補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織海馬區(qū)CXCR4-PI3K生物學(xué)自噬軸的作用

仇志富，吳曉光*，丁　方，時召平，李蒙蒙，江思瑜，梁　嬋，趙興龍

1.承德醫(yī)學(xué)院(河北 承德 067000) 2.承德市中醫(yī)院藥劑科(河北 承德 067000)

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補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織海馬區(qū)CXCR4-PI3K生物學(xué)自噬軸的作用

仇志富1，吳曉光1*，丁方1，時召平2，李蒙蒙1，江思瑜1，梁嬋1，趙興龍1

1.承德醫(yī)學(xué)院(河北 承德 067000) 2.承德市中醫(yī)院藥劑科(河北 承德 067000)

【摘要】目的探討補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠CXCR4-PI3K自噬軸的影響及其機(jī)制。 方法健康SD雄性大鼠72只按照Rosenberg法復(fù)制腦出血大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組，每組各18只，補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組分別采用補(bǔ)陽還五湯、銀杏葉片灌胃，假手術(shù)組及模型組給予等劑量的生理鹽水。采用免疫組化法(ELISA)檢測PI3K、AKT、SDF-1α、CXCR4蛋白，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組PI3K、AKT蛋白表達(dá)及SDF-1α、CXCR4陽性細(xì)胞數(shù)顯著增高(P<0.05)；模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組大鼠TUNE陽性細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)；補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組TUNE陽性細(xì)胞較模型組顯著減少(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)陽還五湯能夠激活CXCR4-PI3K自噬軸，既能夠激發(fā)細(xì)胞自噬，又能夠調(diào)控細(xì)胞自噬狀態(tài)，實現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的腦保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】腦出血；補(bǔ)陽還五湯；CXCR4-PI3K自噬軸

腦出血發(fā)生后，自噬活動在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中的作用不容忽視。已有研究發(fā)現(xiàn)[1]，SDF-1α/CXCR4生物學(xué)信號軸不僅是腦出血后神經(jīng)修復(fù)的重要通路，也是自噬活動的其中一種，在腦出血后的細(xì)胞凋亡與神經(jīng)保護(hù)中起到積極作用。SDF-1α/CXCR4生物學(xué)軸在被激活的同時又激活了CXCR4-PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路，從而通過自噬調(diào)節(jié)而實現(xiàn)腦保護(hù)的作用。由于PI3K磷酸化后參與的最重要信號通路為PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與自噬活動密不可分，其與SDF-1α/CXCR4生物學(xué)軸產(chǎn)生的CXCR4-PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路而實現(xiàn)腦保護(hù)作用[2]。補(bǔ)陽還五湯已證實是臨床上常用的有效的腦出血治療藥物[3]，但其對CXCR4-PI3K通路的影響卻鮮有報道，本實驗通過研究補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織細(xì)胞凋亡、PI3K/AKT通路及SDF-1α/CXCR4通路的影響從而探討其腦保護(hù)機(jī)制與CXCR4-PI3K自噬軸的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1藥物與儀器補(bǔ)陽還五湯(組方：黃芪120 g，歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g)；銀杏葉片(雙鶴藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20043536)；PI3K、AKT、SDF-1α、CXCR4兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)

1.2動物與分組成年健康清潔級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量280～320 g(北京維通利華實驗動物有限公司提供)。大鼠稱重編號后按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組，每組各18只，普通環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水。

1.3造模及干預(yù)腦出血大鼠模型的制備采用Rosenberg法[4]。以10%水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠后，立體儀上固定，頭部正中行縱行切口，將大鼠骨膜剝離，使其冠狀縫和前囟裸露，在前囟之前約2.0 mm，中線右側(cè)約3.0 mm處鉆一約1.0 mm直徑的小孔，以微量注射器從股動脈抽取適量的血液，借助立體定向儀沿鉆孔垂直進(jìn)針6.0 mm左右，緩緩注血80 μL，留針10 min后撤針，以消毒針縫合切口。假手術(shù)組僅裸露頸總動脈、神經(jīng)。在造模后第28 d起，補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組分別給予補(bǔ)陽還五湯26 g/(kg·d)、銀杏葉片3.5 mg /(kg·d)，銀杏葉片研成細(xì)粉以雙蒸水灌服，1次/d，連續(xù)灌胃給藥35 d，假手術(shù)組及模型組給予生理鹽水10 mL/kg，劑量及頻次同補(bǔ)陽還五湯組。

1.4 取材及指標(biāo)檢測末次給藥4 h之后，每組隨機(jī)選取6只大鼠，以乙醚麻醉斷頭處理，腦組織于10%乙醛(CH3CHO)置4℃冰箱固定48 h，石蠟包埋，冠狀切片厚度5 μm，常規(guī)脫蠟、酒精浸水。

