改良劑對(duì)土壤銅鎘有效性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

崔紅標(biāo),范玉超,周 靜,時(shí) 玉,徐 磊,郭學(xué)濤,胡友彪,高良敏(.安徽理工大學(xué)地球與環(huán)境學(xué)院,安徽 淮南 300；.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所,江蘇 南京 0008)

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改良劑對(duì)土壤銅鎘有效性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

崔紅標(biāo)1,2,范玉超1,周 靜2*,時(shí) 玉2,徐 磊2,郭學(xué)濤1,胡友彪1,高良敏1(1.安徽理工大學(xué)地球與環(huán)境學(xué)院,安徽 淮南 232001；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所,江蘇 南京 210008)

摘要：以一次性添加木炭、石灰和磷灰石穩(wěn)定化修復(fù)4年后的土壤為研究對(duì)象,探討了土壤中銅鎘有效性和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化.結(jié)果表明,3種改良劑的添加提高了土壤pH值,降低了土壤交換性酸和交換性鋁的含量,使銅鎘由活性態(tài)向非活性態(tài)和潛在活性態(tài)轉(zhuǎn)化,其中磷灰石和石灰的處理效果優(yōu)于木炭處理; Biolog測(cè)試發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)192h,木炭、石灰和磷灰石處理土壤AWCD值(0.61、0.76和0.70)分別是對(duì)照的1.33、1.65和1.52倍;且Shannon和McIntosh指數(shù)均較對(duì)照有所提高,表現(xiàn)為:石灰>磷灰石>木炭,表明改良劑處理后增加了土壤微生物對(duì)碳源的利用能力,提高了其功能多樣性.PCR-DGGE分析結(jié)果顯示,改良劑處理后土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群的數(shù)量顯著增加,木炭、石灰和磷灰石處理Shannon指數(shù)分別比對(duì)照提高了0.22、0.39和0.24.相關(guān)性分析表明,土壤酸度和重金屬有效性是影響穩(wěn)定化修復(fù)重金屬污染土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性差異的主要因素.

關(guān)鍵詞：重金屬；有效性；Biolog；PCR-DGGE；微生物群落結(jié)構(gòu)

* 責(zé)任作者, 研究員, zhoujing@issas.ac.cn

隨著我國(guó)現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展,有毒化學(xué)污染物尤其是重金屬通過(guò)多種途徑進(jìn)入到農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中,造成土壤重金屬污染,并對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅.因此,對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn).穩(wěn)定化是指通過(guò)向土壤中添加改良材料使重金屬向低溶解、被固定、低毒形態(tài)轉(zhuǎn)化,達(dá)到降低污染土壤重金屬有效性和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的方法[1].因?yàn)榫哂胁僮骱?jiǎn)便、低成本優(yōu)勢(shì),穩(wěn)定化方法已成為當(dāng)前治理重金屬污染土壤最有效的途徑之一.研究表明,磷酸鹽、石灰性物質(zhì)和有機(jī)物等在降低土壤重金屬活性,減少污染物向其他介質(zhì)遷移風(fēng)險(xiǎn)方面具有較好的效果[2-4].近年來(lái),我國(guó)的科研工作者在廣西環(huán)江、江西省貴溪市冶煉廠周邊區(qū)域、湖南湘江流域等[5-8]開(kāi)展了不同規(guī)模的重金屬污染農(nóng)田修復(fù),取得了較好的穩(wěn)定化效果.但這些工作主要關(guān)注土壤重金屬活性的變化及其在食物鏈的遷移,極少有對(duì)長(zhǎng)期原位穩(wěn)定化修復(fù)多年后土壤微生物的響應(yīng)進(jìn)行研究.

重金屬污染土壤的修復(fù)不僅僅在于土壤重金屬總量及有效性的降低,土壤生物多樣性的恢復(fù)也是一個(gè)重要的方面[9-10].微生物是土壤最活躍的組成,大量研究表明,土壤微生物對(duì)重金屬污染物的響應(yīng)十分敏感[11-13].因?yàn)橹亟饘僭谕寥牢⑸锏纳^(guò)程中扮演重要的角色,如Co、Cu、Mn、Zn和Ni等是微生物生長(zhǎng)的必需元素,它們?cè)谖⑸锷磻?yīng)中起到催化作用,對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁具有保護(hù)功能,并參與一些氧化還原過(guò)程[14].另外,當(dāng)土壤中存在較高濃度的重金屬時(shí),對(duì)土壤微生物會(huì)產(chǎn)生顯著的效應(yīng):一是不適應(yīng)新環(huán)境的微生物數(shù)量的減少或絕滅;二是適應(yīng)新環(huán)境的微生物數(shù)量的增加和積累[15].因此,土壤長(zhǎng)期遭受重金屬污染后,土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)、微生物數(shù)量、土壤酶活性可能發(fā)生顯著的變化.如李小林等[16]研究表明四川省漢源縣福泉鄉(xiāng)萬(wàn)順鉛鋅礦區(qū)尾礦區(qū)(DTPA提取態(tài)Zn、Pb和Cd含量分別為790、883和8mg/kg)比對(duì)照(DTPA提取態(tài)Zn、Pb和Cd含量分別為16、8和1mg/kg)中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別降低了98.6%、92.2%和99.0%.

