糖尿病大鼠陰莖海綿體GSH、GGSSSSGG和GSH//GGSSSSGG 對eeNNOOSS表達(dá)的影響*

曹會峰 馬 龍 胡存利羅振國 杜從林 桂士良佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科（黑龍江佳木斯 154007）

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糖尿病大鼠陰莖海綿體GSH、GGSSSSGG和GSH//GGSSSSGG 對eeNNOOSS表達(dá)的影響*

曹會峰 馬 龍 胡存利**羅振國 杜從林 桂士良
佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科（黑龍江佳木斯 154007）

摘要目的 探究在糖尿病大鼠陰莖海綿體中還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和GSH/ GSSG對內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)的影響。方法 30只SD級8周齡健康雄性大鼠，8只作為正常對照組（C組），剩余22只作為糖尿病實(shí)驗組（D組）；D組大鼠高脂高糖喂養(yǎng)4周后腹腔注射鏈脲佐菌素（40mg/kg）建DM模型；C組大鼠未作特殊處理。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后，注射阿撲嗎啡（apomorphine,APO），觀察陰莖勃起情況；所有大鼠測定陰莖海綿體內(nèi)壓/平均頸動脈壓（ICPmax/MAP）后處死，采集血液、陰莖組織，測定GSH、GSSG、睪酮含量，免疫組化和 Western 印跡法檢測eNOS的表達(dá)。結(jié)果 與C組相比較，D組大鼠陰莖組織中GSH含量、GSH/ GSSG比值、eNOS含量明顯降低（P＜0.05），而GSSG的含量明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論 糖尿病大鼠陰莖海綿體中GSH和GSSG、GSH/GSSG影響eNOS的表達(dá)，在糖尿病性陰莖勃起功能障礙機(jī)制中起重要作用。

關(guān)鍵詞糖尿病;勃起功能障礙;谷胱甘肽;一氧化氮合酶

**通訊作者,E-mail:jmsdxhcl@163.com

Key woorrddss diabetes mellitus ；erectile dysfunction;Glutathione;Nitric Oxide Synthase

勃起功能障礙（erectile dysfunction,ED）是指陰莖不能達(dá)到和（或）維持足以進(jìn)行滿意的性交，病程持續(xù)3個月以上。而ED患者中有35%～75%是糖尿?。―M）患者[1]。由DM誘發(fā)的ED稱之糖尿病性勃起功能障礙（diabetes mellitus induced erectile dysfunction,DMED）[2]。流行病學(xué)臨床調(diào)查顯示，與同年齡階段非DM男性相比，DM男性罹患ED的平均年齡要早10～15年[3]。糖尿病患者的慢性高血糖狀態(tài)，過多的活性氧（reactive oxygen species,ROS）、谷胱甘肽水平下降，引起內(nèi)皮受損，使內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性和產(chǎn)量降低是DMED的重要發(fā)病機(jī)制[4]。還原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）及氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原緩沖對之一，參與ROS介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路的多個環(huán)節(jié)。本研究通過測定糖尿病大鼠陰莖中的GSH、GSSG、GSH/GSSG 與eNOS，探究GSH、GSSG、GSH/GSSG對eNOS的影響，及在DMED中的作用。

材料及方法

一、主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（streptorotocin,STZ,Sigma公司），阿撲嗎啡（apomorphine,APO,Sigma公司），血糖儀及試紙（三諾生物技術(shù)傳感股份有限公司），GSH 和GSSG檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗大鼠NOS3 IgG（Santa Cruz Biotechnology公司），HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG（Santa Cruz Biotechnology公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），bio-tek多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司），數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能科技有限公司），eNOS生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Pclab-UE生物醫(yī)學(xué)信號采集系統(tǒng)。

二、實(shí)驗動物及飼料

8周齡健康SD雄性大鼠30只（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心），體質(zhì)量為（233±12）g。高脂高糖飼料，配方：5%蔗糖+10%豬油+1.5%膽固醇（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司）。

