一株發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁酸菌及其代謝動力學特性

遲 雪,李建政*,艾斌凌(.哈爾濱工業(yè)大學,城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 50090；.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚?海南 ?？?5700)

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一株發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁酸菌及其代謝動力學特性

遲 雪1,李建政1*,艾斌凌2(1.哈爾濱工業(yè)大學,城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚?海南 ?？?570102)

摘要：為開發(fā)降解纖維素產(chǎn)丁酸菌的種子資源,從牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木混合物的富集樣品中分離得到一株厭氧降解纖維素產(chǎn)丁酸菌.該菌株細胞呈桿狀,長7.1～9.1μm,直徑1.2μm左右,經(jīng)鑒定為丁酸梭菌(Clostridium butyricum),命名為C.Butyricum DCB.在35℃條件下,菌株DCB在纖維二糖液體培養(yǎng)基中的最大比生長速率為0.6536h-1,世代時間為1.06h,纖維二糖降解速率為0.1g/(L·h),丁酸生成速率為0.06g/(L·h).該菌株利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸的轉(zhuǎn)化率高達0.23g/g,具有良好的開發(fā)前景.

關(guān)鍵詞：纖維素；丁酸；丁酸梭菌；轉(zhuǎn)化率；代謝動力學

* 責任作者, 教授, ljz6677@163.com

丁酸是一種應(yīng)用廣泛的化工原料[1-4],其工業(yè)生產(chǎn)目前主要采用源于石油化工的正丁醛氧化法[5].與化學法相比,生物發(fā)酵法具有原料廣泛、環(huán)境友好和可持續(xù)等優(yōu)點[4].在已有的研究中,用于丁酸發(fā)酵的主要原料有淀粉、糖蜜、乳清、馬鈴薯等,也有利用纖維素酶解物為原料的報道[6-9].纖維素是地球上儲量最豐富的一類可再生資源,占植物干重的1/3到1/2[10-11].以纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁酸,不僅可保證相關(guān)產(chǎn)業(yè)的良性可持續(xù)發(fā)展,同時也可大幅降低原料成本.現(xiàn)有的纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸研究,一般是先利用纖維素酶將木質(zhì)纖維素水解為葡萄糖、木糖等單糖,再利用微生物發(fā)酵產(chǎn)丁酸[12-13],而纖維素酶的高成本極大限制了木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸技術(shù)[1,4,14].篩選和利用可以直接降解纖維素的丁酸發(fā)酵菌種,則是突破這一瓶頸的有效途徑之一.針對發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁酸菌種資源還比較缺乏的現(xiàn)狀,分離篩選更多的具有工業(yè)化應(yīng)用前景的菌種并對其進行深入研究,具有重要意義[9,15-17].

本文以降解稻草秸稈產(chǎn)丁酸菌群的富集物為分離源,篩選到一株降解纖維素并以丁酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物的厭氧菌株,在分子生物學鑒定的基礎(chǔ)上,對其進行了纖維二糖發(fā)酵動力學特征分析,為其進一步的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種來源:用于丁酸發(fā)酵菌株分離的菌源樣品,為本實驗室保存的厭氧降解纖維素產(chǎn)丁酸混合菌群.該菌群是以稻草秸稈為底物,由牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物富集獲得[18].

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):KH2PO4,0.41;Na2HPO4, 1.06;MgCl2·6H2O,0.1;(NH4)2SO4,0.3;CaCl2·2H2O, 0.11;FeCl2·4H2O,0.0045;EDTA.Na2,0.00165;半胱氨酸0.5;酸性微量元素溶液1mL/L,堿性微量元素1mL/L,維生素溶液0.2mL/L[19].

富集培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5g/L的濾紙條.

纖維素固體培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10g/L微晶纖維素、1g/L酵母粉和15g/L瓊脂.

纖維二糖液體培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10g/L的纖維二糖和0.5g/L酵母粉.

纖維素液體培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10g/L微晶纖維素和0.5g/L酵母粉.