基于此,本文對(duì)江西省貴溪冶煉廠周邊重金屬污染土壤,采用一次性添加木炭、石灰和磷灰石聯(lián)合植物提取的修復(fù)方法,對(duì)修復(fù)4年后土壤銅鎘有效性和微生物群落多樣性進(jìn)行分析,研究結(jié)果可為重金屬污染土壤長(zhǎng)期穩(wěn)定化修復(fù)微生物多樣性的變化提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 區(qū)域概況

研究區(qū)域位于江西省貴溪市,屬于亞熱帶季風(fēng)型氣候,溫暖濕潤(rùn),年平均降水量為1808mm.由于農(nóng)民使用企業(yè)排放含有重金屬的污水進(jìn)行灌溉,導(dǎo)致周邊130多hm2農(nóng)田遭受重金屬污染(主要污染物是Cu和Cd)并導(dǎo)致水稻減產(chǎn)及稻米Cd含量超標(biāo)[17-18].目前,大部分區(qū)域處于拋荒狀態(tài),且在周邊嚴(yán)重污染區(qū)域,寸草不生,并出現(xiàn)沙化現(xiàn)象[18].

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)梁家妮[19]的研究結(jié)果,選擇木炭、石灰和磷灰石3種材料為改良劑.其中木炭(粒徑0.80mm,比表面積1155m2/g,購(gòu)自上海海諾炭業(yè)有限公司)、石灰(粒徑0.16mm,購(gòu)自江西鷹潭建材大市場(chǎng))和磷灰石(粒徑0.25mm,購(gòu)自湖北南漳縣鑫泰磷化工廠)的pH值分別為 9.96、12.2和8.40,石灰和磷灰石的Cu含量分別為:1.36、9.54mg/kg;Cd含量分別為:0.87、1.18mg/kg.

2009年11月,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每個(gè)處理重復(fù)3次,4個(gè)處理分別為:(1)對(duì)照(不加任何改良劑);(2)1%(w/w,土壤0～17cm表層質(zhì)量百分比)磷灰石處理(22.3t/hm2);(3)0.2%(W/W)石灰處理(4.45t/hm2);(4)3%(W/W)木炭處理(66.9t/hm2).采用人工翻耕、耙勻,反復(fù)2次,使改良劑與0～17cm表層土壤充分混勻.每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)3m,寬2m.各小區(qū)間田埂采用防滲聚乙烯塑料薄膜(30cm高)包裹,防止因雨水徑流影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.3 樣品采集

在2013年6月收獲小區(qū)中生長(zhǎng)的土著植物金黃狗尾草(木炭、石灰和磷灰石處理每小區(qū)植物干生物量均值分別為538、1210和2759g)后使用鐵鏟在每個(gè)小區(qū)采集表層0～17cm土壤(剝離靠近鐵鏟內(nèi)壁的土壤),并將部分樣品裝于無(wú)菌自封袋中,分兩部分用冰塊冷卻保存,其中一份帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-40℃冰箱,用于提取土壤DNA分析;另一份保存在0～4℃冰箱,用于土壤微生物群落功能多樣性和理化性質(zhì)的測(cè)定.

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 土壤重金屬化學(xué)形態(tài)分析 土壤重金屬化學(xué)形態(tài)分級(jí)程序建立在Tessier方法[20]的基礎(chǔ)之上,具體實(shí)驗(yàn)操作參照Cui等[18]的方法.

1.4.2 土壤微生物群落功能多樣性測(cè)定 土壤微生物量碳氮含量采用氯仿熏蒸-浸提方法測(cè)定

[21].稱取過(guò)10目篩的新鮮土穰15g于玻璃培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿置于裝有50mL無(wú)乙醇氯仿的小燒杯及一個(gè)裝有蒸餾水的小燒杯的干燥器內(nèi).然后,用真空泵抽至氯仿沸騰并保持2min,將干燥器放入25℃的恒溫室或恒溫箱中熏蒸24h.待氯仿去除干凈后,稱取10g熏蒸后土壤于80mL帶內(nèi)蓋的塑料瓶中,加25mL 0.5mol/L的K2SO4溶液,在往復(fù)式震蕩機(jī)上振蕩提取30min,過(guò)濾.濾液保存在4℃冰箱中備用.同時(shí)做不熏蒸樣品的提取.所得濾液用TOC儀測(cè)定微生物生物量碳、氮:

微生物碳=(熏蒸碳-未熏蒸碳)×2.64

微生物氮=(熏蒸氮-未熏蒸氮)×1.85

土壤微生物群落功能多樣性的測(cè)定采用Biolog平板分析法[22].稱取10g過(guò)2mm篩的新鮮土壤置于裝有100mL 0.5mol/L磷酸緩沖液滅菌的250mL三角瓶中,振蕩20min;靜置25min后,在超凈臺(tái)上用滅菌的0.5mol/L磷酸緩沖液將上述溶液稀釋到10-3倍;然后,用8通道的加樣器向Biolog GN 96孔板中分別添加 150μL稀釋后的懸液.28℃培養(yǎng)9d,每隔24h用Biolog自動(dòng)讀數(shù)裝置在590nm下測(cè)定其吸光值.

