基于磁性分離測定水樣中的吲哚美辛

王 斌

核工業(yè)二〇三研究所，陜西 咸陽 712000

基于磁性分離測定水樣中的吲哚美辛

王 斌

核工業(yè)二〇三研究所，陜西 咸陽 712000

免疫磁性微球(SMPPA)應(yīng)用于水樣中吲哚美辛的分離富集，并應(yīng)用高效液相色譜法對吲哚美辛進(jìn)行測定。在優(yōu)化的淋洗和洗脫條件下，70%甲醇和10%甲醇分別作為洗脫液和淋洗液，其回收率能達(dá)到90%。選擇了湖水、河水、自來水、污水廠進(jìn)口水以及醫(yī)院排水為真實(shí)樣品進(jìn)行測定，其中湖水、河水、自來水3種真實(shí)水樣中未能檢測出吲哚美辛，污水廠進(jìn)口水以及醫(yī)院排水中吲哚美辛的含量分別為0.762、35.4 ng/mL。對這5種水進(jìn)行加標(biāo)回收吲哚美辛，加標(biāo)回收率為92.7%～113%，RSD為1.09%～7.73%。該方法具有簡便、快速、特異性等特點(diǎn)，能有效地分離富集水樣中的目標(biāo)物，對其他目標(biāo)物具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用價值。

免疫磁性微球；吲哚美辛；抗體；水樣

在過去數(shù)十年里，磁性納米粒子因其性能優(yōu)異和用途廣泛激起了科研工作者們廣泛的興趣。Fe3O4納米粒子的無毒性、強(qiáng)磁性、制備簡單等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的研究[1]，已經(jīng)在生物分離[2-3]、污染物去除[4-5]、藥物傳遞[6-7]、醫(yī)學(xué)診斷[8-9]及治療[10-11]、分析化學(xué)[12-14]等各方面得到了應(yīng)用。

吲哚美辛作為一種非甾體類消炎藥廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎及頸椎疼的治療，其對人體有副作用并能在環(huán)境中長期穩(wěn)定地殘留。吲哚美辛的副作用影響在短時間內(nèi)并不明顯，但是，長時間積累以及生物富集后，會導(dǎo)致水生動物內(nèi)分泌失調(diào)，生長抑制以及細(xì)胞中毒[15]。隨著人們生活水平的提高，環(huán)境安全意識的不斷加強(qiáng)，近年來，不斷有報道稱水中有毒有害的抗生素、消炎藥、生長素等，含量超過國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。所以建立一種快速、特異性方法來檢測水中的吲哚美辛非常必要。賀莉等[16]建立了酶聯(lián)免疫吸附分析方法測定環(huán)境水樣中的痕量吲哚美辛，此方法有很好的靈敏度和檢出限，但是需要專業(yè)的酶聯(lián)免疫吸附方法所需要的技術(shù)和設(shè)備，而且分析時間較長。研究擬以自制連接有吲哚美辛抗體的復(fù)合納米免疫磁性微球(SMPPA)[17]為分離載體，分離富集水中的吲哚美辛，通過高效液相色譜法快速、高效、特異性測定水中的吲哚美辛。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：BS 124S電子天平，426 HPLC Pump高效液相色譜儀(美國)，DZG-303A型純水機(jī)，KJ-201C型臺式震搖器，KJ-201C微量振蕩器。試劑有純度為99.9%吲哚美辛，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，其他未提及試劑均為分析純。

1.2 洗脫條件

洗脫條件在優(yōu)化條件過程當(dāng)中非常重要，是獲得良好回收率的保證。洗脫條件優(yōu)化是將目標(biāo)物用洗液洗脫以備檢測，而且還應(yīng)該考慮淋洗條件對免疫微球上固定抗體的影響。以50%～90%甲醇-水溶液作為洗脫溶液，選擇最佳洗脫條件。向含有20 mg粒子的PV管中加入2 mL含有50 ng吲哚美辛的溶液，震蕩吸附30 min后，以不同比例的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥后以0.2 mL甲醇定容轉(zhuǎn)移，以HPLC-UV測定回收率。

