油茶新炭疽病原Colletotrichum camelliae鑒定及致病性測定

李楊李河周國英劉君昂

（1. 中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學 森林有害生物防控湖南省重點實驗室，長沙 410004）

油茶新炭疽病原Colletotrichum camelliae鑒定及致病性測定

李楊1，2李河1，2周國英1，2劉君昂1，2

（1. 中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學 森林有害生物防控湖南省重點實驗室，長沙 410004）

油茶炭疽病菌能夠侵染油茶葉片、花及果實，造成嚴重落葉、落果，該病害是我國油茶最重要的病害之一。對采集于湖南、江西及海南的油茶炭疽病的病原菌進行了形態(tài)學觀察及多基因序列分析，同時對分離到的病原菌進行不同品種油茶致病性測定，結果表明，分離到的5株病原菌為山茶刺盤孢Colletotrichum camelliae，這是國內首次在油茶上發(fā)現該病原菌。經C. camelliae對不同油茶品種致病性測定，發(fā)現C. camelliae對湘林1號、湘林69號、湘林89號、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號、長林190號等品種的葉片致病，但是在不同品種葉片上出現癥狀的時間不同。

油茶；山茶刺盤孢；炭疽??；多基因序列；致病性

油茶（Camellia oleifera Abel）主要是指山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia L.）植物中油脂含量較高且具有栽培經濟價值的一類植物的總稱［1］，是原產于我國的食用木本油料樹種。袁嗣令等［2］發(fā)現油茶炭疽病可以引起油茶落花、落果，給茶農帶來極其嚴重的損失。近幾十年來，國內植物病害學者對油茶炭疽病做了大量的研究，普遍認為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）是引起油茶炭疽病的病原菌［3-12］。但是，隨著多基因序列鑒定病原菌方法的引入，可將形態(tài)學上很難區(qū)分的新種鑒定并從復合種中分離出來，大大提高了對炭疽屬真菌鑒定的準確率。例如，張海英等［13-16］通過形態(tài)學觀察及單基因序列分析，將中國草莓炭疽病的主要病原物鑒定為膠孢炭疽菌，而韓永超等［17］通過ACT、TUB2和CAL三個基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將武漢地區(qū)草莓根頸腐爛病的病原鑒定為膠孢炭疽菌復合種內的C. siamense［18］；楊友聯等［19］采用多基因譜系方法將膠孢炭疽菌復合種劃分成22個種和1個亞種；楊友聯結合形態(tài)學及多基因系統(tǒng)學，將采自中國貴州、云南、廣西等省的190株炭疽菌屬菌株確定為22個分類單元。李河等［20-22］利用形態(tài)學觀察及多基因分析方法，發(fā)現油茶炭疽病的病原除了膠孢炭疽菌外，還有果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）、暹羅刺盤孢菌（Colletotrichum siamense）及博寧炭疽菌（Colletotrichum boninense）。因此，有必要對油茶炭疽病致病菌進行進一步的研究，另外，油茶炭疽病菌對不同品種油茶致病性的研究在國內也鮮見報道。我們從湖南、江西及海南油茶產區(qū)采集病葉，對病原菌進行分離純化，通過形態(tài)學觀察并結合多基因序列分析方法，發(fā)現炭疽屬的山茶刺盤孢（C. camelliae）也可以使油茶致病，并進行該菌對湘林1號、湘林69號、湘林89號、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號、長林190號等12個品種油茶致病性的測定，旨在為防治該病菌引起的病害提供理論依據。

表1 引物及其退火溫度

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 于2014年10月從湖南瀏陽市、江西長埠鎮(zhèn)及官山林場采集典型油茶炭疽病病葉，2015年4月從海南澄邁林場采集典型油茶炭疽病病葉。