三、動物分組及2型糖尿病模型建立

1.SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后分組；隨機(jī)選取8只，為對照組（C組），普通大鼠飼料喂養(yǎng)；剩余22只大鼠作為實(shí)驗組（D組），給予高脂高糖飼料飲食。所有大鼠充足飲水，室溫（26±2）℃，濕度（60±5）%，半天光照，半天黑暗。

2.STZ的配置及注射 檸檬酸用雙蒸水配成A液，檸檬酸鈉用雙蒸水配成B液；注射前將A、B液按1:1.32的比例配成0.1mmol/L的緩沖液，調(diào)節(jié)pH=4.35；稱取STZ，于暗處冰浴中配成1%STZ溶液。按40mg/kg，30min內(nèi)腹腔注射完畢；注射后禁食4h并給予5%葡萄糖皮下注射；3d后測血糖，未成模者半劑量追加給藥；注射一周后測定空腹血糖，以血糖＞16.7mmol/L為DM造模成功。

四、AAPPOO實(shí)驗

大鼠建模8w后，暗室適應(yīng)10min，頸項部皮膚松軟處注射APO（濃度40μg/mL），劑量100μg/kg，觀察30min內(nèi)大鼠陰莖勃起次數(shù)。以陰莖頭充血及陰莖體增長為勃起1次。每組陰莖勃起者所占百分比為該組陰莖勃起率。

五、陰莖海綿體內(nèi)壓（IICCPP）及平均動脈壓（MMAAPP）測定

大鼠成模8周后，用1 0 %的水合氯醛（0.35mL/100g）腹腔注射麻醉，仰臥固定在解剖板上。于大鼠下腹部做一正中切口，逐層打開腹腔，用玻璃針充分暴露前列腺后外側(cè)。在前列腺和輸精管之間找到盆腔神經(jīng)叢，并小心剝離出陰莖海綿體神經(jīng)。游離坐骨海綿肌，暴露陰莖腳，用充滿肝素的頭皮針穿刺陰莖海綿體，測定海綿體內(nèi)壓。在大鼠頸部正中切口，逐層分離找到氣管，于氣管左側(cè)用玻璃針分離左頸動脈1cm及迷走神經(jīng)；用充滿肝素的硬膜外麻醉導(dǎo)管（Size:1.0）插入頸動脈并固定，勿使滑脫。設(shè)置參數(shù)（刺激電壓5V，頻率15Hz，波幅5ms，持續(xù)時間50s），連接傳感器，阻斷三通與大氣相連，排盡空氣，軟件調(diào)零，觀察并記錄測定結(jié)果。

六、樣本采集

大鼠測壓完畢后，心臟采血5mL，4 000×g，離心10min，取上清，分裝，-80℃貯存。陰莖去掉白膜、陰莖頭、血管、尿道，并將組織于PBS液中漂洗3次，漂洗掉組織中的血液，-80℃貯存待用。

七、GSSGG、GGSSHH測定

陰莖樣品GSSG、GSH測定液氮下研磨陰莖組織，每10mg研碎組織加入30μL M試劑（為GSH、GSSG、GSH/GSSG測定試劑盒中的蛋白去除試劑M溶液），充分旋轉(zhuǎn)震蕩，4℃靜置10min，4℃下11 180×g，離心10min，取上清液。使用96空板，用酶標(biāo)儀測定A412吸光度，并計算含量。

八、T測定

取血2mL，測定血清T。

九、免疫組化（SSPP法）檢測陰莖組織eeNNOOSS表達(dá)

石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；3% H2O2去離子水孵育，PBS沖洗；滴加試劑A，室溫孵育10～15min，傾去；滴加一抗，37℃孵育2.5h，PBS沖洗，3min×3次；滴加試劑B，室溫孵育15min，PBS沖洗，3min×3次；滴加試劑C室溫孵育15min，PBS沖洗，3min×3次；DAB顯色；自來水充分沖洗；封片；顯微鏡下觀察eNOS的表達(dá)分布。