1.3 實驗方法

細菌的進一步富集、分離純化和發(fā)酵動力學特性測試,均在厭氧條件下進行.

1.3.1 細菌的進一步富集 對實驗室保存的厭氧降解纖維素產(chǎn)丁酸混合菌群進行復壯培養(yǎng)后, 以5%(V/V)的接種量將菌液接種到富集培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代培養(yǎng).培養(yǎng)溫度為35℃,靜置,培養(yǎng)時間以濾紙完全崩潰為度.

1.3.2 細菌的分離純化 將第三代富集培養(yǎng)物接種到纖維素固體培養(yǎng)基中,滾管,35℃下靜置培養(yǎng),待長出肉眼可見的菌落后,用毛細管挑取單菌落接種到纖維二糖液體培養(yǎng)基中,35℃、100r/min培養(yǎng)2d;按照5%(V/V)的比例將纖維二糖發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到纖維素液體培養(yǎng)基中,35℃、100r/min培養(yǎng)5d;以纖維素發(fā)酵液為接種物轉(zhuǎn)接到纖維素固體培養(yǎng)基中,滾管,35℃下靜置培養(yǎng).重復以上操作4次.

1.3.3 菌株的篩選 將通過操作1.3.2節(jié)獲得的單菌落接種于剛果紅纖維素固體培養(yǎng)基中,觀察菌落形成及菌落周邊是否有透明圈形成,以確定菌株的纖維素降解能力.將確定的具有纖維素降解能力的菌落,接入纖維素液體培養(yǎng)基,35℃厭氧培養(yǎng)5d,測定培養(yǎng)系統(tǒng)中的揮發(fā)酸(VFAs)及其組分濃度,從中篩選出產(chǎn)丁酸能力較強的培養(yǎng)物進行純度檢驗.

1.3.4 培養(yǎng)物純度檢驗 將1.3.3節(jié)篩選出的產(chǎn)丁酸能力較強的培養(yǎng)物,以5%(V/V)的接種量接種到纖維二糖固體培養(yǎng)基中,滾管,35℃厭氧培養(yǎng)2d;選取菌落形態(tài)一致的厭氧滾管,對其中的培養(yǎng)物進行光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡(S-3400N, Hitachi)觀察,挑選出菌體形態(tài)一致的樣品.

1.3.5 菌株的分子生物學鑒定 將菌株純培養(yǎng)物接種到纖維二糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,離心收集菌體,使用上海華舜生物工程公司小量細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA;以通用引物(正向引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16S rRNA基因PCR擴增;擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌后,委托上海生工生物有限公司進行16S rRNA基因序列測定.利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST程序,對測序結(jié)果進行同源性比對.

1.3.6 菌株發(fā)酵動力學特性測試 在裝有60mL纖維二糖液體培養(yǎng)基的150mL厭氧瓶中,接入3mL純培養(yǎng)物,35℃、100r/min培養(yǎng);分別在0、2、4、6、10、14、22和30h以注射器排氣并采集液體樣品3.0mL,分別測定發(fā)酵液樣品的細胞濃度、還原糖濃度、pH值以及VFAs等指標.測試采用3個平行,結(jié)果取平均值.

1.3.7 菌株發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁酸能力測試 采用纖維素液體培養(yǎng)基,自然pH值,35℃、100r/min培養(yǎng).每天測定系統(tǒng)的pH值和VFAs,發(fā)酵4d至系統(tǒng)的pH值和VFAs不再變化時,測定系統(tǒng)的纖維素殘量.測試亦采用3個培養(yǎng)系統(tǒng)平行進行.

1.4 分析方法

發(fā)酵液的pH值、吸光度(OD)、菌體干重、微晶纖維素含量均依照國家標準方法進行測定[20].其中,pH值用DELTA32型pH計(Mettler Toledo)測定,OD值采用紫外可見分光光度計(上海天美,UV2300)測量,菌體干重和微晶纖維素含量采用恒重法確定.發(fā)酵系統(tǒng)中的菌體干重采用OD600-菌體干重擬合曲線的回歸方程進行計算,回歸方程為y=0.6386x(R2=0.9568).