1.1.2 培養(yǎng)基［23］PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。SNA培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1.0 g，硝酸鉀1.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑 DNA快速提取試劑盒Fast DNA Kit，美國MPBIO公司；2×Taq PCRMaster Mix，天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 儀器 ABI 9700 PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；快速核酸提取儀，美國MPBIO公司；5145D離心機，德國Eppendoff公司；Nikon 80I顯微鏡，NIKON儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及純化 采用常規(guī)組織分離方法［23］進行病原菌分離和純化。分離得到的菌株于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌生物學鑒定 將菌株接種在PDA及SNA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)10 d，每天觀察記錄菌落形態(tài)，并測量菌落直徑。光學顯微鏡下觀察分生孢子和附著孢形態(tài)，并測量分生孢子大小。

1.2.3 病原菌DNA的提取、擴增及核苷酸序列測定 將純化好的菌株接種至PDA平板，28℃培養(yǎng)7 d，用無菌牙簽刮取適量菌絲放入1.5 mL離心管中，采用夏花等［24］的實驗方法進行病原菌DNA的提取。基因選擇及目的片段擴增與測序參照Weir等［18］的方法、反應體系及條件，實驗所用引物及相關內容見表1。PCR產物委托上海鉑尚生物技術有限公司測序。

1.2.4 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建 使用ClustalW軟件對測序獲得的3個基因分別進行比對和手工校正，然后按照ITS-CAL-GAPDH的順序分別首尾相連，并下載GenBank中同時含有上述3個基因序列的炭疽屬菌株的序列，按照ITS-CAL-GAPDH的順序首尾相連后進行同源性分析，用軟件MEGA6.0構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 致病性測定 選用湖南省種植廣泛的油茶品種“湘林1號”進行病原菌的致病性測定。用無菌牙簽蘸取分離到的5個菌株（編號見表2）的分生孢子懸浮液（105個/mL）后刺扎油茶葉，CK組用無菌水處理，置于室外套袋保濕培養(yǎng)，每個菌株接種30個葉片，CK組處理30個葉片。每天觀察葉片發(fā)病情況。對發(fā)病葉片再進行病原菌分離及與接種病原菌進行形態(tài)特征比較。

表2 分離菌株編號及其GenBank登錄號

圖1 炭疽菌菌株（CMHNYC15）的形態(tài)特征

1.2.6 病原菌對不同品種油茶致病性測定 為了明確分離到的病原菌對不同品種油茶的致病性，對湘林1號、湘林69號、湘林89號、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號、長林190號等12個品種（兩年生）葉片進行活體接種。接種方法同1.2.5。

2 結果

2.1 病原菌分離及形態(tài)學鑒定

從湖南、江西及海南三省油茶產區(qū)分離到5株形態(tài)特征疑似炭疽病原菌的菌株（編號分別為HNLY6-2、HNLY6-3、JXGS-B8、JXCB21、CMHNYC15），5個菌株在PDA培養(yǎng)基上形態(tài)特征相似（圖1），培養(yǎng)7 d時，菌落直徑約為6.5 cm，生長速率約為9.3 mm/d；菌落近似圓形，氣生菌絲稀疏，緊貼培養(yǎng)基，初期為白色，培養(yǎng)7 d后菌落中央由白色漸變?yōu)榛野咨?，菌落邊緣仍為白色；培養(yǎng)10 d時，黑色素大量沉積，致使整個培養(yǎng)皿背面變?yōu)楹谏?。在SNA培養(yǎng)基上，分生孢子無色、光滑，單孢，長橢圓形或圓柱形，兩端圓或一端略粗，另一端稍尖，大小為（13±3.5）μm×（3±2）μm；附著孢從菌絲上產生，末端膨大，呈不規(guī)則形狀，顏色較深（圖1）。

2.2 致病性測定

經致病性測定發(fā)現，在接種3-4 d后，病原菌可使油茶葉片表現發(fā)病癥狀，病斑初期呈褐色不規(guī)則斑塊，并逐漸擴展，漸變?yōu)樯詈稚蚝谏?，后期病斑呈灰色，病斑直?-18 mm（圖2-A）。經進一步病原菌分離，獲得與接種菌株一致的分離物，表明分離到的菌株為油茶炭疽病的病原菌。

