大劑量鹽酸氨溴索對大鼠肺缺血再灌注損傷后的肺保護機制

楊　波，張衛(wèi)東，李小飛，王　榮，李建忠，李曉平，李明江，杜洪印，姜　濤

(1. 天津市第一中心醫(yī)院胸外科，天津　300192；2. 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸外科，陜西西安　710038；3. 西安交通大學航天航空學院，陜西西安　710049；4. 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管外科，黑龍江哈爾濱　150001；5. 天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津　300192)

?

◇基礎研究◇

大劑量鹽酸氨溴索對大鼠肺缺血再灌注損傷后的肺保護機制

楊波1，張衛(wèi)東1，李小飛2，王榮3，李建忠4，李曉平1，李明江1，杜洪印5，姜濤2

(1. 天津市第一中心醫(yī)院胸外科，天津300192；2. 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院胸外科，陜西西安710038；3. 西安交通大學航天航空學院，陜西西安710049；4. 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管外科，黑龍江哈爾濱150001；5. 天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津300192)

摘要：目的探討大劑量鹽酸氨溴索對大鼠肺缺血再灌注損傷后肺的保護作用以及可能的作用機制。方法將健康雄性SD大鼠60只隨機分成4組：對照組、氨溴索組、肺缺血再灌注(I/R)組、I/R+氨溴索組，每組15只。造模前分別給予大劑量氨溴索組和I/R+氨溴索組靜脈注射鹽酸氨溴索0.75 g/L，分別給予對照組和I/R組注射與上述氨溴索治療量等容量的生理鹽水。觀察肺組織病理學改變并評分，檢測濕干重比值(W/D)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細胞凋亡數目、核轉錄因子-κB(NF-κB)，Western blot方法觀察大鼠肺組織Toll樣蛋白4(Toll-like receptor 4, TLR4)信號通路的蛋白表達水平。結果與對照組相比，I/R組肺泡壁增寬，肺泡腔內可見出血等炎癥表現(xiàn)，W/D、炎癥因子顯著升高，肺組織W/D、IL-1β、TNF-α、凋亡細胞、NF-κB活性和TLR4信號通路相關蛋白表達水平明顯升高；與(I/R)組相比，I/R+氨溴索組肺泡腔內出血、水腫等炎癥表現(xiàn)減輕，W/D、炎癥因子、凋亡細胞顯著降低，肺組織NF-κB轉錄活性及TLR4信號通路表達水平明顯降低。結論大劑量鹽酸氨溴索通過下調TLR4信號通路發(fā)揮對缺血再灌注損傷大鼠的肺保護作用。

關鍵詞：大劑量鹽酸氨溴索；肺缺血再灌注損傷；肺保護；Toll樣蛋白受體4(TLR4)

隨著肺移植、心臟手術、心肺腦復蘇以及血栓溶栓治療的深入研究，肺缺血再灌注損傷(LIRI)及其所導致的肺功能障礙的發(fā)生機制和防治受到人們的高度重視。LIRI仍然是導致早期高發(fā)病率和晚期高死亡率最重要的原因[1-2]。大量臨床實驗研究證實，鹽酸氨溴索大劑量應用時可對肺臟發(fā)揮抗炎、抗氧化等保護作用[3-5]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，預先給予大劑量鹽酸氨溴索對大鼠肺移植術后急性肺損傷有重要的保護作用，而其具體機制尚不清楚[3]。本實驗擬進一步探討大劑量鹽酸氨溴索對大鼠LIRI后的肺保護作用，以及對Toll樣蛋白4/核轉錄因子-κB信號通路的影響，以期為其臨床應用提供更多的基礎理論和實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物健康的成年SD大鼠60只，均為雄性，由第四軍醫(yī)大學基礎動物實驗中心提供，體質量200～230 g。