1.4.3 土壤DNA提取和PCR-DGGE測(cè)定 土壤總DNA用FastDNAR SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)試劑盒提取.每個(gè)土壤樣品準(zhǔn)確稱取0.5g土壤,按照試劑盒提取步驟提取土壤總DNA.提取后的土壤總DNA溶解在70μL TE緩沖液中,用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.USA)分光光度計(jì)測(cè)定總DNA的濃度.由于土壤有機(jī)質(zhì)含量較高,提取的總DNA顏色較深,會(huì)影響PCR擴(kuò)增,因此采用Mobio DNA純化試劑盒對(duì)提取的總DNA進(jìn)行純化,接著用50μL TE緩沖液溶解純化后總DNA;最后使用分光光度計(jì)測(cè)定純化后總DNA的濃度,并于-20℃保存.

PCR擴(kuò)增:以純化后的土壤DNA作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板,在Hybaid Omni Gene Temperature Cycler熱循環(huán)儀(Hybaid, Teddington, United Kingdom)上PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增引物為(細(xì)菌通用引物):GC-341F/9 07R,片段長(zhǎng)度大約560bp,分別為:341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’), GC-clamp(341F)(5’-CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCG-3’),907R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’).

擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL):11.5μL ddH2O, 12.5μL Premix Tap DNA聚合酶,0.5μL DNA模板,0.25μL正向引物(20ng/μL),0.25μL反向引物(20ng/μL).

擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,(94℃/35s, 56℃/30s,72℃/45s)×30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min, PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

DGGE分析:采用Bio-Rad公司Dcode TM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析.主要參數(shù)為:變性劑濃度梯度為45%～70%(變性劑為尿素和去離子甲酰胺),6%的聚丙烯酰胺凝膠,點(diǎn)樣量為10μL PCR產(chǎn)物,溫度為60℃,電壓75V,電泳時(shí)間為15h.電泳完畢后,在 SYBR Green中染色30min,然后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)的Quantity One 4.4.0軟件分析染色后的凝膠,觀察樣品的電泳條帶數(shù)量并拍照.

1.5 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)分析(Pearson相關(guān))、T-檢驗(yàn)、主成分分析等都在SPSS 19上實(shí)現(xiàn).使用Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行解析,并進(jìn)行聚類分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤性質(zhì)與重金屬形態(tài)的變化

如表1所示,木炭、石灰和磷灰石處理4年后土壤pH值比對(duì)照提高0.37、0.70和1.04個(gè)單位.對(duì)于交換性酸來(lái)說(shuō),木炭、石灰和磷灰石處理比對(duì)照顯著降低了1.26、1.90和2.78cmol/kg.與交換性酸相似,木炭、石灰和磷灰石處理交換性鋁分別比對(duì)照降低了1.17、1.84和2.50cmol/kg.另外,木炭、石灰和磷灰石處理4年后土壤交換性鈣含量分別較對(duì)照顯著提高了1.54、1.98和2.44cmol/kg.修復(fù)4年后,改良劑的修復(fù)對(duì)土壤微生物量碳影響顯著大于土壤微生物量氮,其中木炭、石灰和磷灰石處理中微生物量碳的含量分別比對(duì)照提高了6.0、35.9和20.6mg/kg,增幅分別為10.8%、64.3%和36.9%;微生物量氮的含量分別比對(duì)照提高了0.06、1.37和0.96mg/kg,增幅分別為1.08%、24.7%和17.3%.

圖書(shū)館的服務(wù)不僅服務(wù)資源建設(shè)，更主要的是服務(wù)于人的發(fā)展。在圖書(shū)館的主頁(yè)上，鏈接導(dǎo)師服務(wù)，或者組成學(xué)習(xí)小組或團(tuán)隊(duì)。在網(wǎng)絡(luò)資源的學(xué)習(xí)過(guò)程中，注重對(duì)學(xué)生的學(xué)習(xí)支持、圖書(shū)館員作為參與者加入課程的輔導(dǎo)教師隊(duì)伍中，比如發(fā)布公告和郵件通知、對(duì)學(xué)生適時(shí)進(jìn)行學(xué)習(xí)路徑的導(dǎo)航，通過(guò)線上、線下的參考咨詢或者討論組解答學(xué)生在學(xué)習(xí)中遇到的問(wèn)題，幫助他們拓展相關(guān)的領(lǐng)域知識(shí)。這種做法能夠充分體現(xiàn)圖書(shū)館的教育功能：連接與合作、網(wǎng)絡(luò)化學(xué)習(xí)、融入課程、分享經(jīng)驗(yàn)等特點(diǎn)。

