuò)增的倍數(shù)和擴(kuò)增比例是有差異的，他們將患有各種不同腫瘤如肺癌、腎癌、黑色素癌甚至轉(zhuǎn)移癌等患者按臨床效果評(píng)價(jià)體系分成高反應(yīng)和低反應(yīng)組，發(fā)現(xiàn)低反應(yīng)組在擴(kuò)增前后Vγ9Vδ2T細(xì)胞的比例、倍數(shù)與健康人和高反應(yīng)組相比明顯降低。而在擴(kuò)增前分化與成熟亞型對(duì)比上是有差異的，其Tn和Temra明顯高于健康人和高反應(yīng)組，并且提示其差異與Vγ9Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果有相關(guān)性，而高反應(yīng)組在擴(kuò)增前成熟分化亞型的比例分布和擴(kuò)增能力與健康人無(wú)差異，證明部分腫瘤患者體內(nèi)Vγ9Vδ2T細(xì)胞數(shù)量，亞型及功能與健康人一致。本研究采用相同的擴(kuò)增方法，結(jié)果提示肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞占總T細(xì)胞的比例比健康人低，提示肝癌患者體內(nèi)可能存在免疫抑制，而在培養(yǎng)后細(xì)胞比例與健康人無(wú)差異，提示Vγ9Vδ2T細(xì)胞在體外脫離免疫抑制后，其擴(kuò)增能力得以恢復(fù)。肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞成熟分化比例在培養(yǎng)前與健康人相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在培養(yǎng)前后患者和健康人的Vγ9Vδ2T細(xì)胞的成熟分化比例同樣差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明患者Vγ9Vδ2T細(xì)胞各分化亞型的擴(kuò)增能力與健康人無(wú)差異，而擴(kuò)增前后對(duì)比發(fā)現(xiàn)Tem顯著升高，Temra下降，而Tem和Temra之和，即總效應(yīng)型是升高的，且患者與健康人培養(yǎng)后比值無(wú)差異，說(shuō)明肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)后在殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞比值增加趨勢(shì)和程度與健康人一致，所以從具有殺傷腫瘤細(xì)胞功能的有效細(xì)胞比例上能夠在擴(kuò)增后與健康人達(dá)到相同的效果，上述結(jié)果與證明肝癌患者外周血中Vγ9Vδ2T細(xì)胞在脫離體內(nèi)免疫環(huán)境后經(jīng)體外使用唑來(lái)磷酸鈉和IL-2后其增殖能力得以恢復(fù)，其分化成熟亞型和比例與健康人無(wú)差異，這與NicolAJ等結(jié)果一致。

研究表明，肝癌患者外周血Vγ9Vδ2T細(xì)胞雖然在低于正常人的比例，但其分化成熟亞型與健康人相似，且經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，其比例分布趨勢(shì)與健康人無(wú)差異，說(shuō)明繁殖功能得到恢復(fù)，所以本文初步說(shuō)明HCC患者進(jìn)行體外Vγ9Vδ2T細(xì)胞是可行的，為未來(lái)過(guò)繼免疫治療的免疫細(xì)胞來(lái)源提供一定依據(jù)，當(dāng)然，培養(yǎng)后的細(xì)胞能否殺傷特異的肝癌腫瘤細(xì)胞，還需要做細(xì)胞共培養(yǎng)殺傷實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。另外外周T細(xì)胞的亞型很多，除了起到免疫防御的免疫識(shí)別和效應(yīng)細(xì)胞外，還有好多其他功能的細(xì)胞，比如具有免疫抑制作用的等調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)[10]等，作為存在于外周血中的重要的免疫抑制細(xì)胞，其在肝癌患者體內(nèi)的比例與健康人是否有差異，以及經(jīng)體外擴(kuò)增后Treg細(xì)胞是否也隨之大量擴(kuò)增從而起到更為嚴(yán)重的免疫抑制作用，這些情況我們均不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

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Objective To pride the difference of percentage, mature classifi cation of Vγ9Vδ2T cell in peripheral blood between patients with HCC and healthy people, the index changes after amplifi cation in vitro. Methods 10 mL were taken from the peripheral blood of HCC patients (n= 20) and healthy donors (n=10), Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by the discontinuous density gradient centrifugation. The delta 2 T cells mature and differentiate subtypes of Vγ9Vδ2Tcells were detect by using flow cytometry, Vγ9Vδ2Tcell were selectively cultured with zoledronate and human IL - 2, after 12-14 days cells were collected and tested the above indicators again. Results The average percentage ofVγ9Vδ2Tcell of total T cell in peripheral blood of HCC patients is lower than healthy people in front of the train (P<0.05, P=0.009), after in vitro augmentation training with drugs the proportion increased signifi cantly (P<0.0001).While Vγ9Vδ2Tcell’s percentage of patients and healthy people have no difference after amplification in vitro (P>0.05, P=0.3408). When differentiation and mature subtypes of Patient’s Vγ9Vδ2Tcell were compared between before and after culturing in vitro, we can found that the proportion of Tn, Tcm,Temra before training were signifi cantly lower than after the training (P<0.05, P=0.0045, P=0.0236, P=0.0162); and proportion of Tem before training were higher than after the training (P<0.0001). While differentiation proportion of mature t cells of the patients and healthy people had no statistical difference comparing amplifi cation of before with after. Conclusion While the percentage of Vγ9Vδ2Tcell of HCC patients in peripheral blood was lower than healthy people, but its matured subtypes are similar to those of healthy people. After amplifi cation in vitro the ratio of Vγ9Vδ2Tcells and total effective cells have no difference with healthy people. Its Function of amplifi cation can also restore. When applying this method to amplify Vγ9Vδ2Tcells of peripheral blood in vitro its effect is similar in HCC patients and healthy people.

Hepatocellular carcinoma;Vγ9Vδ2T; Adoptive cellular immunotherapy; Zoledronate

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.7.001

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（130313021-17） 國(guó)家自然青年科學(xué)基金（81201810） 廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2015A030313057)

山西 030032 山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院 （馬?。?山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院普外科 （趙浩亮 田偉 賀杰峰） 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（李高鵬）

趙浩亮 E-mail:haoliangzhao@hotmail.com