1.2實驗儀器及試劑電熱恒溫干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)，顯微鏡(德國徠卡公司)，Western-blot蛋白電泳儀(Bio-Rad公司)，鹽酸氨溴索(勃林格殷格翰公司)，兔抗大鼠TLR4抗體(美國CST公司)，兔抗大鼠NF-κBp65抗體(美國CST公司)，兔抗大鼠β-actin抗體(美國CST公司)，免疫組化試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，ELISA試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立、分組及給藥健康成年雄性SD大鼠隨機分為對照組、氨溴索組、I/R組和I/R+氨溴索組，每組15只。氨溴索組和I/R+氨溴索組在造模型前30 min給予靜脈注射鹽酸氨溴索0.75 g/L，對照組和I/R組則注射與上述治療量等容量的生理鹽水。腹腔注射10 g/L戊巴比妥40 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術板上，經口氣管插管，并連接呼吸機，呼吸機輔助通O2(60%)，最高峰壓在10 cm H2O，最大呼氣末壓力為2 cm H2O，呼吸頻率60次/min，呼吸比2∶3，潮氣量為9 mL，這些參數可以排除其他原因導致的急性肺損傷[2,6]。胸部備皮常規(guī)消毒后鋪巾，無菌條件下取左側第4肋間前外側切口入胸腔，分離肌層，剪開胸膜,游離左肺門，尾靜脈注射肝素50單位，混合鹽水總體積500 μL，待5 min后肝素開始發(fā)揮作用時，以無創(chuàng)傷動脈夾夾閉肺門處血管，縫合切口，60 min后經原切口進胸，取出動脈夾，恢復血供，形成缺血再灌注。對照組全麻后方法同上，但不需夾閉肺門。

1.3.2肺組織濕/干重比值(W/D)立即獲取樣本右肺上葉稱濕重后70 ℃電熱恒溫干燥箱中烤24 h后為干重，計算肺組織W/D。

1.3.3大鼠缺血再灌注損傷肺組織的HE染色右肺中葉經過固定、包埋、切片、染色，光鏡下觀察各組肺組織病理學變化。

1.3.4ELISA對大鼠缺血再灌注損傷炎癥因子的檢測麻醉處死大鼠，結扎肺門，支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集大鼠炎癥因子，在4 ℃下灌洗液離心(1 000 r/min)5 min后取上清。根據產品說明書進行BCA蛋白定量。通過ELISA試劑盒檢測IL-1β和TNF-α的表達水平。

1.3.5TUNEL對大鼠缺血再灌注損傷凋亡細胞的檢測樣本經過二甲苯脫蠟、梯度乙醇、不含DNase的蛋白酶K和TUNEL檢測液孵育，最后用抗熒光淬滅封片液封片。隨意選取鏡下10個視野(×100)，分別計數凋亡細胞和總細胞數，根據公式凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數計算凋亡指數(AI)。

1.3.6免疫組化對大鼠缺血再灌注損傷NF-κBp65的檢測常規(guī)石蠟切片依次經過二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后，3 mol/L尿素消化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)進行抗原修復，新鮮配置30 mL/L H2O2封閉，滴加血清封閉液30 min，甩去血清，加一抗NF-κBp65(1∶150)，4 ℃冰箱孵育過夜，37 ℃復溫，滴加試劑B(生物素標記二抗)室溫37 ℃孵育45 min，PBS沖洗，試劑C(親和素)室溫37 ℃孵育40 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液避光顯色，8 min后中止顯色，水洗，再以蘇木素染色，依次經乙醇梯度脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。設置空白對照以PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.3.7Western blot對大鼠TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達水平的檢測肺組織加入細胞裂解液、充分勻漿，于4 ℃離心后，用BCA法進行蛋白定量，加上樣緩沖液并煮沸5 min，上樣10 μL，進行SDS-PAGE并轉移到PVDF膜上。滴加50 g/L脫脂奶封閉1 h后，分別滴加兔抗大鼠TLR4抗體、phospho-IκBα抗體NF-κBp65抗體以及β-actin抗體(室溫封閉1 h)及辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG二抗(室溫封閉1 h)。滴加ECL反應混合液，置入儀器觀察結果，分析灰度值。