表1 修復(fù)4年后土壤主要化學(xué)性質(zhì)變化Table 1 Changes of soil chemical characteristics after four-year immobilization

如表2所示,對(duì)照處理Cu主要聚集于殘?jiān)鼞B(tài)(227mg/kg),且5種形態(tài)Cu的分布規(guī)律為:RES(殘?jiān)鼞B(tài))> EXC(離子交換態(tài))> Fe-Mn(鐵錳氧化物結(jié)合態(tài))> OM(有機(jī)結(jié)合態(tài))> CA(碳酸鹽結(jié)合態(tài)).改良劑修復(fù)四年后,最顯著的變化是木炭、石灰和磷灰石處理離子交換態(tài)Cu含量較對(duì)照分別降低了25、39和86mg/kg,鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)Cu含量分別增加了60、64和103mg/kg.對(duì)于有機(jī)結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài),各處理間未有顯著性差異.與Cu相似,改良劑的應(yīng)用均降低了離子交換態(tài)Cd的含量,增加了鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)Cd的含量.另外,改良劑的應(yīng)用不同程度地提高了殘?jiān)鼞B(tài)Cd的含量.

總體上,木炭、石灰和磷灰石添加后,顯著提高了土壤pH值,土壤Cu和Cd由活性態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚詰B(tài),降低了土壤中Cu和Cd的有效活性,且磷灰石和石灰的穩(wěn)定化效果好于木炭處理.土壤重金屬活性的降低可能是由于改良劑顯著提高了土壤pH值,這有助于提高粘土礦物、有機(jī)質(zhì)和鐵錳氧化物等變價(jià)膠體的負(fù)電荷,增加土壤對(duì)重金屬的吸附能力[23].另外,Bolan等[24]也發(fā)現(xiàn)石灰的添加促進(jìn)了活性Cu向非活性和潛在活性形態(tài)轉(zhuǎn)變.石灰對(duì)Cu和Cd的固定主要涉及形成碳酸鹽或氫氧化物沉淀[25]以及離子交換等[24].對(duì)于磷灰石來(lái)說(shuō),其對(duì)Cu和Cd的固定主要通過(guò)表面絡(luò)合、共沉淀、離子交換和固體的溶解作用等[26-28].如Shahid等[29]研究表明溶解性磷和固體性磷材料均能有效降低土壤中Pb和Cd的生物有效性.木炭對(duì)Cu和Cd的固定主要通過(guò)吸附、絡(luò)合和離子交換等方式[30].同樣,Uchimiya等[31]用肉雞糞便制作的生物碳能有效降低水溶液中Cd、Pb和Ni的含量,并顯著降低模擬酸雨下土壤中Pb的淋出.

表2 改良劑對(duì)土壤Cu和Cd化學(xué)形態(tài)的影響Table 2 Effects of amendments on fractions of soil Cu and Cd

2.2 改良劑對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響

利用Biolog測(cè)試系統(tǒng)研究重金屬脅迫環(huán)境下,土壤微生物群落功能多樣性已廣泛應(yīng)用[32-33].Biolog盤中每孔的平均吸光值(AWCD) 對(duì)土壤環(huán)境脅迫的反應(yīng)比較敏感,可作為微生物整體活性的有效指標(biāo),反映微生物群落對(duì)碳源利用總的能力[34].Biolog生態(tài)測(cè)試板動(dòng)態(tài)測(cè)定結(jié)果(圖1)表明,在24h之前,各處理土壤微生物群落的AWCD值未表現(xiàn)出明顯的變化;當(dāng)培養(yǎng)到48h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)變化,并在192h時(shí)發(fā)生明顯變化,且各處理AWCD值大小表現(xiàn)為:石灰>磷灰石>木炭>對(duì)照.

根據(jù)圖1各處理AWCD變化特點(diǎn),選擇培養(yǎng)192h時(shí)的AWCD值計(jì)算微生物群落功能多樣性指數(shù)(表3).結(jié)果表明,與對(duì)照相比,木炭、石灰和磷灰石處理土壤AWCD值(0.61、0.76和0.70)分別是對(duì)照的1.33、1.65和1.52倍.這表明改良劑處理后增加了土壤中能利用有關(guān)單一碳源底物的微生物數(shù)量.作為當(dāng)前研究土壤微生物群落多樣性應(yīng)用最為廣泛的指數(shù)之一,Shannon指數(shù)是研究群落物種數(shù)及其個(gè)體數(shù)和分布均勻程度的綜合指標(biāo),能用來(lái)表征群落物種豐富度[35].Simpson指數(shù)常用來(lái)反映群落中最常見(jiàn)物種的優(yōu)勢(shì)度,而McIntosh指數(shù)是群落內(nèi)物種均一性的度量[36].

