海洋細(xì)菌L1-9雙抗菌株的定殖能力及其對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用

王軍強(qiáng) 汪晶晶 王琦 馬桂珍 暴增海 王淑芳 周向紅

（淮海工學(xué)院化工學(xué)院，連云港 222005）

海洋細(xì)菌L1-9雙抗菌株的定殖能力及其對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用

王軍強(qiáng) 汪晶晶 王琦 馬桂珍 暴增海 王淑芳 周向紅

（淮海工學(xué)院化工學(xué)院，連云港 222005）

采用抗生素標(biāo)記法，對(duì)海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株進(jìn)行標(biāo)記，抗性菌株L1-9Str，rif對(duì)鏈霉素和利福平的抗性濃度分別為160 μg/mL 和20 μg/mL。雙抗菌株L1-9Str，rif的抑菌特性及其對(duì)鏈霉素和利福平的抗性經(jīng)多次傳代仍比較穩(wěn)定。盆栽試驗(yàn)表明，該雙抗菌株能在黃瓜根部土壤及根組織、莖基部、子葉和真葉組織中定殖。菌株L1-9Str，rif在黃瓜外根際、根際和根表土壤及黃瓜組織中的定殖動(dòng)態(tài)基本一致，初期黃瓜組織中L1-9Str，rif菌量較少，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌量逐漸增加，達(dá)到高峰后逐漸減少。菌株L1-9Str，rif在根表土壤中菌量最多（1.76×109CFU/g），其次是根際土壤，外根際土壤中菌量較少；在黃瓜組織中，菌株L1-9Str，rif其在子葉中的定殖能力最強(qiáng)（5.63×104CFU/g），其次是根和莖基部（0-2 cm）；調(diào)查至第26 d時(shí)在根部土壤中的含菌量仍保持在穩(wěn)定的水平，其中根表土壤中含菌量最高（2.41×107CFU/g），在黃瓜組織樣品中，子葉中的含菌量最高（4.15×104CFU/g）；溫室防病實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株L1-9和L1-9Str，rif菌株對(duì)黃瓜枯萎病具有良好的防治效果，不同時(shí)期防效均達(dá)70 %以上。上述結(jié)果表明來(lái)自海洋的多黏類芽孢桿菌L1-9菌株能在黃瓜根部土壤及幼苗組織中定殖，是一株有潛力的黃瓜枯萎病生防菌株。

海洋細(xì)菌；多黏類芽孢桿菌；抗生素標(biāo)記；黃瓜枯萎病；定殖

應(yīng)用有益微生物防治植物病害因其環(huán)保、安全、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物病害防治的重要手段，芽孢桿菌培養(yǎng)周期短，易發(fā)酵獲得而日益成為生防菌的優(yōu)勢(shì)菌源［1］。已報(bào)到的生防芽孢桿菌種類主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）等［2］。但不同菌株的定殖能力不同，具有較好的定殖能力是生防微生物發(fā)揮生防作用的重要條件之一，其定殖能力的強(qiáng)弱決定著生防作用的大小［3，4］。本課題組從連云港海域海泥中分離得到的多黏類芽孢桿菌L1-9菌株及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）等多種植物病原真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)小麥根腐霉病和番茄早疫病的防病效果明顯，而對(duì)大豆、小麥、黃瓜等作物的種子發(fā)芽、出苗和以及幼苗生長(zhǎng)安全，表現(xiàn)出了良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景［5-7］，但該菌株分離自海洋環(huán)境，能否在土壤中定殖是發(fā)揮生防效果的關(guān)鍵。

