除草劑硝磺草酮對土壤微生物生態(tài)效應研究

孫約兵,王潤瓏,徐應明*,梁學峰,王 林,張貴龍(.農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,農業(yè)部產地環(huán)境質量重點實驗室,天津 3009；2.農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,天津市農業(yè)環(huán)境與農產品安全重點實驗室,天津3009；3.東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,黑龍江 哈爾濱 50030)

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除草劑硝磺草酮對土壤微生物生態(tài)效應研究

孫約兵1,2,王潤瓏2,3,徐應明1,2*,梁學峰1,2,王 林1,2,張貴龍1(1.農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,農業(yè)部產地環(huán)
境質量重點實驗室,天津 300191；2.農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所,天津市農業(yè)環(huán)境與農產品安全重點實驗室,天津300191；3.東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

摘要：采用室內培養(yǎng)試驗,研究了硝磺草酮對土壤酶活性和微生物群落功能多樣性的影響.結果表明,土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性隨硝磺草酮濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,但比對照處理都有所升高,分別增加了22.6%～41.0%和3.4%～54.2%,且在硝磺草酮濃度為50mg/kg時達到最大.與之相反,尿酶活性則降低了12.0%～18.6%,但差異性不明顯(P > 0.05).施用一定濃度的硝磺草酮激活了土壤微生物活性,微生物群落豐富度、均勻性和多樣性都呈增長趨勢,單孔的平均顏色變化率(AWCD)值和利用速率均隨硝磺草酮濃度增加而增大,微生物群落對碳水化合物類、氨基酸類、多聚物類、羧酸類、胺類和酚酸類利用率整體上均有所提高,與對照相比,最大增幅分別達到5.3、1.0、4.4、3.2、0.2和6.8倍,但不同濃度硝磺草酮處理下土壤微生物在利用碳源的類型上是存在一定的差異.

關鍵詞：硝磺草酮；酶活性；微生物群落；功能多樣性；土壤

* 責任作者, 研究員, ymxu1999@126.com

硝磺草酮(2-[(4-甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰]環(huán)己烷-1,3-二酮)作為一種芽前和苗后廣譜選擇性除草劑,因具有觸殺作用、持效性和后茬作物危害小而被廣泛使用.硝磺草酮在土壤中的降解半衰期為4.5～32d,在偏堿性土壤中,硝磺草酮以陰離子形態(tài)存在,吸附性減弱、淋溶性增強,可能污染地表水和地下水[1];在偏酸性土壤中,則易被土壤顆粒緊密吸附,一定程度上抑制了土壤微生物降解性能,致使硝磺草酮在土壤中滯留、累積,對土壤中非靶標生物造成不良影響,并逐漸影響土壤生態(tài)系統(tǒng)[2-3].因此,化學農藥在農田施用后對土壤微生物的影響已成為評價其生態(tài)安全性的一個重要指標[4-5].Crouzet等[6]通過研究土壤中藍藻微生物群落特征與硝磺草酮的劑量-效應關系發(fā)現(xiàn),施用100倍推薦劑量的硝磺草酮時,顯著影響了葉綠素含量以及藍藻基因結構和多樣性,并且藍藻光合作用生物量和微生物群落結構在最初7d表現(xiàn)出尤為敏感.研究還發(fā)現(xiàn),在施用10和100倍推薦劑量硝磺草酮后土壤微生物活性均受到抑制,其中100倍推薦劑量下土壤細菌和真菌基因結構最大相異度分別達到12%和28%[3].土壤酶活性和微生物群落對外源物質具有高度敏感性,常用作生態(tài)毒理學指標,判斷污染物對土壤污染程度及生態(tài)風險[7].然而,硝磺草酮對土壤酶活性以及微生物功能多樣性影響相關研究尚未見到報道.其合成工藝和產業(yè)化技術在我國已過行政保護期,目前國內已大規(guī)模投產,并大面積推廣使用.因此,亟需加強硝磺草酮對土壤生態(tài)毒理學相關研究.本文通過研究硝磺草酮對土壤酶活性和微生物活性影響,旨在了解其土壤生物學生態(tài)特征效應,為科學合理地施用硝磺草酮,減少環(huán)境風險提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑土采自中國科學院海倫農業(yè)生態(tài)試驗站農田土壤,均為0～20cm表層土,風干后過2mm尼龍篩備用,其基本理化性質為pH值7.8,黏粒28.8%,砂粒5.2%,粉粒66.0%,陽離子交換量26.4cmol/kg,有機質含量3.6%,全氮1.3mg/kg,有效磷82.6mg/kg,有效鉀132mg/kg.