2結果

2.1大劑量鹽酸氨溴索對大鼠肺組織W/D的影響與對照組(4.2±0.2)及氨溴索組(4.1±0.1)相比，I/R

組(7.4±0.3)肺組織W/D明顯升高，而I/R+氨溴索組(5.5±0.1)肺組織W/D明顯降低(P<0.05，圖1)。

圖1肺缺血再灌注損傷后大鼠肺組織濕干重比值(W/D)

與對照組及氨溴索組比較，*P<0.05。

2.2各組大鼠肺組織的病理學變化對照組和氨溴索組大鼠肺組織小葉結構清晰，肺泡腔內無明顯滲出，肺泡間質無明顯炎性浸潤，肺泡壁無明顯增厚；而I/R組大鼠肺泡壁增寬，肺泡間質有炎性浸潤，肺泡腔內可見大量出血和滲出等炎癥表現(xiàn)；I/R+氨溴索組大鼠肺泡壁明顯變薄，肺泡腔內出血量減少，炎性滲出減少(圖2)。

2.3大劑量鹽酸氨溴索對LIRI大鼠IL-1β和TNF-α炎癥因子的影響大鼠LIRI后，IL-1β和TNF-α炎癥因子的水平明顯升高;大劑量鹽酸氨溴索能顯著降低IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達水平(表1)。

圖2各組大鼠肺組織的病理學變化

Fig.2 Effect of ambroxol hydrochloride on pulmonary histopathologic changes of rats (HE, ×200)

A：對照組；B：氨溴索組；C：I/R組；D：I/R+氨溴索組。

表1ELISA檢測缺血再灌注損傷后大鼠IL-1β和TNF-α水平的變化

Tab.1 Effect of ambroxol hydrochloride on the expressions of IL-1β and TNF-α in BALF

±s, n=15)

與對照組及氨溴索組比較，*P<0.05。

2.4鹽酸羥考酮注射液對大鼠損傷肺組織凋亡細胞的影響TUNEL染色顯示，凋亡細胞的細胞核發(fā)出強烈的紅色熒光，I/R組凋亡指數為(31.22±2.04)%，與對照組[(1.27±0.58)%]和氨溴索組[(1.13±0.59)%]相比，凋亡細胞指數明顯升高；I/R+氨溴索組[(20.03±0.41)%]凋亡細胞指數顯著下降(P<0.05)。

2.5大劑量鹽酸氨溴索對大鼠NF-κBp65活性的影響肺組織NF-κBp65蛋白在對照組與氨溴索組胞質、胞核中幾乎無表達。與對照組相比較，I/R組NF-κBp65蛋白在胞質和胞核中表達量明顯增多，處于活化狀態(tài)；而I/R+氨溴索組NF-κBp65蛋白在胞質和胞核中表達量相對減少(圖3)。

圖3各組大鼠肺組織NF-κBp65的免疫組化結果

Fig.3 Expression of NF-κBp65 of lung tissues of rats with LIRI detected by Immunohistochemistry (×400)

A：對照組；B：氨溴索組；C：I/R組；D：I/R+氨溴索組。

2.6各組肺組織TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的表達水平對照組與氨溴索組中TLR4信號通路相關蛋白幾乎無明顯變化；I/R組中肺組織TLR4、phospho-IκBα以及NF-κBp65DNA binding的表達水平顯著增高(P<0.05)；而I/R+鹽酸氨溴索組上述信號通路蛋白表達水平相對降低(P<0.05，表2)。

表2Western blot檢測TLR4/NF-κB信號通路的蛋白含量

Tab.2Effect of ambroxol hydrochloride on the expression of TLR4/NF-κB signaling protein in lung tissues of rats with LIRI

±s，n=15)

與對照組及氨溴索組比較，*P<0.05，#P<0.05。

3討論

自1983年后，隨著現(xiàn)代外科的發(fā)展，盡管臟器的保存、外科手術操作和圍手術期處理有了很大的改進，但缺血再灌注損傷被認為是組織器官致傷的潛在重要因素，更是器官移植術后的常見并發(fā)癥[6-7]。進一步加深LIRI發(fā)生發(fā)展機制的認識以及針對損傷機制尋找新的醫(yī)療預防及治療思路是擺在臨床工作者面前亟待解決的難題。