對(duì)環(huán)境中的目標(biāo)生防菌進(jìn)行定殖檢測(cè)是檢驗(yàn)其生防潛力的有效方法，其中抗生素標(biāo)記法［8，9］已成為研究生防菌在土壤和植物體內(nèi)定殖規(guī)律的一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法。該方法一般不會(huì)導(dǎo)致原始菌株重要特性的改變。楊洪鳳等［10］、王靜等［11］采用抗利福平標(biāo)記法研究了內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CC09菌株和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）AR03在小麥葉部和煙草根部及根際土壤中的定殖規(guī)律；游春平等［12］使用利福平和青霉素雙抗標(biāo)記法證明拮抗細(xì)菌Bio-d5在香蕉土壤中有較好的定殖能力。有關(guān)來(lái)自于海洋的生防菌株的定殖規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探討來(lái)自海洋生防菌株在環(huán)境中的定殖規(guī)律及其生防效果，本研究通過(guò)盆栽試驗(yàn)測(cè)定海洋多粘類芽孢桿菌對(duì)黃瓜枯萎病的防病效果，采用雙抗標(biāo)記法明確來(lái)自海洋的生防多粘類芽孢桿菌L1-9菌株在黃瓜根及莖、葉內(nèi)的定殖情況，旨在為研究海洋細(xì)菌L1-9菌株的生防作用機(jī)理和效果評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種和培養(yǎng)基 多黏類芽孢桿菌（P. polymyxa）L1-9由本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域潮間帶海泥中分離獲得并保存。供試病原真菌黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 L1-9菌株培養(yǎng)保藏和抗藥性菌株的篩選 培養(yǎng)基為海水配制的PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，用海水定容至1 L；L1-9種子液和和發(fā)酵液的制備培養(yǎng)基為PD：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，用海水定容至1 L；病原真菌活化及抑菌試驗(yàn)用培養(yǎng)基為淡水配制的PDA培養(yǎng)基；黃瓜枯萎病菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基為麥粒砂培養(yǎng)基：麥粒40 g，水60 mL，砂100 g，pH自然。

1.1.3 抗生素及其溶液的配制 鏈霉素和利福平購(gòu)自上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司。稱取鏈霉素適量，置于棕色試劑瓶中，在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下加入適量無(wú)菌水溶解，用孔徑為0.22 μm 的濾膜過(guò)濾，配制成200 mg/mL鏈霉素母液。同樣稱取一定量的利福平，于棕色試劑瓶中加入二甲基亞砜溶解，用孔徑0.22 μm 的濾膜過(guò)濾，配制成50 mg/mL利福平母液，整個(gè)過(guò)程在黑暗條件下進(jìn)行。將配好的鏈霉素、利福平溶液裝入EP管中，避光4℃密封保存。

1.1.4 黃瓜種子及土壤 黃瓜種子：津春四號(hào)，購(gòu)自連云港市新浦區(qū)種子站佳園種子公司。土壤：取自連云港市花果山腳下新華村種植黃瓜土壤耕作層，過(guò)篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜枯萎病菌接種物的制備 裝有200 g麥粒砂培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接種培養(yǎng)4 d、直徑5 mm的黃瓜枯萎病菌菌苔6塊，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，粉碎按1∶1比例與無(wú)菌細(xì)砂混勻，即為黃瓜枯萎病菌接種物［13］。

1.2.2 海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株抗鏈霉素和利福平標(biāo)記 將液體培養(yǎng)24 h的L1-9菌株稀釋涂布在含有5 μg/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，長(zhǎng)出的單菌落再以同樣的方法，接種到含有10 μg/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，逐步提高鏈霉素的濃度，直到L1-9菌株不能生長(zhǎng)，篩選出抗最高濃度鏈霉素的L1-9菌株突變菌株。采用同樣的方法，將篩選出的抗最高濃度鏈霉素的L1-9菌株依次接種在含高濃度鏈霉素，并同時(shí)加入不同濃度利福平的PDA培養(yǎng)基上，篩選出同時(shí)抗高濃度鏈霉素和高濃度利福平的L1-9雙抗菌株，在雙抗培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)10代，測(cè)定雙抗菌株的抗菌作用傳代穩(wěn)定性。

平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定L1-9菌株的雙抗菌株對(duì)禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、小麥根腐菌（B. sorokiniana）及黃瓜枯萎菌（F. oxysporum）等植物病原真菌的抑制作用，并測(cè)定雙抗菌株的抗性傳代穩(wěn)定性。

