一株拮抗稻瘟病菌細菌的篩選與鑒定

管玲莉任佐華李俊俊劉二明

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙 410128；2. 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128）

一株拮抗稻瘟病菌細菌的篩選與鑒定

管玲莉1，2任佐華1，2李俊俊1劉二明1，2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙 410128；2. 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128）

生防微生物是一種具有開發(fā)創(chuàng)新和環(huán)境友好的防控稻瘟病策略，旨在發(fā)掘高效生防微生物資源。于2014年從湖南桃江山區(qū)一季稻感病品種湘早秈24號的感稻瘟病稻叢的健康稻株中分離出817株菌株，采用平板對峙法，篩選出1株對稻瘟病菌具有高效抑制作用的拮抗細菌JN005，通過菌絲生長速率法測定其活體菌代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌的抑菌率高達84%；并對另外5種植物病原真菌、4種植物病原細菌和大腸桿菌及金黃色葡萄球菌等11種菌作了抑菌譜測定。結(jié)果表明，JN005菌株對禾谷鐮刀菌、水稻稻曲病菌有較好的抑制作用，其抑制率分別為70.1%和73.6%。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將JN005菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

水稻；稻瘟病菌；拮抗細菌；分離；鑒定

水稻稻瘟病是由真菌稻瘟病菌Magnaporthe oryzae（無性世代為Pyicularia oryzae）引起的水稻災(zāi)害性病害，病害重的年份可造成減產(chǎn)40%-50%，甚至顆粒無收［1］。目前全世界水稻平均年總產(chǎn)量達到7.2億t［2］，超過30億以上的人口以稻米為主要糧食［3］，而中國水稻的年產(chǎn)量約2億t，達到世界稻谷總產(chǎn)量的28.6%，位居世界第一［2］。防治稻瘟病的主要手段是化學(xué)農(nóng)藥防治，但由于抗瘟水稻品種的單一性、稻瘟病菌生理小種的復(fù)雜多變及用藥不合理導(dǎo)致的病菌抗藥性，各藥劑田間防效不斷降低，與此同時還給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了不可忽視的嚴重危害［4］。生防微生物有許多優(yōu)于化學(xué)防治的優(yōu)點，如對人畜和天敵安全、與環(huán)境相容性好、活體生物建立種群后對有害生物可達到長期較穩(wěn)定的防控作用［5］并減緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生。生防細菌的研究與應(yīng)用已經(jīng)開展多年，國內(nèi)外研究者報道了眾多可以應(yīng)用于植物病害防治的不同的細菌菌株。目前報道研究應(yīng)用較多的植物病害生防微生物主要包括放線菌、真菌、細菌中的假單胞菌（Pseudomomnas）及芽胞桿菌（Bacillus）等，其中芽胞桿菌（Bacillus）是目前植物病害生防細菌研究中報道較多的一類［6］。芽胞桿菌防治植物病害的重要機制之一是其菌體及代謝產(chǎn)物可以引起寄主植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病性，其另一重要優(yōu)勢是能夠產(chǎn)生多種抗菌素和抗菌活性酶，具有很好的抗菌活性。目前生物防治研究存在著急需開發(fā)新的、高效的生防產(chǎn)品，提高生防制劑的有效性、實用性，降低生產(chǎn)、運輸與應(yīng)用成本等問題［7］。因此，從自然環(huán)境中分離獲得稻瘟病菌的拮抗菌株對水稻的防病增產(chǎn)及糧食安全問題具有重要意義。

本研究從湖南桃江山區(qū)一季稻感病品種湘早秈24號的感稻瘟病稻叢的健康稻株中篩選出一株對稻瘟病菌具有較好抑制作用的拮抗細菌 JN005，對其進行形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，并進行代謝產(chǎn)物拮抗作用測定，旨在為生防菌在稻瘟病防治的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