圖1 土壤微生物在培養(yǎng)過(guò)程中平均吸光值(AWCD)變化Fig.1 Changes in average well color development (AWCD) of microbial during incubation

本研究中,改良劑處理均提高了Shannon和Simpson指數(shù),但是均未與對(duì)照處理達(dá)到顯著性差異,其中木炭、石灰和磷灰石處理Shannon指數(shù)分別比對(duì)照提高了0.08、0.23和0.14.與此相同,Humid等[32]研究表明,橄欖廢物制作的生物碳添加到土壤中,能夠提高重金屬污染土壤微生物的Shannon指數(shù).對(duì)于McIntosh指數(shù),磷灰石和石灰處理與對(duì)照相比達(dá)到顯著性差異,分別比對(duì)照提高了1.29和1.67.總體來(lái)看,改良劑的添加對(duì)Shannon和McIntosh指數(shù)影響較大,對(duì)Simpson指數(shù)影響較小,這表明磷灰石和石灰處理土壤增加了土壤微生物群落的豐富度和均勻度,但是對(duì)常見(jiàn)微生物群落優(yōu)勢(shì)度影響較小.同樣, Fernández等[37]發(fā)現(xiàn),改良劑的添加,增加了土壤微生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性.這可能是由于改良劑的添加,不同程度地降低了土壤重金屬的有效性,減少了對(duì)微生物的毒性;提高了土壤pH值和有機(jī)碳的含量,降低了土壤交換性酸、交換性鋁,有利于微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的恢復(fù)[32].此外,3種材料的應(yīng)用均能夠有效降低土壤重金屬活性,使得植物(金黃狗尾草)能夠生長(zhǎng),而對(duì)照處理無(wú)任何植物生長(zhǎng).植被的建立(凋落物、根系分泌物等)有助于土壤微生物數(shù)量和功能多樣性的恢復(fù)[38-39],這可能是導(dǎo)致改良劑處理后的土壤提高了微生物對(duì)碳源的利用能力主要原因.另外,木炭是一種有機(jī)改良劑,前人的研究表明其不僅能較好的吸附固定重金屬,還可以作為微生物生長(zhǎng)的良好載體[40].

表3 土壤AWCD值和微生物群落功能多樣性指數(shù)Table 3 Soil microbial AWCD and microbial community diversity indeices

圖2 不同改良劑處理土壤培養(yǎng)192h的主成分分析因子載荷Fig.2 Loadings of principal component analysis after 192h culturing of soils treated by different amendments

2.3 改良劑對(duì)土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性的影響

Biolog技術(shù)只能表征土壤中快速生長(zhǎng)或富營(yíng)養(yǎng)的微生物活性,但是可培養(yǎng)的微生物種類僅占土壤微生物種類總數(shù)的0.1%～1%[42],無(wú)法反映土壤中緩慢生長(zhǎng)以及不可培養(yǎng)的微生物活性[43].PCR-DGGE技術(shù)是基于核酸序列的不同,將片段大小相同的DNA序列分開(kāi)的一種技術(shù)方法[44].該技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)勢(shì),且已經(jīng)在環(huán)境微生物研究中得到較多的應(yīng)用[45-46].本研究提取了土壤DNA,并進(jìn)行了純化,然后16SrDNA基因V3區(qū)PCR擴(kuò)增,最后進(jìn)行DGGE變性梯度凝膠電泳)分析.

不同改良劑處理后土壤細(xì)菌DGGE分析結(jié)果如圖3所示.從電泳條帶數(shù)目來(lái)看,與對(duì)照相比,改良劑處理后的土壤顯著增加了電泳條帶數(shù),如圖中標(biāo)示的條帶2、5和6.另外,在對(duì)照處理中出現(xiàn)的較高亮度的條帶1均未在改良后的土壤中出現(xiàn).由于條帶的數(shù)目反映了細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群的數(shù)量[47],因此,本研究中改良劑處理后的土壤總體上增加了土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群的數(shù)量,表明為了適應(yīng)新的土壤環(huán)境的變化(重金屬活性及土壤性質(zhì)等),細(xì)菌群落也隨之發(fā)生變化[48].另外,從條帶的亮度來(lái)看,在磷灰石、石灰和木炭處理中條帶3的亮度明顯低于在對(duì)照中的亮度,而條帶4的亮度均高于對(duì)照處理.本研究發(fā)現(xiàn)所有處理中出現(xiàn)了一些共有的條帶,這表明供試土壤中可能存在一些共有的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群;而且這些共有條帶的強(qiáng)度也不相同,如在磷灰石和石灰處理中,條帶7和條帶8的亮度明顯強(qiáng)于對(duì)照處理,這表明磷灰石和石灰處理土壤增加了該細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群的數(shù)量.與此類似,Kan等[49]發(fā)現(xiàn)磷灰石和甲殼素改良重金屬污染土壤與對(duì)照相比,更有利于土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群和群落多樣性的增加.