2.3 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

5個菌株的編號及每個基因的GenBank登錄號見表2，5個菌株的ITS-CAL-GAPDH序列與GenBank下載的菌株序列的聚類分析結果（圖3）顯示，5個分離菌株與2株C. camelliae聚為一支，自展支持率為95%，能夠與炭疽屬其他種區(qū)分開；其它分支中，炭疽菌屬同種菌株也都以非常高的支持率聚為一個進化枝。結合菌株形態(tài)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，可將分離到的5株病原菌鑒定為山茶刺盤孢C. camelliae。

圖2 山茶刺盤孢（CMHNYC15）接種不同品種油茶葉片上的癥狀

表3 山茶刺盤孢對不同品種油茶葉片的致病性（顯癥時間/d）

2.4 病原菌對不同品種油茶致病性測定

不同品種油茶葉片接種實驗（表3）表明，C. camelliae均可侵染湘林1號、湘林69號、湘林89號、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號、長林190號等品種。其中，湘林1號、湘林69號、湘林89號、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號及長林190號等品種上的癥狀類似（圖2）；廣西紅花、贛無1、贛無16品種葉片上形成的病斑不易擴展，且10 d后病斑明顯比其他品種小。連續(xù)觀察發(fā)現病菌在不同品種葉片上出現癥狀的時間（3-10 d）不同（表3）。

3 討論

炭疽屬真菌危害全球多種植物，如谷物、蔬菜、水果等，給農民造成了嚴重的經濟損失。炭疽屬真菌早期主要依據形態(tài)特征進行鑒定，可用于鑒定的指標有分生孢子、附著孢的形狀及大小，以及剛毛、分生孢子梗和產孢細胞大小，菌核、后垣孢

子的有無及形態(tài)等。Von Arx［25］根據分生孢子的大小來界定種，將750多個種合并為11個種，使得一些種成為復合種或種群（Species group）；Damm等［26］將分生孢子梗實際應用于分類中，結合其它形態(tài)特征，很好地界定了草生彎孢類該屬真菌，引進了6個新的分類單元。20世紀90年代之后，隨著分子生物技術的發(fā)展，ITS序列在該屬真菌分子系統(tǒng)學研究中得到廣泛應用，為很多物種的鑒定和系統(tǒng)進化分析提供了有利的工具。例如，C. boninense最初基于形態(tài)特征被鑒定為C. gloeosporioides，而Moriwaki等［27］利用ITS序列進行系統(tǒng)分析，將其獨立為新的分類單元。然而Avise等［28］指出僅僅依靠ITS序列不能有效地進行種的識別，否則會導致錯誤的結論。此外，Crouch［29］也指出在GenBank所登錄的序列中，約有86%的炭疽屬真菌的ITS序列被錯誤定義。Cai等［30］提出采用多基因序列分析來對炭疽菌進行分子鑒定，這在一定程度上提高了對炭疽屬真菌的鑒定準確率。例如，Crouch［31］運用ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2四個基因進行聯合分析，對形態(tài)上極難識別的集合種C. gramincola區(qū)分開來，恢復C. cereale和C. eleusinsines為合格種，并引入了6個新種；Damm等［26］利用ITS、ACT、TUB2、CHSI、HIS3和GAPDH六個基因序列進行分析，將草本植物上的黑線炭疽菌區(qū)分開來，并引入了4個新種。

圖3 依據ITS-CAL-GAPDH 3基因合并序列用N-J法構建炭疽病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

目前已報道能侵染油茶的炭疽病原有膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、果生刺盤孢菌C. fructicola、暹羅刺盤孢菌C. siamense及博寧炭疽菌C. boninense。本研究從湖南、江西及海南3個省市油茶發(fā)病葉上分離到5株菌落形態(tài)特征一致的菌株，但與上述菌相比，在菌落顏色上，C. gloeosporioides、C. fructicola和C. siamense呈淺灰色至深灰色，C. boninense呈奶白色至橘紅色，而分離到的5株菌株菌落初期呈雪白色，7 d時菌落背面出現黑色素沉積，10 d后菌落漸變?yōu)榛野咨?，整個菌落背面呈黑色；報道的油茶炭疽菌的分生孢子堆顏色都為橘黃色，分生孢子形態(tài)橢圓形或圓柱狀、單胞、無色，菌絲附著孢橢圓形或不規(guī)則形，褐色，然而本研究分離的5株菌株在PDA上較難培養(yǎng)出分生孢子及附著孢，在SNA上，分生孢子長橢圓形或圓柱形，兩端圓或一端略粗，另一端稍尖，附著孢形狀不規(guī)則，顏色較深。通過形態(tài)學觀察及多基因序列分析，將本研究分離到的5株菌株鑒定為山茶刺盤孢C. camelliae。