作物病原真菌6種，即稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、小麥赤霉病菌（無性為禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum）和辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；作物病原細菌4種，即水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、煙草青枯病菌（R. solanacarum）、柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas campestris pv. citri）和馬鈴薯環(huán)腐病菌（Clavibactermichiganense subsp. sepedonicum）；大腸桿菌（Escherichia coli）、 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp. aureus）。這12種菌均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室提供。

供試培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（NB）、燕麥片培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、需氧測定培養(yǎng)基、糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、V.P 培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、石蕊牛奶培養(yǎng)基，均按方中達及陳捷［8，9］的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 樣品的采集地點位于湖南省桃江縣大栗港鎮(zhèn)牌形上村（N28°31'49.02″，E111°54' 24.86″）。采樣即從感稻瘟病的稻叢中選出未患病的健康稻株，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的分離純化及篩選 將樣品剪成長為4-6 mm小段于滅過菌的研缽中研磨搗碎，加入10 mL無菌水，靜置30 min后，梯度（10-1-10-7）稀釋，每個梯度取 0.2 mL菌液涂布于NA平板上，每濃度涂平皿1個，重復(fù)3次，置于28℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待平板內(nèi)長出單菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落于新的平板上劃線純化。采用平板對峙法［10］測定待篩選的菌株對稻瘟病菌的拮抗作用，即在PDA平板中央接種1塊稻瘟病菌菌餅（直徑5 mm），待篩選菌株劃線接種于菌餅兩側(cè)，27℃倒置培養(yǎng)，以只接種稻瘟病菌菌餅的PDA平板為對照，每處理3次重復(fù)。待對照菌落接近長滿平板時，觀察實驗平皿中有無抑菌帶，留取抑菌帶明顯的平皿并測量抑菌帶的寬度。

1.2.3 JN005菌株的分類鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài)觀察及生理生化特性測定 參照東秀珠等［11-13］方法進行。

1.2.3.2 16S rDNA片段的擴增、序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用細菌基因組提取試劑盒（上海生工生物有限公司）抽提JN005菌株全基因組DNA，用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性2.5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank上進行BLAST。采用Mega5對JN005菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.4 JN005菌株抑菌譜測定 JN005菌株對各病原細菌的拮抗作用采用紙碟法［14］測定；對各病原真菌的拮抗作用采用平板對峙法［10］測定。

1.2.5 JN005菌株代謝產(chǎn)物拮抗作用測定 JN005菌株接種于NB中，在30℃ 200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液 10 000 r/min離心15 min，取上清液再經(jīng) 0.22 μm細菌過濾器過濾得到代謝產(chǎn)物。在加有JN005菌株代謝產(chǎn)物的PDA平板（V代謝產(chǎn)物∶VPDA培養(yǎng)基= 1∶4）中央接種稻瘟病菌菌餅（直徑5 mm），27℃ 倒置培養(yǎng)，以不加代謝產(chǎn)物并接種稻瘟病菌菌餅（直徑5 mm）的PDA平板為對照，每處理3次重復(fù)。待對照皿中菌落接近長滿平板時，采用菌絲生長速率法［15］計算抑菌率。

純生長量（mm）=菌落平均直徑-菌餅直徑

抑菌率（%）=［（對照菌落純生長量-處理菌落純生長量）/對照純生長量］×100%

2 結(jié)果

2.1 稻瘟病菌拮抗菌株的分離

本實驗從樣品中共分離獲得817個細菌菌株，其中有26個菌株對供試稻瘟病菌有拮抗作用，占總分離菌數(shù)的3.18%，拮抗效果明顯的（抑菌帶寬度超過7 mm）有7個菌株，其中JN005菌株抑菌帶寬度達到15.32 mm（圖1）。