發(fā)酵液中的VFAs采用SP-6890氣相色譜儀(FID檢測器)(山東魯南瑞虹)測定,還原糖濃度采用DNS法測量[21].

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

對分離得到的培養(yǎng)物進行發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁酸能力測試,從中篩選出丁酸產(chǎn)量較高的菌株12 個.如表1所示,這12株細菌發(fā)酵纖維素的液相產(chǎn)物均為丁酸和乙酸,其中編號為22-3的培養(yǎng)物具有最強的產(chǎn)丁酸能力,經(jīng)3d發(fā)酵,其VFAs產(chǎn)量達到0.35g/L,丁酸產(chǎn)量為0.23g/L,占到VFAs總量的66%.將該菌株選定為目標菌種,進行進一步的測試.

表1 篩選菌株發(fā)酵纖維素產(chǎn)酸特性Table 1 Fermentative organic acid production from cellulose by candidate bacteria

2.2 菌種的分子生物學鑒定

電子掃描顯微鏡觀察表明,編號為22-3菌株的菌體呈桿狀,成對存在,單細胞直徑為1.2μm左右,長7.1～9.1μm(圖1).在微晶纖維素固體培養(yǎng)基上形成的菌落,白色,不透明,圓形,邊緣不規(guī)整.在加入剛果紅的纖維素固體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)形成的菌落周邊均出現(xiàn)了透明圈,證明該菌株具有降解纖維素的能力[22].

將16S rRNA基因序列(長度為1476bp) 與GenBank中的序列進行同源性比對,結(jié)果表明,該菌株與丁酸梭菌(Clostridium butyricum)相似度最高(99%),而與C.beijerinckii和C.saccharoperbutylacetonicum的相似度均為98%.結(jié)果證明該菌株在分類上屬于C.butyricum,將其命名為C.Butyricum DCB.

圖1 菌株DCB的菌體形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of strain DCB

2.3 菌株DCB的生長動力學特征

為研究菌株DCB的生長動力學特性,借助于纖維二糖液體培養(yǎng)基,對其進行了發(fā)酵培養(yǎng)測試.結(jié)果表明(圖2),菌株DCB在纖維二糖液體培養(yǎng)基中,經(jīng)過6h的遲緩期后進入對數(shù)生長期,并在第14h后進入穩(wěn)定期,直到第30h培養(yǎng)結(jié)束.

圖2 菌株DCB的群體生長規(guī)律Fig.2 Growth of strain DCB in batch culture

借助描述有限空間內(nèi)種群增長基本規(guī)律的Logistic方程對菌株群體在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的生長狀態(tài)進行分析[23],方程表達如式(1)所示.

式中:X0為發(fā)酵系統(tǒng)的初始生物量,g/L;Xm為發(fā)酵過程獲得的最大生物量,g/L;μm表示菌群的最大比生長速率,h-1;t為發(fā)酵時間,h.

對方程(1)兩邊同時取對數(shù)得:

其中,Xm可由實驗測得.以對時間t作圖得一直線,其斜率為μm,而其截距即為,由此可計算得到發(fā)酵系統(tǒng)初始菌體濃度X0.

由圖3所示的實驗數(shù)據(jù)計算得到:μm= 0.6536h-1,X0=0.0028g/L.

將參數(shù)μm、X0、Xm代入式(1),得到菌株DCB發(fā)酵纖維二糖過程的群體生長動力學方程:

在對數(shù)期生長期,菌株DCB的代時為Td= ln2/μm=1.06(h).

2.4 菌株DCB的丁酸生成動力學特征

以纖維二糖液體培養(yǎng)基對菌株DCB丁酸生成動力學特性的測試結(jié)果表明(圖3),菌株DCB發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)丁酸的生成速率與菌體的群體增長規(guī)律(圖2)在進程上呈現(xiàn)出高度一致性.經(jīng)過6h的遲緩期,發(fā)酵系統(tǒng)中的丁酸和乙酸濃度開始迅速增加,到第14h后趨于平穩(wěn).由于VFAs的不斷產(chǎn)生和累積,導致發(fā)酵系統(tǒng)pH值迅速下降,在第14h對數(shù)期結(jié)束時降低到了4.1以下(圖3a).盡管此時系統(tǒng)中仍有大量纖維二糖殘留,但發(fā)酵產(chǎn)物(圖3b)及生物量(圖2)均不再有明顯變化,說明菌體活性受到嚴重抑制.