1.4.1PI3K、AKT蛋白檢測切片用二甲苯脫蠟，以梯度酒精進(jìn)行浸水，采用枸緣酸鹽緩沖液微波法修復(fù)抗原，水洗以后，分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)，兔抗大鼠AKT(1∶100)多抗，于4℃下靜止12 h，以辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育30 min，DAB顯色之后以蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察， MiVnt圖形采集分析系統(tǒng)檢測PI3K、AKT陽性細(xì)胞吸光度的影響，計算結(jié)果取平均值，以PBS代替一抗作陰性對照。1.4.2 SDF-1α、CXCR4細(xì)胞數(shù)的檢測組織切片常規(guī)脫蠟浸水后3%雙氧水于室溫下20 min滅活內(nèi)原酶，微波修復(fù)抗原10 min，低價善養(yǎng)血清封閉液30min后滴加兔抗大鼠SDF-1α(1∶400)，兔抗大鼠CXCR4(1∶400)，37℃下靜置60 min后于4℃下靜置12 h，生物素化羊抗IgG于37℃下60 min后DAB顯色、蘇木素復(fù)染，分化后使其充分返藍(lán)，脫水透明封片。所有步驟均以0.01 moL/L PBS洗滌3次，每次5 min(封閉液除外)，用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對照。SDF-1α和CXCR4陽性染色均位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜之間，陽性細(xì)胞呈棕黃色。

1.4.3細(xì)胞凋亡的檢測采用TUNEL法，缺口末端原位標(biāo)記檢測法檢測細(xì)胞凋亡情況，腦組織蠟塊切片脫蠟之后，嚴(yán)格按照實際和操作說明進(jìn)行組織切片染色，陽性凋亡細(xì)胞核染色呈棕色。陽性凋亡細(xì)胞的數(shù)量定量分析：每個標(biāo)本取4張切片，每一張切片在其皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)的選取5個不同視野，于高倍鏡下(×400)計算陽性凋亡細(xì)胞數(shù)。

2結(jié)果

2.1PI3K、AKT蛋白陽性表達(dá)時的吸光度PI3K蛋白和AKT蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色物質(zhì)沉積，均位于胞漿上。與假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組PI3K、AKT顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組PI3K、AKT顯著增高(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠腦組織海馬區(qū)PI3K、AKT蛋白陽性表達(dá)時吸光度的改變± s，n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*：P<0.05；與模型組比較，△：P<0.05。

2.2SDF-1α、CXCR4陽性細(xì)胞數(shù)的變化與假手術(shù)組比較，模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于模型組(P<0.05)，見表2。

表2　各組大鼠腦組織海馬區(qū)SDF-1α、

注：與假手術(shù)組比較，*：P<0.05；與模型組比較，△：P<0.05。

2.3TUNE陽性細(xì)胞數(shù)比較假手術(shù)組大鼠大腦組織可見零星的、散在的TUNEL陽性細(xì)胞，TUNEL陽性細(xì)胞中大部分為神經(jīng)元，少部分為膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。模型組、補(bǔ)陽還五湯組、銀杏葉片組大鼠TUNE陽性細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)；補(bǔ)陽還五湯組和銀杏葉片組TUNE陽性細(xì)胞較模型組顯著減少(P<0.05)，見表3。

表3　各組大鼠腦組織海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，*：P<0.05；與模型組比較，△：P<0.05。

3討論

自噬是真核細(xì)胞降解的主要細(xì)胞保護(hù)途徑，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，與自噬密切相關(guān)的SDF-1/CXCR4生物學(xué)信號軸在腦出血所致的細(xì)胞神經(jīng)功能受損中發(fā)揮重要的生物效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[5]PI3K磷酸化后影響著自噬活動，是自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1與SDF-1/CXCR4信號軸聯(lián)系的焦點(diǎn)，因此具有代表性的PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無疑是自噬活動的積極參與者。

SDF-1/CXCR4信號軸與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過復(fù)雜過程形成CXCR4-PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路，對細(xì)胞自噬具有調(diào)節(jié)作用，SDF-1與CXCR4結(jié)合后能夠促進(jìn)G蛋白三聚體分離，形成Gβγ(G蛋白βγ亞單位)和Gαi(G蛋白αi亞單位)，兩者均可以激活下游信號通道的重要節(jié)點(diǎn)分子PI3K。當(dāng)CXCR4表達(dá)下調(diào)時，作為自噬啟動因子的PI3K mRNA和蛋白表達(dá)也隨之下調(diào)。CXCR4-PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路作用機(jī)制為：①PI3K可以與Beclin-1、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)結(jié)合而形成自噬核心復(fù)合體，同時形成完整的獨(dú)立膜；②由于自噬蛋白Atg5、Atg12、Atg16等參與，使獨(dú)立膜逐漸延伸，繼而將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)已經(jīng)損傷的或老化的細(xì)胞器完全包裹，形成自噬體；③自噬體在與溶酶體經(jīng)過錨定融合之后，能夠迅速形成自噬溶酶體；④由于蛋白水解酶的參與，融合而成的自噬溶酶體內(nèi)的細(xì)胞器會發(fā)生分解，生成氨基酸和游離型脂肪酸，諸多物質(zhì)可為細(xì)胞生存提供必須的物質(zhì)與能量；⑤SDF-1與細(xì)胞表面的配體CXCR4結(jié)合之后，促進(jìn)G蛋白三聚體解離為Gβγ和Gαi，進(jìn)而使PI3K活化[6-9]?？傊?，CXCR4-PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路既能夠激發(fā)細(xì)胞自噬，又能夠調(diào)控細(xì)胞自噬狀態(tài)。