1.2.3 L1-9標(biāo)記菌株發(fā)酵液的制備 L1-9標(biāo)記菌株在含鏈霉素和利福平的PDA斜面上培養(yǎng)24 h后，用PD培養(yǎng)液洗下菌苔，制備濃度為5 ×108CFU/mL 的菌懸液作為種子液，按8%的接種量接種到裝有50 mL含鏈霉素和利福平的PD培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速180 r/min，28℃下振蕩培養(yǎng)24 h，制備成濃度為109CFU/mL的菌懸液［13］。

1.2.4 標(biāo)記菌株L1-9Str，rif在土壤和黃瓜根、莖、葉組織中的定殖及防病效果 采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)的方法，L1-9標(biāo)記菌株和原始菌株發(fā)酵液分別與土壤混和，使土壤中L1-9標(biāo)記菌株和原始菌株的含量為109CFU/g，分別為處理1和處理2，以等量的L1-9標(biāo)記菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基為對(duì)照1（CK1）和對(duì)照2（CK2），每個(gè)口徑為10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽裝土200 g，播種黃瓜種子5粒，采取上覆下墊方式接種黃瓜枯萎病菌接種物5 g，每個(gè)處理和對(duì)照播種50盆，播種當(dāng)天開(kāi)始，每隔3 d取黃瓜根際、外根際和根表土壤以及黃瓜根組織、莖、子葉和真葉組織，每次取黃瓜5株。采集根際土及根表土參考涂璇等人的方法［14］。

1.2.4.1 根際土 將同一處理的黃瓜幼苗輕輕拔起，稍微抖動(dòng)下，使根上大塊土壤脫落，用無(wú)菌紙包裹，輕輕揉搓，使依附在根上的土壤落在無(wú)菌紙上，充分混勻后即為根際土。

1.2.4.2 根表土及根組織 將取過(guò)根際土的黃瓜根系剪下，稱質(zhì)量為m1，后放入裝有石英砂和99 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在搖床上室溫振蕩30 min后取出根系，用吸水紙將其周?chē)乃治珊?，稱得質(zhì)量為m2，即為根系的質(zhì)量。根表土的質(zhì)量m=m1-m2。

采用含有鏈霉素和利福平的PDA平板對(duì)抗性菌株進(jìn)行回收，分別測(cè)定各樣品中L1-9標(biāo)記菌株的菌落數(shù)。出苗1周后開(kāi)始，每隔6 d調(diào)查黃瓜枯萎病的發(fā)病率，計(jì)算防病效果。

防病效果=（對(duì)照的發(fā)病率-處理的發(fā)病率）/對(duì)照的發(fā)病率*100%。

2 結(jié)果

2.1 L1-9菌株的抗性標(biāo)記

2.1.1 抗鏈霉素菌株的篩選 L1-9菌株在鏈霉素濃度為0-100 μg/mL的PDA平板上生長(zhǎng)較好，菌落密集；濃度為120-150 μg/mL時(shí)，菌落較稀疏，出現(xiàn)了單菌落，濃度為160-180 μg/mL時(shí)，出現(xiàn)明顯的單菌落，平板上的數(shù)量在10以下，鏈霉素濃度高于180 μg/mL時(shí)，L1-9菌株不能生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 L1-9菌株在不同濃度鏈霉素平板上的生長(zhǎng)情況

將在濃度為160-190 μg/mL鏈霉素的平板上生長(zhǎng)的L1-9菌株單菌落接種到含有高濃度鏈霉素的平板上連續(xù)培養(yǎng)，觀察不同時(shí)間L1-9菌株的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在鏈霉素濃度為190 μg/mL時(shí)無(wú)菌落長(zhǎng)出，濃度為180 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)24 h和48 h無(wú)菌落長(zhǎng)出，培養(yǎng)72 h有少量L1-9菌株菌落長(zhǎng)出，菌落較小，生長(zhǎng)較弱；在鏈霉素濃度為160和170 μg/mL的平板上，L1-9菌株在48 h長(zhǎng)出較好菌落，連續(xù)觀察菌落生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定。 因此，選擇鏈霉素濃度為160 μg/mL作為L(zhǎng)1-9菌株抗鏈霉素最佳濃度，用于進(jìn)行抗利福平菌株的篩選。