本研究分離鑒定了一個新的油茶炭疽病病原——C. camelliae，通過研究C. camelliae對不同品種油茶致病性測定，發(fā)現C. camelliae對湘林1號、湘林69號、湘林89號、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號、長林190號等品種的葉片致病，但出現病斑的時間不同，這可能與油茶品種的抗病性有關。目前國內有關不同油茶品種對炭疽病抗性的研究報道較多，楊光道［32］通過林間調查及室內實驗，發(fā)現攸縣油茶、徽州大紅、徽州小紅、舒城大紅4個品種為抗炭疽病品種，并對不同油茶品種抗炭疽病機制進行了初步研究；匡蓉琳等［33］對14個油茶品種進行炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）接種實驗，發(fā)現廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶最為抗病，同時發(fā)現不同油茶品種的抗病性與油茶的凈光合速率、氣孔導度等生理指標相關；楊華等［34］對廣東省栽培的不同油茶種和品種進行林間調查及室內測定，發(fā)現廣寧紅花油茶屬于抗病種類。下一步將從形態(tài)結構、生理生化、分子生物學及抗性基因角度研究C. camelliae與不同品種油茶的互作機制，通過研究油茶品種與炭疽菌之間的關系，獲得抗炭疽病優(yōu)良品種，可為推進油茶產業(yè)的健康、快速發(fā)展提供重要的指導。

4 結論

本研究分離純化得到5株可引起油茶炭疽病的致病菌，利用形態(tài)學觀察及多基因序列分析，將其鑒定為山茶刺盤孢（Colletotrichum camelliae）。同時進行病原對不同油茶品種致病性測定，發(fā)現可使湘林1號、湘林69號、湘林89號、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號、長林4號、長林23號、長林53號、長林148號、長林190號等12個品種的葉片致病，且在不同品種油茶葉片上出現癥狀的時間不同。

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（責任編輯 馬鑫）

Identification of a New Anthracnose Pathogen Colletotrichum camelliae and Its Pathogenicity Test on Camellia oleifera

LI Yang1，2LI He1，2ZHOU Guo-ying1，2LIU Jun-ang1，2
（1. Key Laboratory for Non-wood Forest of Cultivation and Conservation of Ministry of Education， Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. Hunan Key Laboratory of Forest Protection，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

Anthracnose is one of the most critical diseases of Camellia oleifera in China because it infects the leaves，flowers and fruits of C. oleifera，leading to severe defoliation and pre-mature drop of fruits. Pathogens from anthracnose-diseased C. oleifera leaves collected in Hunan，Jiangxi and Hainan provinces were identified based on morphological observation and multiple-gene sequences，and pathogenicity test was conducted on various cultivars of C. oleifera. The results revealed that isolated pathogens were Colletotrichum camelliae，which is the first report on this pathogen in China. Pathogenicity tests on various cultivars showed that C. camelliae infected the leaves of different C. oleifera cultivars，such as Xianglin-1，Xianglin-69，Xianglin-89，Ganwu-1，Ganwu-16，Guangxi red flower，Changlin-3，Changlin-4，Changlin-23，Changlin-53，Changlin-148，and Changlin-190，however，spot appearances were different on the leaves of different C. oleifera cultivars.

Camellia oleifera；Colletotrichum camelliae；anthracnose；multiple-gene sequences；pathogenicity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.014

2015-07-22

國家自然科學基金項目（31170598）

李楊，男，碩士研究生，研究方向：植物病原微生物；E-mail：liyangcsuft@163.com

劉君昂，男，教授，研究方向：植物病原微生物；E-mail：928447959@qq.com