十、Western BBlloott法檢測大鼠陰莖中eeNNOOSS的含量

陰莖組織稱重后，液氮下研磨，將研碎組織移入玻璃勻漿器中，冰浴下充分勻漿研磨。將勻漿液于4℃下22 912×g，離心5min，提取上清液分裝，-20℃下保存待用。BCA法測定蛋白濃度。煮樣，樣品冷卻后-20℃貯存待用。制備濃縮膠、分離膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（1:500稀釋）孵育過夜，二抗（1:5000稀釋）孵育，顯色曝光，掃描膠片，結(jié)果以eNOS/β-actin進(jìn)行分析。

十一、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠血糖、體質(zhì)量及生長狀況變化

1只大鼠注射STZ時因操作不當(dāng)死亡，注射STZ后第2天有5只大鼠因低血糖死亡，第三天空腹檢測血糖，有5只大鼠未成模，經(jīng)追加半劑量STZ后有2只大鼠血糖達(dá)標(biāo)。實(shí)驗組共有12只大鼠血糖持續(xù)大于16.7mmol/L。成模后大鼠逐漸出現(xiàn)糖尿病典型的“三多一少”癥狀，隨著病情的進(jìn)展，DM大鼠逐漸表現(xiàn)出毛色干枯萎黃、體質(zhì)量下降、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。

二、各組大鼠AAPPOO實(shí)驗、血清睪酮（T）、海綿體內(nèi)壓/平均頸動脈壓（IICCPPmmaaxx//MMAAPP）

注射APO后，可見陰莖勃起的大鼠，用雙前爪抓住陰莖，并舔舐陰莖頭；兩組大鼠都有不同程度的打呵欠。勃起功能測評，D組明顯低于C組，測定結(jié)果見表1。

表1　 糖尿病組正常對照組勃起次數(shù)、勃起率、T和CIPmax/MAPP((55VV))比較（xx±ss）

三、各組大鼠陰莖組織中GSSG、GSH、GGSSHH// GGSSSSGG及血清睪酮含量比較

GSSG含量D組較C組明顯升高（P＜0.05）；GSH含量D組明顯比C組大鼠血漿內(nèi)含量低（P＜0.05）。C組GSH/GSSG比值高于D組（P＜0.05）。血清睪酮D組明顯低于C組（P＜0.05）。見圖1。

圖1　 兩組大鼠陰莖組織中 GSH,GSSG.GSH/GSSSGG 及血清中T水平A：與D組比較，*：P＜0.05；B：與D組比較，#：P＜0.05

四、eeNNOOSS在陰莖海綿體表達(dá)情況

eNOS主要在陰莖海綿體血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，與正常組相較，糖尿病組表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

五、 GSH,GSSG,GSH/GSSG 與eeNNOOSS相互關(guān)系

實(shí)驗數(shù)據(jù)采用pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示GSH與eNOS表達(dá)含量呈正相關(guān)（r=0.773,P=0.003）；GSH/GSSG與eNOS呈正相關(guān)（r=0.757,P=0.004）而eNOS與GSSG呈負(fù)相關(guān)（r =-0.831，P=0.001）。

圖2　eNOSS在兩組大鼠陰莖組織的表達(dá)免疫組化觀察（×400）示：eNOS主要表達(dá)于陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞，在海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)也有少量表達(dá)。Western蛋白印跡檢測eNOS表達(dá)，eNOS表達(dá)量D組較C組顯著降低（P<0.05）；箭頭表示蛋白質(zhì)eNOS表達(dá)位置

討 論

我國一項納入5 477例2型糖尿病患者的研究[5]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者ED的患病率為75.2%。雖然糖尿病是ED發(fā)生的重要原因之一，但尚未得到臨床醫(yī)師和患者本人的充分重視，其發(fā)病機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