2.1.2 抗鏈霉素 L1-9菌株抗利福平的篩選 抗鏈霉素濃度為160 μg/mL的L1-9菌株在含有不同濃度利福平的平板上，隨著利福平濃度增加長(zhǎng)出的菌落數(shù)量明顯減少，利福平濃度為10、15、20 μg/mL的平板上L1-9菌株生長(zhǎng)良好，利福平濃度高于20 μg/mL時(shí)L1-9菌株不能生長(zhǎng)。通過(guò)抗生素濃度梯度篩選得到的L1-9菌株雙抗菌株命名為L(zhǎng)1-9Str，rif，對(duì)鏈霉素和利福平的抗性濃度分別為160 μg/mL和20 μg/mL。

2.1.3 雙抗菌株L1-9Str，rif的抗藥、抑菌和傳代穩(wěn)定性 L1-9Str，rif菌株在雙抗培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接傳代10次，仍然生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)特性穩(wěn)定，與原始菌株無(wú)差別；不同轉(zhuǎn)接代數(shù)對(duì)供試的禾谷鐮刀菌、小麥根腐病菌和黃瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)抑制作用，抑菌帶寬度無(wú)明顯差異（表2）。表明L1-9Str，rif菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可用于后續(xù)定殖研究。

表2 雙抗菌株L1-9Str，rif連續(xù)轉(zhuǎn)接10代對(duì)不同病原真菌的抑菌帶寬度（mm）

2.2 L1-9Str，rif菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用

從表3可以看出，標(biāo)記菌株L1-9Str，rif和原始菌株L1-9在不同調(diào)查時(shí)期對(duì)黃瓜枯萎病均有較好的防病效果，防效均高于70 %，兩菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防病效果無(wú)明顯差別。

表3 L1-9雙抗菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用

2.3 L1-9Str，rif菌株在黃瓜根際土壤和組織中的定殖

2.3.1 在黃瓜根部土壤中的定殖 用 L1-9原始菌株處理土壤的處理2以及相應(yīng)的L1-9Str，rif菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基對(duì)照組（CK1和CK2）處理的土壤，在雙抗平板上均未分離到L1-9菌株；用L1-9雙抗菌株發(fā)酵液處理土壤的處理1，在黃瓜幼苗根系的各部位土壤中均分離到了L1-9菌株，說(shuō)明L1-9菌株已被成功標(biāo)記，且雙抗菌株可用于海洋細(xì)菌L1-9菌株定殖規(guī)律研究。

從圖1可以看出，L1-9Str，rif菌株在根際、外根際和根表的定殖趨勢(shì)不同?？傮w根表土壤中的菌量最高，可達(dá)1.76×109CFU/g，其次是根際土壤，外根際土壤中的菌量較少。接種后0-7 d 的根際、外根際和根表土壤中L1-9Str，rif菌株的數(shù)量明顯下降，但7 d后根表土壤的菌量開(kāi)始增加，第10天菌量達(dá)到最高，為1.76×109CFU/g，其后開(kāi)始減少，第23天菌量較少；與根表相比，根際和外根際土壤中標(biāo)記菌株的數(shù)量增加較為緩慢，從10 d后才有所增加，第13天菌落數(shù)才得到最高，分別為2.88×108CFU/g和8.24×107CFU/g，其后逐漸減少。

