厭氧和好氧處理過程中四環(huán)素抗藥基因的豐度

任 佳,姚 宏,劉苗苗*,張 昱,楊 敏(.北京交通大學(xué)土木建筑工程學(xué)院市政環(huán)境工程系,水中典型污染物控制與水質(zhì)保障北京市重點實驗室,北京 00044；.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點實驗室,北京 00085)

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厭氧和好氧處理過程中四環(huán)素抗藥基因的豐度

任 佳1,姚 宏1,劉苗苗1*,張 昱2,楊 敏2(1.北京交通大學(xué)土木建筑工程學(xué)院市政環(huán)境工程系,水中典型污染物控制與水質(zhì)保障北京市重點實驗室,北京 100044；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點實驗室,北京 100085)

摘要：為了了解抗生素生產(chǎn)廢水不同處理過程(厭氧生物處理和好氧生物處理)中抗藥基因的行為,本文以兩種四環(huán)素(土霉素、金霉素)生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)為調(diào)查對象,采用PCR和實時定量PCR(qPCR)方法考察厭氧和好氧處理過程中常見的6種四環(huán)素抗藥基因(tet(A), tet(C), tet(G), tet(Q), tet(W), tet(X))及2種轉(zhuǎn)移因子(I型整合子intI1, 異常插入序列ISCR3)的豐度特征.結(jié)果表明,tet(C)在所有樣品中均未檢出,其它基因在所有樣品中檢出.四環(huán)素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥中tet(A)、tet(G)、tet(X)的相對豐度(與16S rRNA基因的比值)范圍為(1.25±0.16)×10-4～(4.52±0.002)×10-2,顯著低于好氧污泥[(9.88±0.67)×10-5～(2.70±0.29)×10-1],而tet(Q)、tet(W)在厭氧污泥中的相對豐度為(1.66±0.03)×10-2～(7.48±1.22)×10-2,比好氧污泥中[(1.94±0.12)×10-3～(2.85±0.16)×10-2]高1個數(shù)量級;轉(zhuǎn)移因子intI1和ISCR3在厭氧污泥中相對豐度范圍為(1.48±0.01)×10-3～(2.61±0.31)×10-2,顯著低于好氧污泥[(1.18±0.15)×10-1～(8.99±0.75)×10-1],表明厭氧處理過程中由這兩種轉(zhuǎn)移因子介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移潛力較小.研究表明,好氧處理促進了tet(A)、tet(G)、tet(X)的傳播,但對tet(Q)和tet(W)有控制效果,而厭氧處理過程與之相反.抗藥基因的分布與水平轉(zhuǎn)移因子、抗藥機制、群落結(jié)構(gòu)有關(guān).

關(guān)鍵詞：四環(huán)素生產(chǎn)廢水；四環(huán)素抗藥基因；轉(zhuǎn)移因子；厭氧處理；好氧處理

* 責(zé)任作者, 講師, lmmhit@163.com

隨著抗生素的大量生產(chǎn)和廣泛使用,其在環(huán)境中的殘留被頻繁檢出.抗生素殘留會誘導(dǎo)抗藥菌和抗藥基因的產(chǎn)生和增殖,威脅公共健康[1].人們已在污水處理廠[2]、養(yǎng)殖水域[3]、河流[4-5]、沉積物[5]和土壤[6-7]等環(huán)境中檢測出抗藥基因和抗藥菌.近年來,在中國、印度等地開展的研究發(fā)現(xiàn),抗生素生產(chǎn)廢水中有很高的抗生素殘留[8-9],遠(yuǎn)高于其它環(huán)境,如城市污水廠、河流等.

抗生素生產(chǎn)廢水是一種高濃度有機廢水,目前主要采用生物法進行處理.由于該系統(tǒng)中抗生素濃度高,選擇壓力大,同時微生物數(shù)量多,已成為抗藥基因的重要污染源[8,10-11].從某土霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)篩選的細(xì)菌中,94.2%攜帶四環(huán)素類抗藥基因(tet基因)[9].定量研究發(fā)現(xiàn),該系統(tǒng)中tet抗藥基因的相對豐度比城市污水廠高1～4個數(shù)量級[12].從某青霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)篩選的細(xì)菌中,17.3%(31/179)攜帶有β-內(nèi)酰胺類抗藥基因[13].某螺旋霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中檢測出8種大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽菌素(MLS)抗藥基因,其豐度比城市污水廠高1.4～2.3個數(shù)量級[14].