1.3 淋洗條件

為獲得較高的萃取率，同樣對淋洗條件進(jìn)行了優(yōu)化，淋洗條件需要在去除非特異性吸附的同時保持特異性吸附不受影響。實(shí)驗(yàn)以純水，PBS(0.01 mmol/L，pH=7.4)，甲醇-水(體積比為1∶9)，甲醇-水(體積比為2∶8)分別作為淋洗液。向含有20 mg粒子的PV管中加入2 mL含有50 ng吲哚美辛的溶液，震蕩吸附30 min后，分別用這4種淋洗液進(jìn)行淋洗，淋洗后，用最佳洗脫條件洗脫，收集洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后以0.2 mL甲醇定容轉(zhuǎn)移，用HPLC測定。作為對照，另一種未交聯(lián)抗體的粒子，用BSA封阻活性位點(diǎn)，其他實(shí)驗(yàn)條件相同。

1.4 真實(shí)樣品

5種水樣分別采自湖水、河水、自來水、污水廠進(jìn)口水、醫(yī)院排水。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，湖水、河水和自來水分別取100 mL清液加入1、2、5 mL 濃度分別為10、5、2 ng/mL的吲哚美辛溶液，總上樣量為10 ng。污水廠進(jìn)口水和醫(yī)院排水分別加入0.2、0.5、1 mL的50 ng/mL吲哚美辛溶液。用優(yōu)化的條件回收吲哚美辛，計算回收率。

1.5 HPLC條件

Alltech HPLC系統(tǒng)， UV-vis 201檢測器，液相色譜柱為Alltech C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為乙腈- 0.2%磷酸溶液(體積比為7∶3)，流速為0.9 mL/min，檢測波長為237 nm，柱溫為室溫。HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為10～500 ng/mL。其線性方程為y=25.493x+247.6，r=0.999 9。

1.6 方法檢出限

將10 ng的吲哚美辛分別稀釋于50、100、150、200、500 mL的純水中，在優(yōu)化的條件下測定回收率來評價方法的檢出限。

1.7 方法特異性

抗體的特異性決定了方法的特異性?？贵w的特異性已經(jīng)在相關(guān)文獻(xiàn)中有詳細(xì)研究[16]，不再在此累贅。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗脫條件優(yōu)化

抗體-抗原的結(jié)合力容易受到環(huán)境的影響，在強(qiáng)酸性、高溫和強(qiáng)堿性環(huán)境中，抗體將會不可逆失活而失去結(jié)合抗原的能力，弱酸性、弱堿性等緩沖溶液和有機(jī)溶劑也可以破壞抗體-抗原的相互作用，達(dá)到洗脫目標(biāo)物的目的?？紤]到吲哚美辛在水溶液中溶解度比較小而在甲醇中溶解度大，選用不同濃度的甲醇溶液作為洗脫條件，考察了甲醇含量為50%～90%的水溶液作為洗脫液的洗脫效果，見圖1。

圖1 洗脫條件優(yōu)化

如圖1所示，用3 mL 50%甲醇洗脫，吲哚美辛的回收率僅為86%，當(dāng)甲醇含量大于60%時，3 mL 洗脫液可以使回收率達(dá)到96%以上，為了盡量將粒子上的吲哚美辛完全洗脫且盡量減少對抗體的影響，研究選用70%甲醇作為洗脫條件。

2.2 淋洗條件的優(yōu)化

粒子表面修飾了抗體，抗體對抗原為特異性吸附，而復(fù)合磁性粒子表面也存在非特異性的吸附，非特異性的存在將雜質(zhì)帶入測量中，直接影響后續(xù)測定，必須采用合適途徑去除非特異性吸附，達(dá)到富集純化目的，選取20%甲醇、10%甲醇、PBS、純水為淋洗條件，其淋洗效果如圖2所示。

圖2 優(yōu)化淋洗條件

如圖2所示，選用PBS和純水為淋洗液時，吲哚美辛的回收率在90%左右，大約10%的吲哚美辛因?yàn)榉翘禺愋晕奖槐Ａ?。采?0%甲醇溶液淋洗，吲哚美辛回收率達(dá)到95%以上，當(dāng)甲醇含量達(dá)到20%時，回收率降低至86%。說明20%的甲醇對特異性吸附造成了影響。采用10%、20%的甲醇溶液作為淋洗液，不存在非特異性吸附現(xiàn)象。所以我們選用10%甲醇作為淋洗液，它能夠完全除去非特異性吸附，且不影響復(fù)合磁性粒子吸附目標(biāo)物。