圖1 雙抗菌株L1-9Str，rif在黃瓜土壤中的定殖規(guī)律

2.3.2 在黃瓜組織中的定殖 從圖2可知，從不同時(shí)期的黃瓜根、莖基部組織中均可以檢測(cè)到L1-9Str，rif，在不同部位黃瓜組織中的定殖趨勢(shì)類似。0-4 d不同部位組織的菌量較小，4 d后逐漸增加，至第13天、16天、20天根、子葉和莖（0-2 cm）中的菌量分別達(dá)到最高，分別為1.61×104CFU/g，5.63×104CFU/g，1.89×104CFU/g，隨后開(kāi)始緩慢下降，隨后趨于平穩(wěn)。至第23天，L1-9Str，rif菌株在子葉中的含菌量仍然保持較高水平，說(shuō)明L1-9Str，rif菌株在黃瓜組織中具有好的定殖能力。但L1-9Str，rif在不同組織中的菌量和達(dá)到高峰的時(shí)間明顯不同。L1-9Str，rif在子葉中的菌量最高，其次是根和莖基部0-2 cm組織，在莖基部2-4 cm組織中較少，在真葉的含菌量最低。

圖2 不同時(shí)期黃瓜組織樣品中L1-9菌株的分離結(jié)果

3 討論

生防菌能在根圍成功定殖是發(fā)揮生防作用的第一步，只有能夠在土壤和植物根部中定殖的生防菌才能在實(shí)際生產(chǎn)中具有使用意義。生防菌的定殖能力與其自身遺傳學(xué)特性和根部的分泌物相關(guān)，同時(shí)受植物和土著微生物種類及根際復(fù)雜的土壤環(huán)境等因素影響［15］。研究生防菌在植物根部的定殖能力，有助于認(rèn)識(shí)生防細(xì)菌的作用機(jī)制，提高生防細(xì)菌的防治效果。

趙新海等［16］研究發(fā)現(xiàn)多黏類芽孢桿菌LICC 10427在黃瓜葉面和土壤中第5天達(dá)到最大定殖量，分別為2.3×106CFU/g和1.6×107CFU/g，在20-30 d抗性菌株的數(shù)量基本上趨于穩(wěn)定，分別保持在0.9×106CFU/g和0.9×107CFU/g。海洋細(xì)菌L1-9菌株在根表土壤，根際土壤和外根際土壤中菌量最高分別為1.76×109CFU/g，2.88×108CFU/g和8.24×107CFU/g明顯多于LICC 10427菌株在土壤中的定殖量；而根、子葉和莖基部（0-2 cm）等黃瓜組織中的菌量最高分別為1.61×104CFU/g，5.63×104CFU/g和1.89×104CFU/g比LICC 10427菌株在黃瓜葉面的定殖量小，定殖量不同可能與環(huán)境和拮抗菌自身因素有關(guān)。本研究結(jié)果顯示至第26天時(shí)L1-9菌株在根部土壤中保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，其中根表土壤中含菌量最高（仍可達(dá)2.41×107CFU/g），在黃瓜組織樣品中，子葉的含菌量最高（4.15×104CFU/g），與LICC 10427菌株的定殖結(jié)果相一致，都在20 d后定殖量基本上趨于穩(wěn)定。

黃瓜枯萎病是一種維管束病害，枯萎病菌從根部侵染黃瓜，然后沿維管束向上轉(zhuǎn)移，因此該病害是一種比較難防治的病害。鐮刀菌非致病株F047之所以具有較高的防效，其中一個(gè)重要原因就是該菌株可在植株內(nèi)定殖，并且具有和枯萎病菌一樣的生態(tài)位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)枯萎病菌的營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位點(diǎn)，從而抑制病原菌的擴(kuò)展［17］。許多內(nèi)生菌，如拮抗菌biod5、內(nèi)生菌01-144和內(nèi)生菌BPT-18不僅能在植物表面的附著位點(diǎn)擴(kuò)展、繁殖，而且能在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移，并對(duì)特定部位有所偏好，表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和定殖能力，對(duì)維管束病害表現(xiàn)出良好的防治作用［18，19］。