圖1 JN005菌株對稻瘟病菌菌絲生長抑制效果

2.2 JN005菌株分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征鑒定 JN005菌株在NA培養(yǎng)基上28℃倒置培養(yǎng)48 h后，菌落形態(tài)不規(guī)則，邊緣隆起，中間凹陷，粗糙不透明，表面干燥，污白色或微黃色。JN005菌體呈桿狀，鞭毛周生，無莢膜，大小為（0.7-0.8）μm ×（2-3）μm（圖2），芽孢橢圓到柱狀位于菌體中央或稍偏，長0.5-1.0 μm，最適生長溫度28-30℃，革蘭氏染色為陽性，參照東秀珠等《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和布坎南等《伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,可鑒定JN005菌株為芽孢桿菌屬。

圖2 JN005菌株掃描電鏡照片

2.2.2 生理生化特征鑒定 JN005菌株對接觸酶（24 h）、V.P反應(yīng)等22項生理生化指標鑒定結(jié)果見表1。根據(jù)JN005菌株的生理生化特征，并結(jié)合掃描電鏡照片和菌落形態(tài)特征，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，將JN005菌株鑒定為枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌。

表1 JN005菌株的主要生理生化特征

2.2.3 JN005菌株的分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)測序，JN005菌株的16S rDNA 序列全長為1 601 bp（圖3），BLAST結(jié)果表明，JN005菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性最高，相似性為100%。用N-J法計算JN005菌株的16S rDNA全序列遺傳距離，并根據(jù)遺傳距離得到系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖4）顯示，JN005菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）處于一個大的分支內(nèi)，遺傳距離最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征對JN005菌株的鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌。

圖 3 JN005 菌株16S rDNA PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.3 JN005菌株的抑菌譜

JN005 菌株除了對稻瘟病菌抑菌效果突出外，對供試的另外12種病原菌也有不同程度的拮抗作用（表2）。其中JN005菌株對稻瘟病菌、稻曲病菌、禾谷鐮刀菌及辣椒炭疽病菌的抑菌率大于60%，拮抗效果較好；對金黃色葡萄球菌、柑橘潰瘍病菌、紋枯病菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌、白葉枯病菌、大腸桿菌具有一定的拮抗作用；但對水稻惡苗病菌、煙草青枯病菌沒有拮抗作用。

2.4 JN005菌株代謝產(chǎn)物拮抗作用

JN005菌株代謝產(chǎn)物對供試稻瘟病菌具有較好的拮抗作用，含有代謝產(chǎn)物的PDA平板上的稻瘟病菌菌落生長較對照組明顯被抑制，其中對照組稻瘟病菌菌落平均直徑達68 mm，實驗組稻瘟病菌菌落平均直徑僅為8 mm（圖5），抑菌率高達84%。