迄今為止,關(guān)于不同處理工藝中抗藥基因的差別已有一些報道,但尚未發(fā)現(xiàn)一致規(guī)律.某螺旋霉素生產(chǎn)廢水厭氧污泥中MLS抗藥基因的相對豐度低于好氧污泥[14].Tao等[15]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬廢水處理過程中,tet(A)和tet(W)在厭氧污泥中的相對豐度高于好氧污泥.此外,在某制革廢水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),磺胺類抗藥基因(sul1和sul2)、四環(huán)素抗藥基因(tet(G),tet(X))在厭氧污泥中豐度低于好氧污泥;四環(huán)素抗藥基因tet(M),tet(C)在厭氧污泥中豐度高于好氧污泥[16].Christgen等[17]比較了城市污水厭氧、好氧、厭氧-好氧處理過程中抗藥基因在水相中的去除情況,發(fā)現(xiàn)厭氧-好氧聯(lián)合處理具有最高的去除效果,但經(jīng)過好氧處理后,抗藥基因的比例升高.在城市污水廠剩余污泥消化過程中發(fā)現(xiàn),厭氧消化對抗藥基因的控制效果優(yōu)于好氧消化[18].不同處理工藝中抗藥基因的行為和機制尚不明確,需要進一步研究.

本文以內(nèi)蒙古某金霉素和某土霉素制藥廠生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)(厭氧-好氧組合工藝)為對象,使用PCR、實時定量PCR等方法調(diào)查了進水、出水、厭氧污泥、好氧污泥中tet基因的種類及豐度,比較了厭氧和好氧處理過程中tet基因的差異,分析了進水和出水中tet基因的變化,預(yù)期從抗藥基因控制角度為選擇制藥廢水處理工藝提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

表1 樣品信息及采樣編號Table 1 Sample information and number

于2013年7～12月對內(nèi)蒙古某金霉素和某土霉素制藥廢水處理系統(tǒng)進行了1～2次采樣.土霉素制藥廠(K廠)的土霉素產(chǎn)量為5000t/y,該廢水處理系統(tǒng)采用UASB + 生物接觸氧化池工藝;金霉素制藥廠(J廠)的金霉素產(chǎn)量為41500t/y,該廢水處理系統(tǒng)采用UASB + AO + CASS工藝.采集的樣品包括:處理系統(tǒng)的進水、出水;厭氧和好氧生物處理單元的活性污泥.此外以大豆蛋白發(fā)酵廢水處理系統(tǒng)為對照體系,該系統(tǒng)采用UASB +SBR處理工藝.每次采樣持續(xù)3d,每個采樣點每天取3個平行樣并均勻混合.對于污水和污泥樣品,分別取100mL和1mL樣品,4℃下10000r/min離心10min,將沉積物保存到-20℃,用于DNA提取.具體樣品編號及采樣信息見表1.

1.2 水樣分析

按照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[19]國家標(biāo)準(zhǔn)方法分析常規(guī)化學(xué)指標(biāo),測定了水樣的CODCr,氨氮,TP和TOC,測定均有3個平行,最后計算平均值.通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/ MS,Waters,USA)對系統(tǒng)中的土霉素、金霉素進行定量分析[9].