銀杏葉片作為腦出血陽性對照藥得到學(xué)術(shù)界公認(rèn)，補(bǔ)陽還五湯灌胃給藥之后，腦出血模型大鼠腦皮質(zhì)區(qū)PI3K、AKT蛋白陽性吸光度明顯升高，與李峰等[10]的研究結(jié)果一致，提示補(bǔ)陽還五湯能夠激活腦出血大鼠腦組織的PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；SDF-1α、CXCR4陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，神經(jīng)凋亡數(shù)量顯著降低，與黎柏源等[11]的研究結(jié)果一致，提示補(bǔ)陽還五湯能夠激活腦出血大鼠腦組織的SDF-1α/CXCR4信號軸，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與SDF-1α/CXCR4信號軸通過復(fù)雜過程形成CXCR4-PI3K自噬信號傳導(dǎo)通路，補(bǔ)陽還五湯腦保護(hù)效應(yīng)的根本機(jī)制是激活了CXCR4-PI3K自噬信號傳導(dǎo)通路。補(bǔ)陽還五湯可通過對腦出血大鼠腦組織自噬活動產(chǎn)生影響來調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)功能，其深層機(jī)制可能與補(bǔ)陽還五湯激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，PI3K磷酸化導(dǎo)致靜息狀態(tài)的PI3K減少，而與其結(jié)合形成復(fù)合物的Beclin-1相應(yīng)減少，上調(diào)細(xì)胞自噬能力。

總之，補(bǔ)陽還五湯激活CXCR4-PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路，直接或間接影響自噬活動，繼而發(fā)揮腦保護(hù)效果。通過對CXCR4-PI3K自噬軸的激活能夠很好地治療腦出血所產(chǎn)生的神經(jīng)損傷，為治療腦出血提供新思路，然而，CXCR4-PI3K自噬軸激活后對于腦出血所致腦水腫現(xiàn)象是否會有所緩解？是否還有更加高效激活CXCR4-PI3K自噬軸的藥物存在仍然不得而知，需要今后進(jìn)行更深層次的研究。

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責(zé)任編輯：艾茜

Research on Effects of Buyanghuanwu Decoction on CXCR4-PI3K Biological Autophagy Pathway in the Hippocampus Area of Brain Tissue in Cerebral Hemorrhage Rats

Qiu Zhifu1,Wu Xiaoguang1*,Ding Fang1,Shi Zhaoping2,Li Mengmeng1,Jiang Siyu1,Liang Chan1,Zhao Xinglong1

(1.ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China;2.ChengdeTraditionalChineseMedicineHospital,Chengde067000,China)

【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of Buyanghuanwu Decoction on cxcr4-PI3K autophagy pathway in cerebral hemorrhage rats.Methods According to Rosenberg method cerebral hemorrhage rat model was replicated,nd Buyanghuanwu Decoction gavage was administered only on rats in Group of Buyanghuanwu Decoction.Immunohistochemistry method was used to detect the PI3K,Akt,SDF-1α,CXCR4 protein,cell apoptosis was detected by TUNEL method.Results Compared with model group,PI3K,and AKT protein expression and alpha SDF-1 and CXCR4 positive cells in Buyanghuanwu Decoction group and ginkgo leaf group were significantly higher (P<0.05);rats TUNE positive cells in model group,Buyanghuanwu Decoction group and ginkgo leaf group increased significantly when compared with those in control group (P<0.05);TUNE positive cells in Buyanghuanwu Decoction group and ginkgo leaf group decreased significantly when compared with those in the model group (P<0.05).Conclusion Buyanghuanwu Decoction can activate the cxcr4-PI3K autophagy pathway to the effects that it not only activates autophagy, but also regulates autophagy state to inhibit apoptosis of cerebral protective effect.

【Key words】cerebral hemorrhage; Buyanghuanwu Decoction;CXCR4-PI3K signal transduction pathway

基金項目2014年度河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(ZL20140193)。

作者簡介仇志富(1988- )，男，黑龍江綏化人，碩士在讀，研究方向：中藥治療腦病的理論基礎(chǔ)研究;*通信作者吳曉光，男，副教授，主要從事老年性腦病研究。

【中圖分類號】R285.5；R743.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1008-8164(2016)01-0016-04

收稿日期：2015-10-20