圖3 不同處理土壤微生物16S rDNA片段的DGGE圖譜Fig.3 DGGE patterns of 16S rDNA fragments in soils treated by different amendments

同時(shí),根據(jù)Quantity One得到通過(guò)DGGE的條帶配對(duì)圖,在條帶出現(xiàn)的地方定義1,未出現(xiàn)的地方記為0,得到DGGE條帶配對(duì)的二次矩陣,利用PAST計(jì)算各處理的Shannon(H)指數(shù)來(lái)分析各處理土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性(未列出).結(jié)果表明,木炭、石灰和磷灰石處理分別使Shannon(H)指數(shù)從對(duì)照的2.27提高到2.49、2.66和2.51,分別比對(duì)照提高了0.22、0.39和0.24,表明改良劑處理后提高了土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性,且石灰處理的土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性最高.為了進(jìn)一步揭示供試土壤中細(xì)菌群落的同源性,采用非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)對(duì)土樣DGGE指紋圖譜作相似性聚類分析.由圖4可知,所有供試土壤的遺傳相似性為45%,在84%的相似性水平上可以將4個(gè)處理土壤區(qū)分開(kāi)來(lái).可見(jiàn),不同改良劑處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異.通過(guò)將土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性Shannon(H)指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未列出),Shannon(H)指數(shù)與土壤pH值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.72(P<0.01),與土壤交換性酸、交換性鋁呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系.因?yàn)橥寥纏H值可用來(lái)表示土壤活性酸度,是土壤溶液中H+濃度的直接反映;交換性酸、交換性鋁可用來(lái)表達(dá)土壤潛性酸度,是土壤膠體吸附的可代換性H+和Al3+.可見(jiàn),土壤酸度是影響土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性的主要因素.另外,Shannon(H)指數(shù)與離子交換態(tài)Cu和Cd呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明重金屬有效性的降低,有利于土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性的增加.

圖4 不同改良劑處理DGGE圖譜聚類分析Fig.4 Cluster analysis of DGGE profile for bacterial communities treated by different amendments

3 結(jié)論

3.1 木炭、石灰和磷灰石的添加,提高了土壤pH 值,降低了土壤交換性酸及交換性鋁含量,使Cu和Cd由活性態(tài)向潛在活性態(tài)和非活性態(tài)轉(zhuǎn)化,降低了土壤重金屬的有效性.

3.2 改良劑處理后的土壤微生物群落平均吸光值(AWCD)以及Shannon和McIntosh指數(shù)均較對(duì)照有所提高,表現(xiàn)為:石灰>磷灰石>木炭>對(duì)照,表明改良劑處理后提高了土壤微生物利用碳源的能力,增加了土壤中能利用有關(guān)單一碳源底物的微生物數(shù)量.

3.3 改良劑處理后的土壤總體上增加了土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群的數(shù)量,并增加了土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性,相關(guān)性分析表明,土壤酸度和重金屬有效性是影響穩(wěn)定化修復(fù)重金屬污染土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性差異的主要因素.

參考文獻(xiàn)：

[1] Khan F I, Husain T, Hejazi R.An overview and analysis of site remediation technologies [J].Journal of Environmental Management, 2004,71(2):95-122.

[2] Karami N, Clemente R, Moreno-Jimenez E, et al.Efficiency of green waste compost and biochar soil amendments for reducing lead and copper mobility and uptake to ryegrass [J].Journal of Hazardous Materials, 2011,191(1-3):41-48.

[3] Madej N P, Perez-de-mora A, Burgos P, et al.Do amended, polluted soils require re-treatment for sustainable risk reduction? — Evidence from field experiments [J].Geoderma, 2010,159(1): 174-181.

[4] 周 航,周 歆,曾 敏,等.2種組配改良劑對(duì)稻田土壤重金屬有效性的效果 [J].中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2014,34(2):437-444.

[5] 黃益宗,郝曉偉,雷 鳴,等.重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)及其修復(fù)實(shí)踐 [J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,32(3):409-417.

[6] 曾希柏,徐建明,黃巧云,等.中國(guó)農(nóng)田重金屬問(wèn)題的若干思考[J].土壤學(xué)報(bào), 2013,50(1):186-194.

[7] 宓彥彥,譚長(zhǎng)銀,黃道友,等.湘江流域礦區(qū)Cd污染土壤的修復(fù)及其綜合利用 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,(8):56-59.

[8] 周 靜,崔紅標(biāo).規(guī)模化治理土壤重金屬污染技術(shù)工程應(yīng)用與展望--以江銅貴冶周邊區(qū)域九牛崗?fù)寥佬迯?fù)示范工程為例 [J].中國(guó)科學(xué)院院刊, 2014,29(3):336-343.

[9] 時(shí)雷雷,傅聲雷.土壤生物多樣性研究:歷史,現(xiàn)狀與挑戰(zhàn) [J].科學(xué)通報(bào), 2014,(6):493-509.

[10] Brim H, Heuer H, Kr?gerrecklenfort E, et al.Characterization of the bacterial community of a zinc-polluted soil [J].Canadian Journal of Microbiology, 1999,45(4):326-338.

[11] Brookes P.The use of microbial parameters in monitoring soil pollution by heavy metals [J].Biology and Fertility of Soils, 1995,19(4):269-279.