1.3 DNA提取及PCR

對于離心收集到的污水和污泥樣品,使用Fast DNA Spin Kit for soil (MpBio,美國)提取DNA.選取了6種tet基因(外排泵類tet(A)、tet(C)、tet(G)、核糖體保護類tet(Q)、tet(W)、酶修飾tet(X))[20]和2種轉(zhuǎn)移因子(intI1和ISCR3)進行了PCR擴增.擴增反應(yīng)采用50μL體系,包括5μL 10×PCR buffer、4μL dNTPs、20pmol/L上下游引物各1μL、1.25U Taq酶0.25μL、1μL 20mg/L牛血清蛋白溶液、37μL無菌水以及1μL DNA模板.樣品DNA濃度范圍為79.3～120.8ng/μL,稀釋10倍作為PCR模板,陰性對照以無菌水作為DNA模板.反應(yīng)條件為95℃解鏈7min;95℃解鏈35s,退火35s,72℃延伸45s(循環(huán)35次);72℃延伸10min,不同tet基因的引物及退火溫度見文獻[3,12].PCR產(chǎn)物通過1%(質(zhì)量/體積)的瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗.

1.4 qPCR

對于普通PCR檢出的5種tet基因[tet(A)、tet(G)、tet(Q)、tet(W)、tet(X)]、2種轉(zhuǎn)移因子及細(xì)菌的總16S rRNA基因進行拷貝數(shù)定量分析,實驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2>0.99,擴增效率均在90%～110%的范圍內(nèi).詳細(xì)操作方法如下:使用GeneJET Gel Extraction Kit(天根,北京)對PCR產(chǎn)物進行切膠純化.將純化的PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒PMD 18-T Vector(Takara,大連)在16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化到E.coil TOP10感受態(tài)細(xì)胞(Takara,大連)中擴大培養(yǎng)后涂平板,每個樣品隨機挑選30個白色菌落,用載體質(zhì)粒引物M13進行PCR檢測,每種基因選擇1～2株陽性菌液進行測序.將克隆測序得到的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比較,確定是目標(biāo)基因片段后,用TIANprep Mini Plasmid Kit(天根,北京)提取質(zhì)粒,作為定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)模板.使用ABI 7300 SYBR-Green實時定量PCR儀(ABI,美國)對tet基因、轉(zhuǎn)移因子和細(xì)菌16S rRNA基因進行定量.反應(yīng)采用25μL體系,包括1×SYBR Green I, 1×Dye(Takara,大連),200nM上下游引物各1μL, 0.5mg/mL牛血清蛋白,2 μL DNA模板.對于16S rRNA和ISCR3,溫度程序為:95℃,30s;95℃,10s,退火溫度,35s,循環(huán)40次;并于退火溫度下收集熒光信號;自動熔解曲線過程.對于其他基因,溫度程序為:95℃,30s;95℃,10s;退火溫度,10～15s;72℃, 10s;78～83℃,26s(收集熒光信號);循環(huán)40次;自動熔解曲線過程.定量PCR的退火溫度均比普通PCR高3～5℃.

將克隆測序得到的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋10～108倍,作為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品作為定量PCR模板時,進行適當(dāng)稀釋(10～100倍),并以無菌水作為陰性對照.所有樣品均3個平行,最終計算平均值.不同樣品之間由于生物量及DNA提取效率不同,論文中將得到的抗藥基因和轉(zhuǎn)移因子的豐度對16S rRNA基因進行歸一化,采用tet基因和轉(zhuǎn)移因子的相對豐度(tet基因和轉(zhuǎn)移因子的拷貝數(shù)/16S rRNA基因的拷貝數(shù))進行分析討論.

2 結(jié)果與討論

2.1 廢水水質(zhì)

土霉素及金霉素制藥廠廢水處理系統(tǒng)常規(guī)物理化學(xué)指標(biāo)見表2.

K廠進水中土霉素濃度為25.4mg/L,UASB出水中土霉素濃度為23.1mg/L,生物接觸氧化池出水中土霉素濃度為1.1mg/L,該系統(tǒng)中土霉素濃度高于城市污水廠(0.06～1.10μg/L)[20];J廠進水中金霉素濃度為100mg/L,可能由于金霉素水解周期短[21],在各級出水中均未檢出金霉素.總的來看,K廠和J廠廢水處理系統(tǒng)中的抗生素濃度高于城市污水廠[22].