3 討論

圖4 JN005菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 JN005菌株對病原菌的拮抗作用

本研究從感稻瘟病稻叢的健康稻株中分離出817株細菌菌株，結(jié)合平板對峙法及代謝產(chǎn)物的菌絲生長速率法篩選出一株對稻瘟病菌具有較好抑制作用的拮抗細菌JN005，通過生理生化測定及16S rDNA分子序列分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中廣泛存在的動植物和土壤等環(huán)境中內(nèi)外生細菌，對人畜無害，不污染環(huán)境；其自身沒有致病性，只具有單層細胞外膜，能直接將許多蛋白分泌到培養(yǎng)基中；在營養(yǎng)缺乏的條件下，產(chǎn)生多種大分子的水解酶和抗生素，誘導(dǎo)自身的能動性和趨勢化恢復(fù)生長，并且具有生長快、營養(yǎng)簡單、能產(chǎn)生耐熱、抗逆芽孢等突出特征，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，加之批量生產(chǎn)工藝簡單，成本較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。國內(nèi)外先后開發(fā)出多種芽孢桿菌生防制劑應(yīng)用于多種病害的生物防治，取得了良好的效果［16］。如美國已有4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局（EPA）商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可，它們分別是GB03、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢桿菌變種（B. subtils var. amyloliquefaciens FZB24）［17］；我國利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的應(yīng)用研究也達到了世界先進水平，現(xiàn)已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的商品制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等［18］。此外，枯草芽孢桿菌還是防控稻瘟病菌的理想生物防治菌，F(xiàn)ilippi等［19］從水稻根際土壤分離到148株細菌，促生能力篩選實驗結(jié)果顯示18株細菌對稻苗有顯著促生作用。進一步對這些菌株對稻痕病菌的離體抑菌活性及溫室盆栽防效進行測定，獲得對稻葉痕防效最高的菌株rizo-46和rizo-55，防效最高可達90%-95%。Shan等［20］從原始森林土壤中分離得到一株甲基營養(yǎng)塑枯草芽胞桿菌Bacillus methylotrophicus BC79c離體抑菌實驗結(jié)果顯示該菌株能抑制許多植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)。溫室實驗表明，BC79發(fā)酵液對稻瘟病具有89.87%的防效。經(jīng)TLC與HPLC分析鑒定，其主要抑菌活性物質(zhì)為Phenaminomethylacetic acid。而本研究發(fā)現(xiàn)JN005菌株具有較強的拮抗水稻稻瘟病菌活性，其代謝產(chǎn)物對水稻稻瘟病菌的抑菌率高達84%，是稻瘟病生防菌的重要資源。

后續(xù)尚需對JN005菌株工業(yè)化最佳發(fā)酵條件優(yōu)化、劑型篩選、田間防治效果評價及作用機理等方面進行研究。

圖5 JN005菌株代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌的拮抗作用

4 結(jié)論

本實驗共篩選出7個對稻瘟病菌拮抗效果明顯的菌株，其中編號為JN005的菌株對稻瘟病菌的抑制作用最為突出，并且對稻曲病菌、禾谷鐮刀菌及辣椒炭疽病菌也有較好的抑制效果。綜合對JN005的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA測序分析，將其定名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。結(jié)果表明，該菌無論是菌株活體還是發(fā)酵液都都能明顯抑制稻瘟病菌的菌絲生長。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation and Identification of an Antagonistic Bacterial Strain Against Rice Blast Fungus

GUAN Ling-li1，2REN Zuo-hua1，2LI Jun-jun1LIU Er-ming1，2
（1. College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128；2. Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests，Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China，Changsha 410128）

It is quite important to develop novel and environment-safe strategies to control rice blast caused by Magnaporthe oryzae，and screening effective microorganism resources is primary basis for the bio-control of blast. Total 817 strains were isolated from healthy ones among diseased rice plants of the susceptible cultivar Xiangzaoxian 24，a single-season cropping rice，in the mountainous area of Taojiang，Hunan，in 2014. One strain JN005 with efficient antagonism to M. oryzae among 817 strains was screened by the plate confrontation method. The inhibition rate of metabolite from active bacterium to the rice blast reached 84% by measuring the growth rate of mycelium of the blast fungus. Further，antimicrobial spectrum of JN005 against 5 plant pathogenic fungi，4 plant pathogenic bacteria，and also Escherichia coli and Staphylococcus aureus sub. sp. aureus，was tested. The result revealed that JN005 also presented high inhibitory effect to Fusarium graminearum and Ustilaginoidea virens，and the inhibition rates to two fungi were 70.1% and 73.6%，respectively. Based on analysis of the morphological，physiological，and biochemical characteristics and the 16S rDNA phylogeny，strain JN005 was identified as Bacillus subtilis.

rice；Magnaporthe oryzae；antagonistic bacteria；isolation；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.024

2015-11-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203014），湖南省“十二五”重點學(xué)科（0904）

管玲莉，女，碩士研究生，研究方向：微生物資源利用；E-mail：978210965@qq.com

劉二明，男，博士研究生，研究方向：植物與病原物互作及作物抗病性遺傳多樣性利用；E-mail：ermingliu@163.com