[12] Perez-de-mora A, Burgos P, Madejon E, et al.Microbial community structure and function in a soil contaminated by heavy metals: effects of plant growth and different amendments [J].Soil Biology & Biochemistry, 2006,38(2):327-341.

[13] Zhou D N, Zhang F P, Duan Z Y, et al.Effects of heavy metal pollution on microbial communities and activities of mining soils in Central Tibet, China [J].Journal of Food, Agriculture & Environment, 2013,11(1):676-681.

[14] Ji G, Silver S.Bacterial resistance mechanisms for heavy metals of environmental concern [J].Journal of Industrial Microbiology, 1995,14(2):61-75.

[15] 滕 應(yīng),黃昌勇.重金屬污染土壤的微生物生態(tài)效應(yīng)及其修復(fù)研究進(jìn)展 [J].土壤與環(huán)境, 2002,11(1):85-89.

[16] 李小林,顏 森,張小平,等.鉛鋅礦區(qū)重金屬污染對(duì)微生物數(shù)量及放線菌群落結(jié)構(gòu)的影響 [J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,30(3): 468-475.

[17] Li P, Wang X X, Zhang T L, et al.Effects of several amendments on rice growth and uptake of copper and cadmium from a contaminated soil [J].Journal of Environmental Sciences-China, 2008,20(4):449-455.

[18] Cui H B, Zhou J, Zhao Q G, et al.Fractions of Cu, Cd, and enzyme activities in a contaminated soil as affected by applications of micro-and nanohydroxyapatite [J].Journal of Soils and Sediments, 2013,13(4):742-752.

[19] 梁家妮.土壤重金屬Cu、Cd和F復(fù)合污染評(píng)價(jià)及修復(fù)技術(shù)探討 [D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[20] Tessier A, Campell P G, Bisson M.Sequential extraction procedure for the speciation of particulate trace metals [J].Analytical Chemistry, 1979,51(7):844-851.

[21] Vance E D, Brookes P C, Jenkinson D S.An extraction method for measuring soil microbial biomass C [J].Soil Biology & Biochemistry, 1987,19(6):703-707.

[22] Garland J L, Mills A L.Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization [J].Applied and Environmental Microbiology, 1991,57(8):2351-2359.

[23] Gray C W, Mclaren R G, Roberts A H C, et al.Sorption and desorption of cadmium from some New Zealand soils: effect of pH and contact time [J].Australian Journal of Soil Research, 1998,36(2):199-216.

[24] Bolan N S, Adriano D C, Mani P A, et al.Immobilization and phytoavailability of cadmium in variable charge soils.II.Effect of lime addition [J].Plant and Soil, 2003,251(2):187-198.

[25] Gray C W, Dunham S J, Dennis P G, et al.Field evaluation of in situ remediation of a heavy metal contaminated soil using lime and red-mud [J].Environmental Pollution, 2006,142(3):530-539.

[26] Chen X B, Wright J V, Conca J L, et al.Evaluation of heavy metal remediation using mineral apatite [J].Water Air and Soil Pollution, 1997,98(1/2):57-78.

[27] Cao X D, Ma L Q, Rhue D R, et al.Mechanisms of lead, copper, and zinc retention by phosphate rock [J].Environmental Pollution, 2004,131(3):435-444.

[28] Xu Y P, Schwartz F W, Traina S J.Sorption of Zn2+and Cd2+on hydroxyapatite surfaces [J].Environmental Science & Technology, 1994,28:1472-1480.

[29] Shahid M, Xiong T, Masood N, et al.Influence of plant species and phosphorus amendments on metal speciation and bioavailability in a smelter impacted soil: a case study of foodchain contamination [J].Journal of Soils and Sediments, 2014, 14(4):655-665.

[30] Demirbas A.Heavy metal adsorption onto agro-based waste materials: A review [J].Journal of Hazardous Materials, 2008, 157(2/3):220-229.

[31] Uchimiya M, Lima I M, Klasson K T, et al.Immobilization of Heavy Metal Ions (Cu-II, Cd-II, Ni-II, and Pb-II) by Broiler Litter-Derived Biochars in Water and Soil [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010,58(9):5538-5544.

[32] Hmid A, Chami Z A, Sillen W, et al.Olive mill waste biochar: a promising soil amendment for metal immobilization in contaminated soils [J].Environmental Science & Pollution Research, 2015,22(2):1444-1456.

[33] Epelde L, Lanz N A, Blanco F, et al.Adaptation of soil microbial community structure and function to chronic metal contamination at an abandoned Pb-Zn mine [J].FEMS Microbiology Ecology, 2015,91(1):1-11.

[34] Zabinski C A, Gannon J E.Effects of recreational impacts on soil microbial communities [J].Environmental Management, 1997, 21(2):233-238.

[35] Zhong W, Cai Z.Long-term effects of inorganic fertilizers on microbial biomass and community functional diversity in a paddy soil derived from quaternary red clay [J].Applied Soil Ecology, 2007,36(2):84-91.