表2 兩種四環(huán)素生產(chǎn)廢水的化學(xué)指標(biāo)Table 2 Chemical characteristics of the two tested tetracycline production wastewater

2.2 tet基因及轉(zhuǎn)移因子PCR檢測

采集的各樣品提取DNA后,用PCR擴增檢測6種tet基因及2種轉(zhuǎn)移因子的出現(xiàn),檢測結(jié)果見表3.據(jù)表3可以看出,比較選擇的6種tet基因以及2種轉(zhuǎn)移因子,在抗生素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中,除tet(C)沒有檢出外,其他均有檢出,且tet(A)、tet(Q)、ISCR3和intI1在所有樣品中均被檢出,表明該系統(tǒng)中抗藥基因普遍存在.而在大豆蛋白廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥中只檢出核糖體保護類tet(Q)和tet(W),好氧污泥中則只有外排泵類tet(A)、tet(C)未被檢出.

表3 PCR檢測結(jié)果Table 3 Results of PCR detection

2.3 tet基因及轉(zhuǎn)移因子的豐度

土霉素廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥(K1)中tet基因的豐度范圍為(1.73±0.04)×10-4～(4.52±0.02)× 10-2;好氧污泥(K2)中tet基因的豐度范圍為: (2.91±0.05)×10-3～(2.70±0.29)×10-1;金霉素廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥(J1, J1’)中tet基因的豐度范圍為:(1.25±0.16)×10-4～(5.70±0.001)×10-2;好氧污泥(J2, J2’, J3’)中tet基因的豐度范圍為: (9.88± 0.67)×10-5～(1.38±0.41)×10-1.但不同抗藥基因在厭氧和好氧污泥中的分布不同,因此需要更全面的調(diào)查研究.大豆蛋白生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中,厭氧污泥(C1)中tet基因的豐度范圍為:(6.84±0.87)×10-6～(1.82±0.13)×10-2;好氧污泥(C2)中tet基因的豐度范圍(4.64±0.19)×10-5～(1.66±0.09)×10-2.對于兩種轉(zhuǎn)移因子,四環(huán)素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)活性污泥中,intI1的豐度范圍為(3.99±0.14)× 10-3～(8.99±0.75)×10-1; ISCR3的豐度范圍為(1.48±0.08)×10-3～(1.81± 0.13)×10-1,均高于大豆蛋白生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng),豐度范圍分別為(1.84± 0.27)×10-4～(1.46±0.18)×10-2和(1.96±0.11)×10-4～(1.30±0.11)×10-3.抗生素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)中抗藥基因和轉(zhuǎn)移因子豐度比大豆蛋白廢水處理系統(tǒng)高1～3個數(shù)量級,表明高濃度的抗生素殘留水平促進抗藥基因的產(chǎn)生和增殖.

為了進一步闡明厭氧生物處理和好氧生物處理過程中抗藥基因的差異,著重比較了厭氧污泥和好氧污泥中tet基因以及轉(zhuǎn)移因子的豐度(圖1).3種tet基因tet(A)、tet(G)、tet(X)在厭氧污泥中的豐度[(1.25±0.16)×10-4～(4.52±0.02)× 10-2]比好氧污泥中的豐度[(9.88±0.67)×10-5～(2.70±0.29)×10-1]低1～2個數(shù)量級,而另外兩種tet基因tet(Q)、tet(W)則是好氧污泥中豐度[(5.76± 0.58)×10-3～(2.85±0.16)×10-2]比厭氧污泥[(1.66± 0.03)×10-2～(7.48±1.22)×10-2]低1個數(shù)量級.已有研究發(fā)現(xiàn)在城市污水廠活性污泥的厭氧消化過程中tet(G)、tet(X)的豐度降低,tet(A)、tet(W)的豐度升高[23],由于抗藥基因的分布與細(xì)菌群落有一定的關(guān)系[23],而處理工藝的不同運行條件均可能造成微生物群落差異,從而產(chǎn)生不同的抗藥基因分布.此外,江蘇某養(yǎng)豬廢水經(jīng)過厭氧發(fā)酵后,外排泵類tet基因[tet(A)、tet(C)、tet(G)]豐度下降,核糖體保護類tet基因[tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(W)]豐度升高[24].在本文中,好氧污泥中核糖體保護類tet基因的豐度較低,而厭氧污泥中外排泵類tet基因的豐度較低.