TLR4是識別細菌脂多糖(LPS)、炎癥因子、活性氧的最主要受體，TLR4表達的水平決定著肺內炎癥反應的程度[8]。通過對TLR4-髓樣分化因子88(MyD88)的識別，使核轉錄因子-κB(NF-κB)活化，從而釋放大量細胞因子及炎癥介質，最終導致肺損傷。研究還發(fā)現(xiàn)，SARS冠狀病毒及H5N1禽流感病毒產生的氧化磷脂類(OxPAPC)同樣是重要的直接致?lián)p因素，而OxPAPC也正是通過觸發(fā)TLR4而進一步導致肺損傷的發(fā)生[9]。因此，在眾多致?lián)p因素導致肺損傷的機制中，TLR4通路都起到了關鍵作用。

已知TLR4/NF-κB信號傳導通路的激活是直接導致再灌注損傷的主要因素之一[8,10]。TLR4與MyD88樣銜接蛋白(MAL)聚集MyD88后，IL-1受體相關激酶 4 (IRAK4)與IL-1受體相關激酶1(IRAK1)在其下游聚集，IRAK1下游的腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)向下繼續(xù)作用在NF-κB激酶抑制物(IKK)α/β/γ復合物上，NF-κB被激活。激活后的NF-κB導致肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞釋放大量細胞因子及趨化因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、單核細胞趨化因子1(MCP-1)與人生長調節(jié)致癌基因α(GROα)[11]。若能阻斷TLR4/NF-κB信號傳導通路，調控炎癥反應的發(fā)生發(fā)展，可有效地減輕機體組織的損傷。

大劑量鹽酸氨溴索對LIRI的保護機制國內外報道較少。延續(xù)前期課題，本課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)，I/R+鹽酸氨溴索可減輕大鼠肺水腫，減少細胞凋亡數目，降低IL-1β和TNF-α水平表達，同時抑制NF-κB轉錄活性；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TLR4信號通路的相關蛋白表達水平顯著下降。表明大劑量鹽酸氨溴索可通過下調TLR4信號通路的表達，減少下游TRAF6作用于IKKα/β/γ復合物，從而抑制NF-κB的活化，最終緩解肺水腫、減輕炎癥反應，發(fā)揮保護肺泡上皮細胞的作用。

綜上所述，本實驗初步探討了大劑量應用鹽酸氨溴索對大鼠LIRI具有顯著的保護作用，為肺損傷后的恢復創(chuàng)造了有利條件。進一步發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB信號通路可能作為鹽酸氨溴索發(fā)揮保護作用的靶向調控位點，這為研究其臨床藥物的靶向治療提供新的指導價值。

參考文獻：

[1] ZHANG C, GUO Z, LIU H, et al. Influence of levosimendan postconditioning on apoptosis of rat lung cells in a model of ischemia-reperfusion injury[J]. PLoS One, 2015, 10(1):e0114963.

[2] 楊波，陳家寬，李文海，等. NDRG2在大鼠肺缺血再灌注損傷中的表達[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2013, 13(5):828-831,913.

[3] 李明江，張衛(wèi)東，王旭暉，等. 大劑量鹽酸氨溴索對鼠肺移植后急性肺損傷的影響[J]. 中華老年醫(yī)學雜志, 2012, 31(1):71-72.

[4] HUANG J, XU J, TIAN L, et al. A thioredoxin reductase and/or thioredoxin system-based mechanism for antioxidant effects of ambroxol[J]. Biochimie, 2014, 97:92-103.

[5] LU D, MA J, YANG X. Salmeterol combined with fluticasone propionate improved COPD in patients during stable stage[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(9):2907-2911.

[6] 楊波，張志培，姜鵬，等. N-myc下游調節(jié)基-2在大鼠腸缺血再灌注肺損傷中的表達及其與NF-κBp65的相關研究[J]. 創(chuàng)傷外科雜志, 2012, 14(6):543-546.