基于菌株DCB產(chǎn)物形成與菌體生長的高度偶聯(lián)性,采用Leudeking-piret模型對其丁酸生成動力學特性進行分析[24].設(shè),丁酸生成速率與生物量增長速率的相關(guān)系數(shù)為β,則有:

式中:P為丁酸的累積量,g/L;X為發(fā)酵過程中的生物量,g/L;t為發(fā)酵時間,h.

對式(4)兩邊同時積分得:

圖3 菌株DCB發(fā)酵纖維二糖產(chǎn)酸過程Fig.3 Organic acid producing process from cellobiose by fermentation of strain DCB

當t=0時,P=0,常數(shù)C= -β X0.將C代入式(5)并整理得:

式(6)表達的是菌體在對數(shù)生長期產(chǎn)物丁酸的累積特征.以P對(X-X0)作圖,得一直線,其回歸方程為,其中,斜率1.3664即為β.將式(3)和與式(6)聯(lián)立,得丁酸生成動力學方程:

由式(7)計算得到菌株DCB在對數(shù)生長期的丁酸累積生成量為0.48g/L,其生成速率為0.06g/(L·h).

2.5 菌株DCB的纖維二糖降解動力學特征

底物降解速率與發(fā)酵系統(tǒng)的生物量有如下關(guān)系[25]:

式中:S為發(fā)酵液中纖維二糖濃度,g/L;X為發(fā)酵過程中的生物量,g/L;t表示時間,h.

對式(8)兩邊同時積分得:

將式(9)轉(zhuǎn)換為:

式(10)表達的是菌體在對數(shù)生長期的底物降解特征.以S0-S(設(shè)為Y)對X作圖,得一直線,斜率為(1-X0)k,得到的方程為:Y=0.9405X(R2= 0.943).由此可得,k=0.9462.

將式(3)和系數(shù)k與式(10)聯(lián)立,得纖維二糖降解動力學模型:

由式(11)計算得到菌株DCB在對數(shù)生長期的纖維二糖降解量為0.8g/L,降解速率為0.1g/(L·h).

2.6 菌株DCB發(fā)酵纖維素產(chǎn)丁酸能力

如圖4a所示,菌株DCB利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸主要發(fā)生在第1d,其后發(fā)酵基本停止.對發(fā)酵過程系統(tǒng)的pH值檢測發(fā)現(xiàn),隨著系統(tǒng)中VFAs的積累,其pH值在1d之內(nèi)迅速由初始的6.7降低到了5.0左右(圖4b).pH值快速大幅下降,嚴重抑制細菌代謝活性,這可能是導致發(fā)酵停止的主要原因[1].經(jīng)檢測,經(jīng)過1d的發(fā)酵,系統(tǒng)中有1.02g/L的纖維素被降解,乙酸、丁酸和總VFAs的累積量分別為0.11、0.22和0.33g/L,其中丁酸占總VFAs的66.5%.計算結(jié)果表明,菌株DCB利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸轉(zhuǎn)化率為0.23g/g,但丁酸產(chǎn)生成速率較低,僅為0.009g/(L·h).

根據(jù)終產(chǎn)物的不同,一般把丁酸菌分為兩類:一類以丁酸作為終產(chǎn)物,另一類以丁醇作為終產(chǎn)物[1].目前已有超過10種丁酸菌被認為具有工業(yè)生產(chǎn)前景,它們分布在以下7個屬中[15]:梭菌屬(Clostridium),丁酸弧菌屬(Butyrvibrio),丁酸桿菌屬(Butyribacterium),真桿菌屬(Eubacterium),梭桿菌屬(Fusobacterium),巨形球菌屬(Megasphera)和八疊球菌屬(Sarcina)[16-17].其中,梭菌屬的丁酸產(chǎn)量相對較高、穩(wěn)定性較好,最具商業(yè)化潛力[9].而菌株DCB所屬的丁酸梭菌(C.butyricum)是梭菌屬中產(chǎn)丁酸的代表菌種之一,具有良好的開發(fā)前景.