圖1 四環(huán)素生產(chǎn)廢水系統(tǒng)厭氧污泥和好氧污泥中抗藥基因的相對豐度Fig.1 The relative abundance of tet genes (normalized to 16S rRNA genes) in the anaerobic and aerobic sludge of tetracycline production wastewater treatment systemsA圖為K廠第1次采樣;B圖為J廠第1次采樣; C圖為J廠第2次采樣

造成不同種tet基因分布差異的原因主要有以下方面.首先,tet基因的分布與其宿主分布可能存在直接聯(lián)系.已有研究表明,革蘭氏陽性(G+)細(xì)菌主要攜帶核糖體保護類tet基因以及少數(shù)幾種外排泵類tet基因[tet(K)、tet(L)、tet(Z)和tet(T)],而革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌則主要攜帶外排泵類tet基因[tet(A)、tet(G)][25].好氧活性污泥中G-細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo),因此導(dǎo)致tet(A)、tet(G)經(jīng)過好氧處理后豐度甚至升高.而在厭氧活性污泥中,G+細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo),因此導(dǎo)致tet(Q)、tet(W)豐度較高,在好氧處理后豐度降低.

圖2 四環(huán)素抗藥基因和intI1及ISCR3的相關(guān)性分析;intI1與ISCR3的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between tet genes and intI1, tet genes and ISCR3, intI1and ISCR3

其次,轉(zhuǎn)移因子(如整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等)介導(dǎo)的抗藥基因水平轉(zhuǎn)移也會影響抗藥基因的分布[26].本研究發(fā)現(xiàn)好氧污泥中intI1和ISCR3的豐度比厭氧污泥中的豐度高1～2個數(shù)量級,intI1 和ISCR3在好氧污泥中的豐度范圍分別為(1.32±0.13)×10-1～(8.99±0.75)×10-1和(1.18±0.29)×10-1～(1.81±0.29)×10-1,高于厭氧污泥中的豐度范圍[(3.9±90.14)×10-3～(2.40±0.07)×10-2和(1.48±0.08) × 10-3～(2.61±0.31)×10-2] (圖1),表明好氧污泥中抗藥基因水平轉(zhuǎn)移的可能性更大.為了進一步說明轉(zhuǎn)移因子對tet基因分布的影響,對tet基因和轉(zhuǎn)移因子進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)tet(A)、tet(G)、tet(X)均與intI1呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.93,0.71, 0.51,P< 0.05) (圖2A),表明intI1可能在這3種抗藥基因的產(chǎn)生、傳播和增殖中起到重要作用.此外,關(guān)于抗藥基因與intI1相關(guān)性的報道已有不少,已有研究發(fā)現(xiàn)北京某公園土壤中tet(G)與intI1存在顯著相關(guān)性(R2=0.62;P<0.01),表明intI1可能對tet(G)的傳播起到促進作用[27].

本文首次調(diào)查了制藥廢水中異常插入序列ISCR3的豐度,并通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)tet(A)、tet(G)、tet(X)與ISCR3均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.35,0.70,0.38,P<0.05) (圖2B),且ISCR3與intI1之間也存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2= 0.59,P< 0.05) (圖2C).盡管至今未在intI1的任何基因盒區(qū)域檢測到tet基因,但目前已發(fā)現(xiàn)整合子可與異常插入元件(insertion sequence common region, ISCR)結(jié)合成為更復(fù)雜的整合子,實現(xiàn)抗藥基因的共同轉(zhuǎn)移[28].在臨床篩選的抗藥性沙門氏菌中發(fā)現(xiàn),ISCR3與intI1相連形成的復(fù)雜整合子攜帶tet(G)[29].綜上所述,異常插入序列ISCR3和整合子intI1很可能在這3種tet基因的傳播過程中具有協(xié)同作用,但作用機理還需要通過篩菌等方式進行進一步研究.