NO-cGMP信號通路是ED分子機(jī)制的核心通路,當(dāng)性刺激信號傳導(dǎo)至陰莖海綿體時，非膽堿能神經(jīng)末梢和陰莖海綿體血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放nNOS和eNOS[6]。eNOS在二聚體狀態(tài)下可發(fā)生下列反應(yīng)：。NO以彌散的方式進(jìn)入相鄰的平滑肌細(xì)胞內(nèi)，并與細(xì)胞內(nèi)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase,sGC）上的血紅素（Heme）結(jié)合，激活sGC；在sGC 的作用下三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，cGMP作用于蛋白激酶G（protein kinase G,PKG），進(jìn)而抑制細(xì)胞膜上的L型鈣離子通道（L-Ca2+）的活性，阻止鈣離子內(nèi)流[7]，同時促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度降低。胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度降低后，一方面使胞質(zhì)內(nèi)的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase,MLCK）失活，磷酸化的肌球蛋白輕鏈（myosin light chain,MLC）在肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase,MLCP）的作用下脫磷酸化，導(dǎo)致平滑肌舒張；另一方面抑制細(xì)胞模上鈣離子激活的氯離子通道（CaCCs），減少胞質(zhì)內(nèi)氯離子外流[8]，活細(xì)胞膜上的大電導(dǎo)鉀離子通道（BKCa）和ATP依賴性鉀離子通道（KATP），使胞內(nèi)鉀離子外流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成超級化電位，最終使海綿體平滑肌細(xì)胞肌球蛋白輕鏈（MLC）去磷酸化而舒張，引發(fā)陰莖勃起[9]。同樣nNOS亦作用于L-精氨酸，經(jīng)NO-cGMP信號通路，在陰莖舒張時起作用。而通路任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題， 都會導(dǎo)致ED的發(fā)生。

本研究中，D組大鼠出現(xiàn)典型的2型糖尿病“三多一少”癥狀，血糖持續(xù)大于16.7mmol/L，2型糖尿病造模成功。檢測中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠陰莖勃起次數(shù)、勃起率、陰莖海綿體內(nèi)壓均明顯低于正常組，出現(xiàn)勃起功能障礙；進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體內(nèi)壓、血清睪酮均低于對照組，證實(shí)陰莖海綿體內(nèi)壓、血清睪酮與陰莖勃起有直接關(guān)系。

糖尿病進(jìn)程中的eNOS解偶聯(lián)，NO產(chǎn)生減少和ROS增加，繼發(fā)血管內(nèi)皮損傷是DMED重要機(jī)制[10]。解偶聯(lián)機(jī)制主要包括：輔助因子四氫生物蝶呤（BH4）、底物L(fēng)-Arg的耗竭和eNOS二聚體的破壞。在糖尿病的高血糖狀態(tài)下，eNOS的解偶聯(lián)是由NAD(P)H產(chǎn)生的超氧化物觸發(fā)的。解偶聯(lián)的狀態(tài)，電子通常是從一個亞基的還原酶區(qū)域流向另一個亞基的氧化酶區(qū)域；激活的eNOS不能催化L-Arg氧化生成L-胍氨酸和NO，但是eNOS仍然能夠接受來自NADPH的電子并傳遞給另一底物O2，導(dǎo)致最終的產(chǎn)物為O2-[11]。在高血糖下eNOS解離為單體，介導(dǎo)下列反應(yīng)公式為：。ONOO-使 BH4氧化，是BH4減少的主要原因，促進(jìn)eNOS的解偶聯(lián)，使內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放NO減少，這一病理生理是導(dǎo)致DMED重要致病機(jī)制。