硝磺草酮購自Sigma Aldrich技術有限公司,純度≥99.9%.

1.2 實驗設計

準確稱取100g過篩的干土,放入玻璃錐形瓶中,并用蒸餾水調節(jié)土壤含水量保持在15%的最大田間持水量(WHC),混勻后,加塞密封,置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中(20 ℃)預培養(yǎng),以激活土壤內源微生物的活性.預培養(yǎng)7d后,向土壤樣品中加入硝磺草酮,使其濃度分別為0、20、50和100mg/kg,立即塞緊瓶塞,用封口膜封口,漩渦混合2min使硝磺草酮在土壤中能夠均勻分散.置于恒溫(20℃)恒濕箱中培養(yǎng),定期稱重以補充缺失的水分.

1.3 測定方法

1.3.1 土壤酶活性測定 土壤酶活性分析方法參照《土壤酶及其研究方法》[8],過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法測定,以每克土滴定H2O2消化0.1mol/L KMnO4的毫升數(shù)表示,單位為mL/(g·h);脲酶活性的測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法,以37℃下培養(yǎng)24h后每克土中NH4-N的毫克數(shù)表示,單位為mg NH4-N/(g·h);蔗糖酶活性的測定:采用3,5-二硝基水楊酸比色法,于波長508nm處比色,以37℃下培養(yǎng)24h后每克葡萄糖毫克數(shù)表示,單位為mg/(g·h).

1.3.2 微生物群落功能多樣性測定 采用Biolog-ECO微平板技術分析土壤微生物群落功能多樣性特征[9].培養(yǎng)7d,間隔24h用BIOLOG自動讀數(shù)裝置在590和750nm下測定其吸光值.

1.4 數(shù)據(jù)分析

微生物代謝活性為590nm和750nm下吸光度差值，單孔平均顏色變化率(AWCD)的算法為:

式中:Ci為每個培養(yǎng)基孔的吸光值;Ri為對照孔的吸光值;n為培養(yǎng)基孔數(shù).土壤多樣性指數(shù)分析采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、Shannon均勻度指數(shù)(E)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)、McIntosh指數(shù)(U),計算公式分別為:

式中:Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板的相對吸光值總和的比值;S是有顏色變化的孔的數(shù)目;Ni為第i孔的相對吸光值.

采用SPSS 13.0軟件進行方差分析(ANOVA)、最小顯著差異分析(LSD)和主成分分析(PCA),所有數(shù)據(jù)均為3 次重復的平均值.

2 結果與討論

2.1 硝磺草酮對土壤酶活性的影響

土壤酶作為土壤肥力和土壤質量的生物活性指標和評價指標,參與生物化學過程和養(yǎng)分循環(huán),影響土壤中營養(yǎng)元素的轉化、循環(huán)和微生物豐度,是影響土壤微生態(tài)環(huán)境的重要因素,在一定程度上指示土壤環(huán)境的優(yōu)劣狀況[10-11].鑒于其具有穩(wěn)定、敏感等特性,可作為生物學診斷手段,反映外源污染物的污染程度及其對作物的危害[12].脲酶與土壤中氮轉化密切相關,與蛋白物質共同參與土壤氮素循環(huán)[13].添加硝磺草酮在一定程度上抑制了土壤尿酶活性(圖1),與對照相比,20～100mg/kg硝磺草酮處理時,尿酶活性降低了12.0%～18.6%,但不同處理間差異不顯著(P > 0.05).趙志強等[14]研究發(fā)現(xiàn),毒死蜱和丁硫克百威對脲酶活性都以抑制作用為主,其中施藥后的第1和3d,不同濃度毒死蜱處理與對照差異顯著(P<0.05).而苯噻草胺強烈抑制脲酶的活性,第6d土壤脲酶活性完全消失[15].這可能是投加農藥后微生物體內蛋白質與磷脂間穩(wěn)定的極性鍵或疏水性鍵被解離,從而改變細胞膜的結構,使細胞壁和細胞膜受到損傷,其生物合成機制和細胞膜分泌機能減弱,導致土壤脲酶活性降低[14,16-17].