研究表明[26-27],丁酸梭菌可利用的底物比較廣泛,甘油、乳清、淀粉、蔗糖、纖維素和麥秸等都可用于發(fā)酵產(chǎn)丁酸.經(jīng)測試,C.Butyricum DCB發(fā)酵纖維素的丁酸轉(zhuǎn)化率達到0.23g/g的較高水平,而且,該菌株利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸時的液相末端產(chǎn)物組成相對簡單,除了丁酸外只有乙酸生成,這為降低后續(xù)的產(chǎn)物分離與純化成本奠定了良好基礎(chǔ).然而,從目前測試結(jié)果來看,C.Butyricum DCB在發(fā)酵纖維素的丁酸累積量只有0.22g/L,生成速率也較慢,如何進一步提高菌株DCB對纖維素的丁酸轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵系統(tǒng)的丁酸累積量是決定其應(yīng)用前景的關(guān)鍵.在后續(xù)研究中,需要對其生理生化和生理生態(tài)特征進行更加全面的研究,并通過底物濃度、氮源、C/N值、pH值、溫度、促進劑等條件的優(yōu)化,進一步提高丁酸得率和丁酸積累量,為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

圖4 菌株DCB降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)酸特性及pH值變化Fig.4 Organic acid producing process and pH fluctuation from cellulose by fermentation of strain DCB

3 結(jié)論

3.1 從牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物的富集物中分離得到一株厭氧降解纖維素產(chǎn)丁酸菌株DCB,隸屬于丁酸梭菌(Clostridium butyricum),命名為C.Butyricum DCB.該菌株細胞呈桿狀,長7.1～9.1μm,直徑為1.2 μm左右.在微晶纖維素固體培養(yǎng)基上形成圓形菌落,白色,不透明,邊緣不規(guī)整.

3.2 以纖維二糖為底物,在35℃條件下,C.Butyricum DCB菌群的最大比生長速率為0.6536h-1,世代時間為1.06h,纖維二糖降解速率為0.1g/(L·h),丁酸生成速率為0.06g/(L·h).

3.3 在35℃條件下,C.Butyricum DCB利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)丁酸的轉(zhuǎn)化率高達0.23g/g,但系統(tǒng)的丁酸累積量僅為0.22g/L,有待進一步提高.

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Butyric production and metabolic kinetics of a novel cellulose degrading strain.

CHI Xue1, LI Jian-zheng1*, AI Bin-ling2(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China；2.Haikou Experimental Station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 570102, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：232～237

Abstract：A novel anaerobic strain, which could digest cellulose during butyric acid production, was isolated from an enrichment culture of cow dung, pig manure, corn soil and rotten wood.The strain was a bacillus with a length of 7.1～9.1 μm and a diameter of about 1.2 μm.It belonged to Clostridium butyricum and named C.Butyricum DCB.Strain DCB had a specific growth rate of 0.6536h-1in cellobiose medium at 35℃.In addition to this, the generation time, degradation rate and butyric acid production rate of Strain DCB were 1.06h, 0.1g/(L·h) and 0.06g/(L·h), respectively.In cellulose medium at 35℃, the highest butyric acid convertion ratio was 0.23g/g.

Key words：cellulose；butyric acid；Clostridium butyricum；conversion ration；metabolic kinetics

中圖分類號：X172,X382

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)01-0232-06

收稿日期：2015-06-15

基金項目：國家自然科學基金資助項目(51478141);城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室基金項目(2013DX11)

作者簡介：遲 雪(1989-),女,黑龍江哈爾濱人,博士研究生,研究方向為厭氧微生物生理生態(tài)學.