本研究中海洋細(xì)菌L1-9菌株不僅可以在黃瓜根部土壤中很好定殖，而且可以在黃瓜組織中定殖，并隨著植株的生長(zhǎng)從根向莖、葉轉(zhuǎn)移，表明海洋細(xì)菌L1-9菌株具有較強(qiáng)的定殖能力和環(huán)境適應(yīng)性。該菌株對(duì)黃瓜枯萎病防治效果也比較明顯（可達(dá)70%）。關(guān)于海洋細(xì)菌L1-9菌株在田間環(huán)境條件下的適應(yīng)性和對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果尚需進(jìn)一步明確。

4 結(jié)論

海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株能在黃瓜根部土壤及幼苗組織中定殖，在根部土壤中根表土壤含菌量最高，第7天達(dá)最大1.76×109CFU/g，在其根、莖基部和子葉等幼苗組織中子葉的含菌量最高，第16天達(dá)最大為5.63×104CFU/g；至第26天時(shí)在根部土壤中的含菌量仍保持在較高的水平，其中根表土壤中含菌量最高（2.41×107CFU/g），在黃瓜組織樣品中，子葉中的含菌量最高（4.15×104CFU/g）；對(duì)黃瓜枯萎病具有較高的防治效果，達(dá)70 %以上，是一株有潛力的黃瓜枯萎病生防菌株。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Colonization of Double-resistance Strain of Marine Bacterium L1-9 and Its Biocontrol Effect on Fusarium Wilt of Cucumber

WANG Jun-qiang WANG Jing-jing WANG Qi MA Gui-zhen BAO Zeng-hai WANG Shu-fang ZHOU Xiang-hong
（School of Chemical Engineering，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005）

The Paenibacillus polymyxa strain L1-9 of marine bacterium was labeled by antibiotic marker，and strain L1-9Str，rifshowed the resistance to rifampicin and streptomycin at the concentrations of 160 μg/mL and 20 μg/mL，respectively. The antibacterial characters of doubleresistance strain L1-9Str，rifand its resistance to rifampicin and streptomycin were still stable after 10 times subculturing. The pot experiment showed that L1-9Str，rifsuccessfully colonized in cucumber rhizosphere soil，root tissue，stem base，cotyledon，and true leaves. The colonized dynamics of L1-9Str，rifin cucumber ecto-rhizosphere soil，rhizosphere and rhizoplane soil，and cucumber tissues were similar；the amount of L1-9Str，rifcolonized in cucumber tissue was little in the early stage，but increased gradually along with the cucumber growth，and reached a peak，then decreased gradually. The amount of L1-9Str，rifwas the most in rhizoplane soil（1.76×109CFU/g），the followed in the rhizosphere，while the least in ecto-rhizosphere soil. The detection of L1-9Str，rifin cucumber tissues showed that it was the most in cotyledons（5.63×104CFU/g），followed by its number in roots and stem bases（0 - 2 cm）. The amount of bacteria in the rhizosphere soil was still in a stable level at 26 d，and the quantity from rhizoplane soil was the highest with 2.41×107CFU/g. The quantity of bacteria in the cotyledons got the highest of 4.15×104CFU/g among cucumber tissue samples. The greenhouse test showed that both strain L1-9 and strain L1-9Str，rifhad favorable control effects onfusarium wilt of cucumber with the control efficacy over 70% at different stages. The above results indicated that strain P. polymyxa strain L1-9 may colonize in cucumber rhizosphere soil and tissues，and present a great potential for the bio-control of fusarium wilt of cucumber.

marine bacteria；Paenibacillus polymyxa；antibiotic marker；fusarium wilt of cucumber；colonization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.028

2015-09-16

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20141248），江蘇省高校自然科學(xué)重大項(xiàng)目（12KJA210001），連云港市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（CN1307），國(guó)家級(jí)大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（G201411641105002），江蘇省“十二五”高等學(xué)校水產(chǎn)類重點(diǎn)專業(yè)項(xiàng)目資助

王軍強(qiáng)，男，研究方向：生物化工；E-mail：873941442@qq.com

馬桂珍，女，博士，教授，研究方向：抗菌微生物及植物病害生物防治；E-mail：guizhenma@sohu.com