[7] YANG B, NI YF, WANG WC, et al. Melatonin attenuates intestinal ischemia-reperfusion induced lung injury in rats by up-regulating NDRG2[J]. J Surg Res, 2015, 194(1):273-280.

[8] ZHOU Z, ZHU X, CHEN J, et al. The interaction between Toll-like receptor 4 signaling pathway and hypoxia-inducible factor 1α in lung ischemia-reperfusion injury[J]. J Surg Res, 2014, 188(1):290-297.

[9] IMAI Y, KUBA K, NEELY GG, et al. Identification of oxidative stress and Toll-like receptor 4 signaling as a key pathway of acute lung injury[J]. Cell, 2008, 133(2):235-249.

[10] SHIMAMOTO A, POHLMAN TH, SHOMURA S, et al. Toll-like receptor 4 mediates lung ischemia-reperfusion injury[J]. Ann Thorac Surg, 2006, 82(6):2017-2023.

[11] YANG B, LI XP, NI YF, et al. Protective effect of isorhamnetin on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Inflammation, 2016, 39(1):129-137.

(編輯卓選鵬)

Protective effect of large dose of ambroxol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion injury in rats

YANG Bo1, ZHANG Wei-dong1, LI Xiao-fei2, WANG Rong3, LI Jian-zhong4,LI Xiao-ping1, LI Ming-jiang1, DU Hong-yin5, JIANG Tao2

(1. Department of Thoracic Surgery, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192;2. Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University,Xi’an 710038; 3. School of Aerospace, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049;4. Department of Cardiovascular Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001; 5. Department of Anesthesiology,Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effects of large-dose ambroxol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion injury (LIRI) and discuss the protection of ambroxol hydrochloride on Toll-like receptor 4 (TLR4)/nuclear transcription factor-kappa B (NF-κB) after lung ischemia-reperfusion injury in rats. MethodsWe randomly assigned 60 healthy SD rats into four groups (n=15 for each): control group, ambroxol hydrochloride group (0.75 g/L), ischemia-reperfusion group (I/R), and I/R+ambroxol hydrochloride group. The ambroxol hydrochloride group and I/R+ambroxol hydrochloride group were injected large dose of ambroxol hydrochloride by intravenous injection. The control group and the I/R group received normal saline. The effects of ambroxol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion (LIR)-induced pathological changes and inflammatory cytokines release level were examined. DNA ends situ labeling assay (TUNEL) was used to detect the apoptosis of cells. NF-κBp65 was detected by immunohistochemistry. In addition, the TLR4 signaling pathway activation in lung tissues was detected by Western blot analysis. ResultsCompared with those in the control group, some hemorrhage and inflammation changes of lung tissues were observed; the W/D ratio, inflammatory cytokines, apoptosis of cells, NF-κBp65 and TLR4 signaling pathway protein expression in I/R group was obviously increased. Compared with I/R group, some mild hemorrhage and inflammation changes of lung tissues were observed; W/D ratio, inflammatory cytokines, apoptosis of cells, NF-κBp65 activity, and TLR4 signaling pathway expression were all decreased significantly in I/R+ambroxol hydrochloride group. ConclusionLarge dose of ambroxol hydrochloride can protect rats with lung ischemia-reperfusion injury by downregulating TLR4 signaling pathway.

KEY WORDS:large dose of ambroxol hydrochloride; lung ischemia-reperfusion injury; lung protection; Toll-like receptor 4

收稿日期：2015-03-25修回日期：2015-12-24

基金資助：國家自然科學基金資助項目(No.81070062)；軍隊“十二五”課題(12MA208)

通訊作者：姜濤. E-mail: jiangtaochest@163.com；杜洪印. E-mail: duhongyin123@sina.com

中圖分類號：R655.3

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603014

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81070062) and the Military Medical Scientific Research Items of China (12MA208)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160411.1047.016.html(2016-04-11)