圖1 不同濃度硝磺草酮對土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of different concentration of mesotrione on soil enzyme activity不同字母表示差異顯著(P<0.05)

過氧化氫酶具有解毒和抗逆功能,能有效防止土壤在新陳代謝中過氧化氫對生物體的毒害,其活性高低可以表征土壤腐殖質化強度大小和有機質轉化速度[18].土壤蔗糖酶可以增加土壤中的易溶性營養(yǎng)物質活性,與有機質的轉化和呼吸強度有密切關[19-20].如圖1所示,土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性隨硝磺草酮濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,但其活性都高于對照處理,分別增加了22.6%～41.0%和3.4%～54.2%.其中,在硝磺草酮濃度為50mg/kg時達到最大,蔗糖酶活性顯著高于其他處理(P<0.05),過氧化氫酶活性也明顯高于0～20mg/kg硝磺草酮處理(P < 0.05).投加農藥后直接或間接地影響土壤酶活性,前者對土壤酶直接接觸產生作用,后者農藥與土壤生物的作用而間接影響土壤酶活性[21].硝磺草酮對土壤過氧化氫酶和蔗糖酶具有激活作用,一方面由于硝磺草酮本身被土壤微生物用作能源或碳源,另一方面土壤中相關微生物受到硝磺草酮脅迫后的應激反應,分泌大量的過氧化氫酶來消除毒害[3,14].

2.2 硝磺草酮處理下土壤微生物群落AWCD和碳源利用特征

平均吸光值(AWCD)可作為土壤微生物整體活性的有效指標,即指示微生物對單一碳源的利用能力.培養(yǎng)開始后,利用BIOLOGTM生態(tài)板每間隔24h動態(tài)測定不同濃度硝磺草酮處理下,土壤樣品中微生物利用31種碳源的AWCD變化曲線特征(圖2),隨著培養(yǎng)時間的延長,各處理土壤微生物利用碳源量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,在觀測周期內AWCD總體上持續(xù)增加.然而,在最初的48h,0～100mg/kg硝磺草酮處理下,AWCD值和增加幅度都很小,表明在48h之內碳源基本未被利用.隨培養(yǎng)時間的延長,AWCD值快速增加,說明碳源被迅速利用.在120h內,0和20mg/kg、50和100mg/kg硝磺草酮處理下的AWCD值和變化速率相差不大.隨著培養(yǎng)時間的延長,土壤微生物群落利用碳源的能力隨硝磺草酮濃度增加而增大,說明土壤微生物群落代謝隨硝磺草酮濃度增加而加快,活性增強,這與張紅等[22]研究一致.添加HCH后土壤微生物群落的AWCD值和變化速度均高于空白土壤,并且隨著農藥濃度的加大,AWCD值的變化速率也越來越快.微生物對加入到土壤中的農藥具有一定的耐受性,當開始加入時,微生物會利用農藥為碳源進行分解作用,從而刺激了微生物繁殖[6,22].

圖2 不同處理下土壤微生物群落AWCD值的變化Fig.2 Variations in microbial AWCD under different treatments

土壤微生物對不同碳源利用能力的差異在一定程度上指示土壤微生物群落的結構組成[23].BIOLOG-ECO板含有31種碳源,根據(jù)碳源官能團不同將其分為6類:碳水化合物類12種、羧酸類5種、酚酸類2種、胺類2種、多聚物類4中、氨基酸類6種.不同硝磺草酮處理下土壤微生物群落對6類碳源的利用情況見圖3,由圖3可以看出,土壤微生物在碳源代謝方面優(yōu)勢群落依次為碳水化合物代謝群落、酚酸代謝群落、氨基酸代謝群落、多聚物代謝群落和羧酸類代謝群落.投加硝磺草酮后微生物群落整體上對碳水化合物類、氨基酸類、多聚物類、羧酸類、胺類和酚酸類利用率都有所提高,與對照相比,分別增加了1.7～5.3、0.9～1.0、1.9～4.4、0.4～3.2、0.1～0.2 和0.1～6.8倍(20mg/kg硝磺草酮處理下氨基酸和胺類利用情況除外).微生物群落對碳水化合物和酚酸的利用程度也隨之增大,當硝磺草酮濃度≥50mg/kg時,顯著高于對照處理(P<0.05).多聚物類和羧酸類利用率隨硝磺草酮濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在硝磺草酮為50mg/kg時達到最高,而不同濃度硝磺草酮處理下胺類的利用程度差異不明顯(P>0.05).農藥污染改變土壤中原有群落內部的種群之間的競爭關系,導致原有優(yōu)勢種群失去優(yōu)勢,或者一部分微生物產生抗藥性,豐富了不同種群微生物,從而使土壤微生物群落多樣性增加[24].