與進水相比,出水中外排泵類tet基因tet(A)、tet(G)、酶修飾類tet基因tet(X)相對豐度升高1～2個數(shù)量級,而核糖體保護類tet基因的tet(Q)、tet(W)相對豐度降低1～2個數(shù)量級(圖3),抗藥基因總相對豐度總體降低1個數(shù)量級,由進水中的(4.34±0.24)×10-1降低為出水中的(7.19±0.03)× 10-2.Christgen等[17]使用宏基因組方法調(diào)查了不同處理工藝對城市污水中抗藥基因去除效果的影響,并比較了不同抗藥機制的抗藥基因在處理過程中的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各種處理均導(dǎo)致出水中外排泵抗藥基因的比例升高;同時,靶位點修飾類抗藥基因(如核糖體保護類抗藥基因)則在處理之后下降;而酶修飾類抗藥基因在厭氧處理之后比例升高,好氧處理之后比例有所下降.本論文的結(jié)果與之相似,出水與進水中tet基因的分布差異也可能與抗藥機制有關(guān).外排泵類基因[tet(A)、tet(G)]通常與其它抗藥基因(如抗重金屬基因、抗消毒劑基因等)共同存在于轉(zhuǎn)移因子上[30],其存在有助于細(xì)菌群落獲得多抗性,而污水處理系統(tǒng)中殘留的抗生素和重金屬促進外排泵類抗藥基因的選擇.

圖3 四環(huán)素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)進水和出水中抗藥基因的相對豐度Fig.3 The relative abundance of ARGs (normalized to 16S rRNA genes) in the influent and effluent of tetracycline production wastewater treatment systems

就總體排放風(fēng)險而言,土霉素和金霉素廢水處理系統(tǒng)中5種tet基因在進水中的總絕對豐度為(1.49±0.26)×109～(2.52±0.17)×109copies/mL,出水中5種tet基因總絕對豐度降低,總絕對豐度為(2.06±0.63)×107～(1.42±0.27)×108copies/mL,去除率為94.4%～98.6%.據(jù)報導(dǎo),某城市污水處理廠進水中tet抗藥基因的去除率甚至超過99.9%[23].Christgen等[17]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過厭氧-好氧組合工藝,水相中抗藥基因的去除率達到85.3%,但大部分抗藥基因只是從水相轉(zhuǎn)移到污泥相中,并沒有得到實質(zhì)性去除.為了進一步深入了解污水處理系統(tǒng)對抗藥基因的削減程度,在后續(xù)研究中有必要對整個處理系統(tǒng)(包括污水和污泥)進行抗藥基因通量研究.

3 結(jié)論

調(diào)查了兩種四環(huán)素類抗生素(金霉素和土霉素)生產(chǎn)廢水生物處理系統(tǒng)(厭氧-好氧組合工藝)中抗藥基因的產(chǎn)生和排放,比較了厭氧污泥和好氧污泥中抗藥基因及轉(zhuǎn)移因子的分布,并結(jié)合宿主分布和水平轉(zhuǎn)移因子分析了抗藥基因的分布機理.主要得到以下結(jié)論:金霉素和土霉素生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)的活性污泥和出水中均含有較高豐度的抗藥基因,是重要的抗藥基因污染源和儲存庫.厭氧污泥中,外排泵類和酶修飾類tet基因的豐度較低,而好氧污泥中,核糖體保護類tet基因的豐度較低,該分布特征與細(xì)菌群落組成、轉(zhuǎn)移因子及抗藥機制有關(guān).從抗藥基因傳播角度來看,整合子intI1和異常插入序列ISCR3可能對某些抗藥基因的傳播起到促進作用;好氧處理過程中抗藥基因通過這兩種轉(zhuǎn)移因子傳播的可能性更大.

參考文獻：

[1] 徐冰潔,羅 義,周啟星,等.抗生素抗性基因在環(huán)境中的來源,傳播擴散及生態(tài)風(fēng)險 [J].環(huán)境化學(xué), 2010,29(2):169-178.

[2] 李侃竹,高 品,王 凱,等.污水中抗生素與重金屬對紅霉素抗藥性基因的選擇性效應(yīng) [J].中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(3):889-896.