[36] 胡君利,林先貴,尹 睿,等.浙江慈溪不同利用年限水稻土主要微生物過(guò)程強(qiáng)度的比較 [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008,28(1): 174-179.

[37] Fernández D A, Luque A R, Azcón R, et al.Effects of water stress, organic amendment and mycorrhizal inoculation on soil microbial community structure and activity during the establishment of two heavy metal-tolerant native plant species [J].Microbial Ecology, 2012,63(4):794-803.

[38] Wang Y P, Li Q B, Shi J Y, et al.Assessment of microbial activity and bacterial community composition in the rhizosphere of a copper accumulator and a non-accumulator [J].Soil Biology and Biochemistry, 2008,40(5):1167-1177.

[39] Kowalchuk G A, Buma D S, de Boer W, et al.Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms [J].Antonie van Leeuwenhoek, 2002,81:509-520.

[40] Kolb S E, Fermanich K J, Dornbush M E.Effect of charcoal quantity on microbial biomass and activity in temperate soils [J].Soil Science Society of America Journal, 2009,73(4):1173-1181.

[41] 張燕燕,曲來(lái)葉,陳利頂.Biolog EcoPlate(TM)實(shí)驗(yàn)信息提取方法改進(jìn) [J].微生物學(xué)通報(bào), 2009,36(7):1083-1091.

[42] 羅海峰,齊鴻雁,薛 凱,等.PCR-DGGE技術(shù)在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用 [J].生態(tài)學(xué)報(bào), 2003,23(8):1570-1575.

[43] Joynt J, Bischoff M, Turco R, et al.Microbial community analysis of soils contaminated with lead, chromium and petroleum hydrocarbons [J].Microbial Ecology, 2006,51(2):209-219.

[44] Muyzer G, De Waal E C, Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA [J].Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3):695-700.

[45] Khan S, Hesham A E L, Qiao M, et al.Effects of Cd and Pb on soil microbial community structure and activities [J].Environmental Science and Pollution Research, 2010,17(2):288-296.

[46] Ellis R J, Morgan P, Weightman A J, et al.Cultivation-dependent and-independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil [J].Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(6):3223-3230.

[47] 陳紅歌,胡元森,賈新成,等.垃圾填埋場(chǎng)細(xì)菌種群空間分布及組成多樣性研究 [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2005,25(6):809-815.

[48] B??th E.Effects of heavy metals in soil on microbial processes and populations (a review) [J].Water, Air, and Soil Pollution, 1989,47(3/4):335-379.

[49] Kan J, Obraztsova A, Wang Y, et al.Apatite and chitin amendments promote microbial activity and augment metal removal in marine sediments [J].Open Journal of Metal, 2013, 3(2):51-61.

Availability of soil Cu and Cd and microbial community structure as affected by applications of amendments.

CUI Hong-biao1,2, FAN Yu-chao1, ZHOU Jing2*, SHI Yu2, XU Lei2, GUO Xue-tao1, HU You-biao1, GAO Liang-min1(1.School of Earth and Environment, Anhui University of Science and Technology, Huainan 232001, China；2.Institute of Soil Science, Chinese Academy Sciences, Nanjing 210008, China).China Environment Science, 2016,36(1)：197～205

Abstract：Concentrations of available Cu and Cd, soil microbial community structure were investigated with one-time application of charcoal, lime, and apatite after four years in a heavy metal contaminated soil.Results showed that incorporation of amendments significantly increased soil pH, and decreased the concentrations of exchangeable acidity and aluminum.Lime and apatite were more effective than charcoal on transforming Cu and Cd from active to inactive fractions.The Biolog analysis showed that AWCD (average well color development) of charcoal (0.61), lime (0.76), and apatite (0.70) were 1.33, 1.65 and 1.52 times higher than that in the untreated soil at 192h.Moreover, the Shannon index, McIntosh index of soil microbes were higher in the amended soils compared with the control, and followed the order of lime > apatite > charcoal.The results indicated amendments treated soils all increased the abilities of the microbes to use carbon sources.Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) analysis showed that the amounts of dominant bacterial were significantly increased with the application of amendments.The Shannon index of soil microbes were increased 0.22, 0.39 and 0.24 in charcoal, lime and apatite compared with the control, respectively.Correlation analysis indicated that soil acidity and availability of Cu and Cd may be the main factors affecting the community structure of soil microbes in the soils.

Key words：heavy metal；availability；biolog；PCR-DGGE；microbial community structure

中圖分類號(hào)：X53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)01-0197-09

收稿日期：2015-05-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家"973"項(xiàng)目(2013CB934302);安徽理工大學(xué)博士、碩士基金(11276);中國(guó)科學(xué)院“STS”項(xiàng)目(KFJ-EW-STS-016);國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAD05B01)

作者簡(jiǎn)介：崔紅標(biāo)(1985-),男,安徽鳳臺(tái)人,講師,博士,主要從事土壤重金屬污染修復(fù)研究.發(fā)表論文8篇.