圖3 不同硝磺草酮處理下土壤微生物對不同類型碳源利用情況Fig.3 Utilization of different type substrates of soil microbial communities under treatment of mesotrione不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 土壤微生物群落代謝功能多樣性分析

土壤微生物功能多樣性可以較為敏感地反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能演變及環(huán)境的變化,可指標微生物種類和功能的變異[25].Shannon-Wiener指數(shù)(H)反映土壤微生物的豐富度,H值越大,說明所含物種越豐富;Simpson 指數(shù)(D)用于評價系統(tǒng)中最常見的物種優(yōu)勢度,指數(shù)越大,群落多樣性越好;McIntosh 指數(shù)(U)和Shannon均勻度(E)是基于群落物種多維空間上歐式(Euclidian)距離多樣性的指數(shù)和均勻度,McIntosh 指數(shù)越大,說明群落均勻性越好,Shannon 均勻度指數(shù)越大,說明群落越均一,種類之間個體分布越均勻[23,26].由表1可知,添加硝磺草酮后,土壤微生物群落特征多樣性指數(shù)隨著土壤中硝磺草酮含量的增加,呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢,群落優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh指數(shù)隨其濃度增加而增加,與對照相比,多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh指數(shù)分別增加了2.9%～5.5%、3.7%～4.2%和4.0%～126.8%,其中優(yōu)勢度指數(shù)和McIntosh指數(shù)分別50～100mg/kg和100mg/kg于土壤中微生物群落總體代謝活性增加,物種豐富度和優(yōu)勢度增加.當加入到土壤中的DDT和HCH含量稍低時,微生物會利用農藥為碳源進行分解作用,從而刺激了微生物的生長,表現(xiàn)出土壤微生物群落的豐富度、均勻性和多樣性都呈增長趨勢[22].與之相反,投加20～100mg/kg硝磺草酮后,土壤微生物群落均勻度有效抑制,但不明顯,僅比對照處理降低了0.2%～3.3%,可能是由于農藥濃度增大時,抑制了某些微生物菌種的生長,致使群落均勻性下降[22].土壤微生物群落在利用碳底物的功能多樣性上,農藥污染對土壤微生物群落中利用碳底物微生物物種均一度上造成極顯著差異,表現(xiàn)出農藥嚴重污染的土壤微生物群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh指數(shù)均顯著低于未污染土壤[27].

表1 投加硝磺草酮后土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indices of microbial community in soils treated with mesotrione

2.4 主成分分析

為了進一步了解硝磺草酮對土壤微生物代謝能力的影響,利用培養(yǎng)122h的AWCD值進行主成分分析,根據(jù)提取的主成分個數(shù)一般要求累計方差貢獻率達到85.0%的原則[28],共提取5個主成分,累計貢獻率達85.5%.其中第1主成分(PC1)的方差貢獻率為32.4%,第2主成分(PC2) 為23.2%,第3～6主成分貢獻率均較小,分別為14.5%、9.1%和6.2%,故選取前2個主成分分析,其載荷值見表2.主成分分析中載荷因子反映主成分與碳源利用的相關系數(shù),載荷因子越高,表明該碳源對主成分的影響越大.由表可以看出,PC1中具有較高相關性的碳源有17種,其中碳水化合物類6種,羧酸類2種,多聚物類3種,胺類2種,氨基酸4種,表明影響第一主成分的碳源主要有碳水化合物、多聚物類、胺類和氨基酸.而與PC2具有較高相關性的碳源類型主要有碳水化合物類、羧酸類、酚類、多聚物類和氨基酸類,分別有6、2、2、2和2種.上述結果表明,不同濃度硝磺草酮處理下土壤微生物在利用碳源的類型上是存在差異的.土壤微生物對碳源的選擇性利用與對照存在明顯差異,一方面反映了除草劑污染土壤微生物利用能源碳的種類發(fā)生了轉移,另一方面也顯示了土壤微生物群落功能正?；璧纳卣靼l(fā)生了改變[4].