[3] Zhu Y G, Johnson T A, Su J Q, et al.Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms [J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013,110(9): 3435-3440.

[4] 歐丹云,陳 彬,陳燦祥,等.九龍江下游河口水域抗生素及抗性細(xì)菌的分布 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2013,33(12):2243-2250.

[5] Pruden A, Pei R, Storteboom H, et al.2006.Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: Studies in Northern Colorado [J].Environmental Science and Technology, 40:7445-7450.

[6] Wu N, Qiao M, Zhang B, et al.Abundance and diversity of tetracycline resistance genes in soils adjacent to representative swine feedlots in China [J].Environmental Science & Technology, 2010,44(18):6933-6939.

[7] 彭 雙,王一明,林先貴.連續(xù)施用發(fā)酵豬糞對土壤中四環(huán)素抗性基因數(shù)量的影響 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(4):1173-1180.

[8] Larsson D G J.Pollution from drug manufacturing: review and perspectives [J].Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2014,369(1656):20130571.

[9] Li D, Yu T, Zhang Y, et al.Antibiotic resistance characteristics of environmental bacteria from an oxytetracycline production wastewater treatment plant and the receiving river [J].Applied and Environmental Microbiology, 2010,76(11):3444-3451.

[10] Zhang Y, Yang M, Liu M, et al.Antibiotic pollution from Chinese drug manufacturing-antibiotic resistance [J].Toxicology Letters, 2012,211:S16.

[11] 張 昱,楊 敏,王春艷,等.生產(chǎn)過程中抗生素與抗藥基因的排放特征,環(huán)境行為及控制 [J].環(huán)境化學(xué), 2015,1:001.

[12] Liu M, Zhang Y, Yang M, et al.Abundance and distribution of tetracycline resistance genes and mobile elements in an oxytetracycline production wastewater treatment system [J].Environmental Science & Technology, 2012,46(14):7551-7557.

[13] Li D, Yang M, Hu J, et al.Antibiotic-resistance profile in environmental bacteria isolated from penicillin production wastewater treatment plant and the receiving river [J].Environmental Microbiology, 2009,11(6):1506-1517.

[14] Liu M, Ding R, Zhang Y, et al.Abundance and distribution of Macrolide-Lincosamide-Streptogramin resistance genes in an anaerobic-aerobic system treating spiramycin production wastewater [J].Water Research, 2014,63:33-41.

[15] Tao C W, Hsu B M, Ji W T, et al.Evaluation of five antibiotic resistance genes in wastewater treatment systems of swine farms by real-time PCR [J].Science of the Total Environment, 2014, 496:116-121.

[16] Wang Z, Zhang X X, Huang K, et al.Metagenomic profiling of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in a tannery wastewater treatment plant [J].Plosone, 2013,8(10): e76079.

[17] Christgen B, Yang Y, Ahamed Z, et al.Metagenomics shows low energy anaerobic-aerobic treatment reactors reduce antibiotic resistance gene dissemination from domestic wastewater [J].Environmental Science & Technology, 2015.

[18] Diehl D L, LaPara T M.Effect of temperature on the fate of genes encoding tetracycline resistance and the integrase of class 1integrons within anaerobic and aerobic digesters treating municipal wastewater solids [J].Environmental Science &Technology, 2010,44(23):9128-9133.

[19] 水和廢水監(jiān)測分析方法 [M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002.

[20] Batt A L, Kim S, Aga D S.Comparison of the occurrence of antibiotics in four full-scale wastewater treatment plants with varying designs and operations [J].Chemosphere, 2007,68(3): 428-435.

[21] 李偉明,鮑艷宇,周啟星.四環(huán)素類抗生素降解途徑及其主要降解產(chǎn)物研究進展 [J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2012,23(8):2300-2308.

[22] Karthikeyan K G, Meyer M T.Occurrence of antibiotics in wastewater treatment facilities in Wisconsin, USA [J].Science of the Total Environment, 2006,361(1):196-207.