實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠陰莖組織中GSH含量、GSH/GSSG比值均低于正常組，GSSG含量高于正常組，而且統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)eNOS與GSH、GSH/GSSG正相關(guān)，與GSSG負(fù)相關(guān)。GSH是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和蛋白質(zhì)功能和完整性的重要物質(zhì)，能夠調(diào)制氧化還原信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠延緩DMED的發(fā)生[12]。GSH可以抑制NADPH及細(xì)胞色素P450還原酶的活性，減少ROS的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)[Ca2+]隨著GSSG水平的高低成比例地升高，其主要原因是GSSG可直接與IP3受體/通道結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高[13]。GSH/GSSG比值反映蛋白巰基化程度，是細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)變化的主要影響因素[14]。GSH、GSSG以修飾參與信號傳導(dǎo)蛋白分子中的巰基改變其分子結(jié)構(gòu)及活性的方式參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，不僅參與eNOS解偶聯(lián)，還影響著鈣離子通道的活性及含量，參與DMED的多個環(huán)節(jié)。高血糖下氧自由基增多和NADPH水平降低，GSH耗竭，致使NO減少，GSSG增加，進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮的損傷，導(dǎo)致海綿體舒張功能障礙[15]。Zweier和Chen等[14,16]發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽參與“氧化應(yīng)激”相關(guān)的一種修飾，即“蛋白質(zhì)谷胱甘肽化”（S-glutathionylation），可將eNOS從形成NO換成形成過氧化物。細(xì)胞內(nèi)GSSG高水平是觸發(fā)谷胱甘肽化修飾的eNOS解偶聯(lián)重要因素[17]。而蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化在eNOS的解偶聯(lián)中起著重要作用；能夠復(fù)位這一氧化-還原分子開關(guān)，從而恢復(fù)eNOS功能的藥物，對治療DMED有重要幫助。本研究雖然證實(shí)GSH、GSH/GSSG、GSSG與eNOS具有相關(guān)性，是影響eNOS表達(dá)的因素之一；但其間的復(fù)雜關(guān)系并不是簡單的因果關(guān)系，其機(jī)制仍有待進(jìn)一步細(xì)化研究。

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（2015-09-05收稿）

*基金項目資助： 黑龍江省自然科學(xué)基金（H2015073）；黑龍江省教育廳科學(xué)研究項目（12521542）；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項目（Zc2013-005）

The effect of GSH,GSSG and GSH/GSSG on eNOS expression in the penile corpus cavernosum of DMED rats＊

Cao Huifeng,Ma Long,Hu Cunli**,Luo Zhenguo,Du Conglin,Gui Shiliang
Department of Urology,The fi rst Affi liated Hospital to Jiamusi University,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China
Corresponding author:Hu Cunli,E-mail:jmsdxhcl@163.com

AbstractObjectivee To investigate effects of GSH,GSSG and GSH/GSSG on the expression of eNOS in the penile corpus cavernosum of DMED rats.Metthhooddss Thirty healthy male Sprague Dawley (SD) rats aged 8 weeks were randomly divided into the control group (C group,8 rats) and diabetes mellitus (DM) model group(D group,22 rats).The rats in D group were fed with high calorie and high sugar diet for 4 weeks,then intraperitioneally injected with streptozotocin (STZ,40mg/kg) to establish diabetes mellitus rat models.The rats in C group were given normal diet.At eighth weeks after STZ injection,the rats were injected with apomorphine,and their penile erections were observed to evaluate their erectile function.All rats were killed after detection of the maximal intracavernous pressure/mean arterial blood pressure(ICPmax/ MAP) using electrostmulation,levels of GSH,GSSG and testosterone in plasma and penis were measured,and the expression of eNOS in the penile corpus cavernosum was examined by immunohistochemistry and Western blot.Resultss Compared with those of the controls (C group),the expression levels of GSH,GSH/GSSG in the plasma and eNOS in the penile tissue of the model rats with diabetes mellitus were all decreased markedly(P<0.05),whereas GSSG level was signifi cantly increased(P<0.05).Concluussiioonn The low level of GSH and GSH/GSSG in the plasma and high concentration of GSSG in the penile corpus cavernosum of the diabetic rats will downregulate the expression of eNOS,which may be an important pathological mechanism for diabetes mellitus erectile dysfunction.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.003

中圖分類號R 698.1;R 587.1