2.3 環(huán)境水樣測定

5種水樣收集后放置于室溫沉淀24 h以上，除去沉淀，取上層清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取湖水、河水以及自來水樣品各100 mL在優(yōu)化的條件下直接測試，3個樣品均未能檢測到吲哚美辛，對其進(jìn)行加標(biāo)回收，分別向100 mL真實(shí)樣品中加入1、2、5 mL濃度分別為10、5、2 ng/mL的吲哚美辛溶液，總上樣量為10 ng，加標(biāo)后水樣中吲哚美辛濃度為0.1 ng/mL。取污水廠進(jìn)口水和醫(yī)院排水10 mL進(jìn)行同樣的測試，檢出量為76.2、35.4 ng，即吲哚美辛含量分別為0.762、3.54 ng/mL。分別向污水廠進(jìn)口水和醫(yī)院排水加標(biāo)0.2、0.5、1 mL 50 ng/mL吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)溶液，測試回收率。5種樣品的測試結(jié)果及回收情況如表1所示，其平均回收率為92.7%～113%，RSD為1.09%～7.73%。滿足測試要求。說明所制備SMPPA成功萃取了水樣中的吲哚美辛，可以在實(shí)際檢測中應(yīng)用。

2.4 方法的檢出限

不同濃度吲哚美辛的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，當(dāng)水中吲哚美辛濃度為0.2、0.1 ng/mL，吲哚美辛的回收率介于90%～110%之間，當(dāng)水中吲哚美辛的濃度為0.05 ng/mL時，回收率降低至78.68%，當(dāng)吲哚美辛的濃度降到0.02 ng/mL時其回收率僅僅為62.45%。主要是由于吲哚美辛在水中和復(fù)合粒子表面的抗體上存在一個動態(tài)平衡，濃度越低分配在水中的吲哚美辛就越多，從而使回收率偏低。由回收率的情況來看，這種方法的檢出限可以達(dá)到0.1 ng/L的級別。

表1 真實(shí)樣品中萃取吲哚美辛

注：“—”表示未檢出。

表2 不同濃度吲哚美辛的回收率

3 結(jié)論

SMMPA用來萃取水中的吲哚美辛，在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，能夠很好地回收吲哚美辛，在優(yōu)化的淋洗和洗脫條件下，5種水樣的加標(biāo)回收率為92.7%～113%，RSD為1.09%～7.73%，滿足分析要求，方法的檢出限優(yōu)于0.1 ng/L。這種方法能夠特異性的、快速、簡單分離富集水中的吲哚美辛，作為一種分離富集工具具有實(shí)際意義，并有普遍應(yīng)用性。

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Detection of Indomethacin in Water Sample Based on Magnetic Separation

WANG Bin

No.203 Research Institute of Nuclear Industry，Xianyang 712000,China

Immunonogic magnetic microsphere was used to separate indomethac(IDM) from water sample. Under the optimized conditions, 70% of methanol and 10% of methanol were selected as eluant and washing solution respectively. Lake water, river water, tap water, imported water to sewage plant, drainage of hospital were choose as real sample. Indomethacin was not detected in lake water, river water and tap water，but 0.762 ng/mL and 35.4ng/mL in imported water to sewage plant and drainage of hospital. Recovery tests on this five kinds of water sample. The recovery rate of five kinds of spiked water samples was found to be 92.7%-113% with the relative standard deviations (RSD) of 1.09%-7.73%. This method is simple, fast and specificity for the separation and enrichment of target analyte(indomycin) from water samples. This separation technology would be applied for other compounds.

immunonogic magnetic microsphere;indomethacin;antibody;water sample

2015-12-02;

2016-02-17

王 斌(1985-)，男，湖南漣源人，碩士，工程師。

X832.02

A

1002-6002(2016)05- 0116- 04

10.19316/j.issn.1002-6002.2016.05.22