[23] Yang Y, Li B, Zou S, et al.Fate of antibiotic resistance genes in sewage treatment plant revealed by metagenomic approach [J].Water Research, 2014,62:97-106.

[24] Chen B, Liang X, Nie X, et al.The role of class I integrons in the dissemination of sulfonamide resistance genes in the Pearl River and Pearl River Estuary, South China [J].Journal of Hazardous materials, 2015,282:61-67.

[25] Roberts M C.Tetracycline resistance determinants: mechanisms of action, regulation of expression, genetic mobility, and distribution [J].FEMS Microbiology Reviews, 1996,19(1):1-24.

[26] Ochman H, Lawrence J G, Groisman E A.Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation [J].Nature, 2000,405(6784): 299-304.

[27] Wang F H, Qiao M, Lv Z E, et al.Impact of reclaimed water irrigation on antibiotic resistance in public parks, Beijing, China [J].Environmental Pollution, 2014,184:247-253.

[28] Toleman M A, Bennett P M, Walsh T R.ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century?[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006,70(2):296-316.

[29] Schnabel E L, Jones A L.Distribution of tetracycline resistance genes and transposons among phylloplane bacteria in Michigan apple orchards [J].Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(11):4898-4907.

[30] Shi P, Jia S, Zhang X X, et al.Metagenomic insights into chlorination effects on microbial antibiotic resistance in drinking water [J].Water Research, 2012,47(1):111-120.

致謝：本實驗的采樣工作是在課題組左陸珅和王鈺鍇師兄的幫助下完成,在此表示感謝.

Characteristics of tetracycline resistance genes in the anaerobic and aerobic treatment of tetracycline production wastewater.

REN Jia1, YAO Hong1, LIU Miao-miao1*, ZHANG Yu2, YANG Min2(1.Department of Civil Engineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China；2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：268～275

Abstract：In order to understand the characteristics of antibiotic resistance genes (ARGs) in the anaerobic and aerobic treatment processes of two tetracycline production wastewater, the abundances and distribution of six frequently reported tetracycline resistance genes (tet(A), tet(C), tet(G), tet(Q), tet(W), and tet(X)) and two types of mobile elements (intI1and ISCR3) were determined by PCR and quantitative PCR (qPCR).tet(C) was detected in none of the samples, while the others were discovered in all of the samples.In the systems of the tetracycline production wastewater, the relative abundances (normalized to 16S rRNA genes) of tet(A), tet(G), tet(X) in the anaerobic sludge((1.25±0.16)×10-4～(4.52± 0.002)×10-2) were lower than those in the aerobic sludge ((9.88±0.67)×10-5～(2.70±0.29)×10-1), while the relative abundances of tet(Q) and tet(W) in the anaerobic sludge ((1.66±0.03)×10-2～(7.48±1.22)×10-2) were significantly higher than those in the aerobic sludge (1.94±0.12)×10-3～(2.85±0.16)×10-2).Besides, the relative abundances of intI1 and ISCR3 in the anaerobic sludge ((1.48±0.01)×10-3～(2.61±0.31)×10-2) were significantly lower than those in the aerobic sludge ((1.18±0.15)×10-1～(8.99±0.75)×10-1), showing that the potential of horizontal gene transfer mediated by the mobile elements is lower in the anaerobic treatment process.It is indicated that aerobic treatment may facilitate the spread of tet(A), tet(G) and tet(X) but control the spread of tet(Q) and tet(W) in tetracycline production wastewater, with the opposite situation in the anaerobic treatment.The different distribution of tet genes was related to mobile genetic elements, resistancebook=269,ebook=272mechanism, and community structure.

Key words：tetracycline production wastewater；tetracycline resistance genes；mobile elements；anaerobic treatment；aerobic treatment

中圖分類號：X835

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)01-0268-08

收稿日期：2015-08-31

基金項目：中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助(KCJB14046536);環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室(中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心)專項經(jīng)費(14K01ESPCR);中國博士后科學(xué)基金項目(KCI14005531)

作者簡介：任 佳(1993-),女,山西朔州人,碩士研究生,研究方向為環(huán)境中的抗藥基因污染.