電針不同穴位對(duì)功能性腹瀉大鼠空腸SERT蛋白及SERTmRNA表達(dá)的影響

劉智斌　楊曉航　牛文民　王　淵　劉思洋　朱先偉　王　強(qiáng)　王衛(wèi)剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

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電針不同穴位對(duì)功能性腹瀉大鼠空腸SERT蛋白及SERTmRNA表達(dá)的影響

劉智斌楊曉航牛文民王淵劉思洋△朱先偉王強(qiáng)王衛(wèi)剛▲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

摘要探討電針不同穴位對(duì)功能性腹瀉大鼠空腸黏膜SERT蛋白(5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)及SERTmRNA表達(dá)的影響。方法：成年SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、電針1組(取雙側(cè)上巨虛)、電針2組(取雙側(cè)曲池)、電針3組(取雙側(cè)天樞)、電針4組(取雙側(cè)大腸俞)，每組10只。以番瀉葉煎劑灌胃復(fù)制功能性腹瀉大鼠模型，通過電針刺激干預(yù)，測定空腸黏膜SERT蛋白和SERTmRNA表達(dá)。結(jié)果：電針Ⅲ組空腸中SERT蛋白和SERTmRNA水平明顯升高，與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論：電針可能是通過顯著提升SERT蛋白和SERTmRNA的表達(dá)，促使空腸腸神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)的5-HT 攝取增多，減弱神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，致使空腸腸蠕動(dòng)及分泌功能減弱，使得功能性腹瀉大鼠空腸功能恢復(fù)正常。電針3組作用優(yōu)于其他三組，提示取天樞干預(yù)功能性腹瀉效果更好。

主題詞功能性腹瀉/針刺療法穴，天樞動(dòng)物,實(shí)驗(yàn)大鼠

功能性腹瀉(Functional Diarrhea，F(xiàn)D)是一種臨床常見疾病，以持續(xù)地、反復(fù)地出現(xiàn)糊狀糞不伴有腹痛或腹部不適癥狀為主要表現(xiàn)，該病發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，其發(fā)病率占腹瀉總數(shù)的59%[1]。腸道動(dòng)力與SERT(serotonin reuptake transporter ,SERT)表達(dá)高低有著密切的關(guān)系[2]。本研究通過研究電針刺激不同穴位對(duì)FD大鼠空腸黏膜SERT蛋白及mRNA表達(dá)的影響，在分子生物學(xué)水平探討針刺調(diào)節(jié)空腸動(dòng)力障礙的穴位特異性。

1材料和方法

1.1動(dòng)物及分組SPF級(jí)3.5月齡的SD大鼠60只, 平均體質(zhì)量(230±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2014.036)，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、FD模型組、EA I組 (造模+電針雙側(cè)上巨虛)；EA Ⅱ組(造模+電針雙側(cè)曲池)、EA Ⅲ組(造模+ 電針雙側(cè)天樞)、EA Ⅳ組(造模+ 電針雙側(cè)大腸俞)，每組10只。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑3-16PK型通用臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Sigma公司)，Smartspec3000型紫外可見分光光度計(jì)(美國BIO-RAD公司)，NYCP-34ACG電泳儀(北京六一儀器廠)，90-2型恒溫磁力攪拌器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司)，Real-time PCR儀(美國stratagene公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國BIO-RAD公司)，SERT引物、內(nèi)參Gapdh引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、Trizol等(江蘇卡爾文生物科技有限公司)，HANS-200A電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，0.3mm×15mm寸毫針(蘇州華佗醫(yī)療器械廠)。

1.3大鼠模型復(fù)制采用番瀉葉90 g，6 倍量清水浸泡30 min，煎煮10 min 后，經(jīng)紗布過濾，在50℃下，濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓濃縮至300mL，即得到0.3g生藥/mL 藥液，-20℃冰箱內(nèi)保存，用時(shí)水浴加溫至25℃，按10 mL/kg的劑量灌胃，每天1次，連續(xù)造模14d[3]。為消除生物節(jié)律的影響，每天同一時(shí)間進(jìn)行束縛應(yīng)激。停止灌胃后各組繼續(xù)正常飼食、飲水，觀察14d，至第28天造模結(jié)束。