表2 添加硝磺草酮后土壤中31種碳源的主成分載荷因子Table 2 Loading factors of principle components of 31sole carbon sources in soils after applied mesotrione

由圖4可知,不同濃度硝磺草酮處理土壤微生物群落對31種碳源利用情況的主成分分析坐標體系中存在明顯的空間分異,表現(xiàn)出投加硝磺草酮后微生物群落存在一定的不穩(wěn)定性.不同含量硝磺草酮處理后土壤微生物在PC2上的得分值分布一致,絕大多數(shù)分布為正值,而在PC1軸上,主要分布在正方向上.圖中還可以看出,隨硝磺草酮濃度增加其得分值排列較為緊密,離散度較小.

圖4 不同處理土壤微生物碳源利用主成分分析因子載荷Fig.4 Loading for principal component analysis (PCA) of carbon sources of microbial community in soil under different treatments of mesotrione

綜上所述,作為一種廣譜性的除草劑,在一定的劑量范圍內施用硝磺草酮對土壤生態(tài)環(huán)境效應影響較小,土壤酶活性和微生物功能多樣性沒有受到明顯抑制,但仍需開展硝磺草酮在其他類型土壤以及長期毒性的評估研究.

3 結論

3.1 施加硝磺草酮激活了土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性,其活性隨硝磺草酮濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,與之相反,尿酶活性受到一定程度的抑制作用.

3.2 投加一定濃度的硝磺草酮激活了土壤微生物活性,碳源利用能力得到提升,微生物對碳水化合物類、酚酸類、氨基酸類、多聚物類和羧酸類利用率均有所增加,但微生物在利用碳源的類型上是存在一定的差異.

3.3 施用硝磺草酮后,由于土壤中微生物群落總體代謝活性增加,微生物群落的豐富度、均勻性和多樣性都呈增長趨勢,均勻度有所抑制,但不明顯.

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Ecological Effects of herbicide mesotrione on soil microbial communities.

SUN Yue-bing1,2, WANG Run-long2,3, XU Ying-ming1,2*, LIANG Xue-feng1,2, WANG Lin1,2, ZHANG Gui-long1(1.Key Laboratory of Original Environmental Quality, Ministry of Agriculture, Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China；2.Tianjin Key Laborary of Agro-Environment and Agro-Product, Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China；3.College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：190～196

Abstract：The influence of mesotrione on soil enzyme activities and microbial community functional diversity in soils were investigated.The results showed that the activities of catalase and invertase first enhanced and then decreased with the increase of the concentration of mesotrione, while catalase and invertase activities under different treatments of mesotrione were higher than those of the control soil, resulting in from 22.6% to 41.0% and from 3.4% to 54.2%, respectively, increase when compared with CK.By contrast, urease activity was suffering from 12.0% to 18.6% reduction in comparison with the control, but there was no significantly different among the treatments of 0～100mg/kg mesotrione.The application of mesotrione inspired the activity of microbial community, and the abundance, diversity and evenness of soil microbial community were increased in soil.The values of average well color development (AWCD) and variation rate increased with increasing of mesotrione.Meanwhile, the utilization efficiency of carbohydrate, amino acid, polymer, aamine, carboxylic acid phenolic acid by soil microorganisms were increased as a whole, with the maximum of 5.3, 1.0, 4.4, 3.2, 0.2 and 6.8 times in contrast with the control group, but there were certain differences in the type of utilizing carbon by soil microbes under a serial contents of mesotrione.

Key words：mesotrione；enzyme activity；microbial community；functional diversity；soil

中圖分類號：X53,X171.1,S154.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)01-0190-07

收稿日期：2015-05-25

基金項目：國家自然科學基金項目(21107056);公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203045);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項

作者簡介：孫約兵(1978-),男,安徽樅陽人,研究員,博士,主要從事污染土壤修復與生態(tài)治理的研究.發(fā)表論文80余篇.