1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1電針1組(EAⅠ組)穴位定位：雙側(cè)上巨虛穴。根據(jù)李忠仁教授主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]動(dòng)物選穴標(biāo)準(zhǔn)，“上巨虛”穴：大鼠后肢足三里向下約5 mm 處。操作：選用“華佗牌”不銹鋼針，30號(hào)1寸毫針。常規(guī)消毒后，毫針刺入各組相應(yīng)穴位，針刺深度5 mm。電針儀：韓式電針儀( LH202H 型) ，疏密波，頻率為疏波2 Hz，密波15 Hz，刺激強(qiáng)度以保持針刺局部輕微抖動(dòng)為度(電流強(qiáng)度為1.5 mA，電壓1～3V)。時(shí)間：留針20 min，持續(xù)電刺激，每日1 次，10 次為1 療程，共治療1個(gè)療程。

1.4.2電針2組(EAⅡ組)穴位定位：雙側(cè)曲池穴。根據(jù)李忠仁教授主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]動(dòng)物選穴標(biāo)準(zhǔn)，“曲池”穴：橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中。操作方法及療程同上。

1.4.3電針3組(EAⅢ組)穴位定位：雙側(cè)天樞穴。根據(jù)李忠仁教授主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]動(dòng)物選穴標(biāo)準(zhǔn)，“天樞”穴：臍中旁開5 mm 。操作方法及療程同上。

1.4.4電針4組(EAⅣ組)穴位定位：雙側(cè)大腸俞穴。根據(jù)李忠仁教授主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]動(dòng)物選穴標(biāo)準(zhǔn)，“大腸俞”穴：第4腰椎棘突下，旁開5 mm。操作方法及療程同上。

1.4.5正常對(duì)照組及FD模型組每日1次采取與以上四組相同的捉拿固定，但不施加任何干預(yù)措施。

1.5指標(biāo)檢測方法1.5.1Western Blot檢測:應(yīng)用試劑盒進(jìn)行蛋白抽提， 勻漿至空腸組織完全裂解，將裂解液于4℃離心機(jī)中離心(10000×g,15min)，上清液轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存，用蛋白質(zhì)定量試劑盒及酶標(biāo)儀(Synergy2)測量562nm各孔光密度值，定量待測樣品蛋白濃度。得到樣品經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入SERT一抗(1:500)4℃過夜，Tris-HCL緩沖鹽溶液(TBST)反復(fù)漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:3000)室溫避光孵育2h，TBST漂洗后用ECL法顯影，結(jié)果用Bio-RAD Quantity one 圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析。以SERT的目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的比值代表個(gè)產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2 RT-PCR檢測方法：首先提取總RNA，用PBS沖洗組織,加Tripure，冰浴下超聲破碎細(xì)胞用氯仿振蕩，靜置后離心。每新離心管加異丙醇，混勻后離心，再加乙醇后混懸并洗滌沉淀, 再離心并除去上清后，沉淀到干燥器，使用超純水處理使其溶解沉淀。再采用RT-PCR法，共36個(gè)循環(huán)，在取PCR產(chǎn)物，就進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采集部分采用UVP凝膠分析系統(tǒng)，分析結(jié)果的方法與western blot相同。

2結(jié)果

2.1一般情況比較造模成功后大鼠進(jìn)食量減少，糞便粒數(shù)增加，處死后結(jié)腸內(nèi)殘留糞便粒數(shù)增多，給予電針干預(yù)后大鼠精神狀態(tài)變好，進(jìn)食量增加，糞便粒數(shù)增多，結(jié)腸內(nèi)殘留糞便粒數(shù)減少。

2.2腹瀉指數(shù)見表1。針灸干預(yù)第10天后，與模型組比較，電針2組、3組、4組均能顯著降低大鼠腹瀉指數(shù)(P<0.05)，電針3組大鼠腹瀉指數(shù)顯著降低(P<0.05)，說明電針3組效果較好。

表1　各組大鼠腹瀉指數(shù)的比較±s，n=10)

注:與空白組比較,▲P<0.01；與模型組比較, ◇P<0.05, ◆P<0.01。

2.3大鼠空腸SERT蛋白表達(dá)見圖1。

圖1　功能性腹瀉大鼠空腸SERT蛋白表達(dá)

由圖1可知，經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示,功能性腹瀉大鼠模型組與空白組相比其空腸SERT的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01) ,說明造?？梢允沟?-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SERT 蛋白呈低表達(dá)，導(dǎo)致腸神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)的5-HT 過少攝取，神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，致使腸蠕動(dòng)及分泌功能增強(qiáng)，出現(xiàn)腹瀉;天樞組能夠顯著增加SERT蛋白表達(dá)(P<0.05)，說明電針天樞可使空腸神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)的5-HT攝取增多，致使空腸蠕動(dòng)及分泌功能減弱；大腸俞組、上巨虛組和曲池組不能顯著影響SERT蛋白表達(dá)(P>0.05) 。

2.4各組大鼠空腸黏膜SERTmRNA表達(dá)比較見圖2。

圖2　功能性腹瀉大鼠空腸SERTmRNA表達(dá)

由圖2可知，經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示,模型組與空白組相比其空腸SERTmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01) ,說明造?？梢允沟?-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA-SERTmRNA呈低表達(dá)，導(dǎo)致腸神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)的5-HT 過少攝取，神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，致使腸蠕動(dòng)及分泌功能增強(qiáng)，出現(xiàn)腹瀉;天樞組能夠顯著增加SERTmRNA表達(dá)(P<0.05)，說明電針天樞可使空腸神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)的5-HT攝取增多，致使空腸蠕動(dòng)及分泌功能減弱；大腸俞組、上巨虛組和曲池組不能顯著影響SERTmRNA表達(dá)(P>0.05)。

3討論功能型腹瀉屬于中醫(yī)“泄瀉”范疇[5]。5-HT是一種聯(lián)系腦腸軸、參與調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其合成、釋放及再攝取的改變均可能影響胃腸道功能，且其活動(dòng)的終止與其發(fā)揮作用同樣重要，如果它不能被及時(shí)攝取，受體處過多的5-HT可以引發(fā)胃腸道動(dòng)力障礙，故其在FD的發(fā)病中有重要意義[6]；SERT是一種對(duì)5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將神經(jīng)突觸間隙尚未充分發(fā)揮生理效應(yīng)的5-HT超前攝取，對(duì)在其受體處持續(xù)時(shí)間和信號(hào)空間分布的穩(wěn)定調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[7-8]，所以說SERT的異常表達(dá)是FD發(fā)病的間接原因。綜上所述，SERT表達(dá)高低與腸道動(dòng)力和分泌具有較為密切的關(guān)系,因此為了研究電針刺激不同穴位對(duì)功能性腹瀉大鼠腸道動(dòng)力的調(diào)節(jié)作用，我們以SERT蛋白表達(dá)的變化為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

電針作為治療功能性腹瀉的方法之一, 療效確切, 作用穩(wěn)定而持久, 在臨床已得到證實(shí)。但針灸取穴的方法繁多復(fù)雜, 治療功能性腹瀉的特異性穴位處方的研究鮮見報(bào)道?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究體表刺激引起內(nèi)臟功能活動(dòng)的變化反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)段在溝通體表與內(nèi)臟中起到了至關(guān)重要的作用[9-10]。本研究根據(jù)神經(jīng)節(jié)段分布選取4組穴位處方, 觀察了不同穴位電針對(duì)功能性腹瀉大鼠空腸SERT蛋白及SERTmRNA的影響。其中，天樞穴，為大腸經(jīng)募穴，對(duì)胃腸功能可起到良性雙向、整體性調(diào)節(jié)作用；大腸俞，為大腸之氣轉(zhuǎn)輸之處，俞穴與臟腑有著直接的聯(lián)系，是臟腑經(jīng)脈之氣所輸注的部位，可調(diào)整腸道傳輸功能；曲池穴，為大腸經(jīng)合穴，可使空腸、回腸、空腸的蠕動(dòng)有即時(shí)性的改變, 蠕動(dòng)弱者增強(qiáng), 強(qiáng)者減弱；上巨虛穴為大腸經(jīng)下合穴，從“合治內(nèi)腑”的治療原則出發(fā)，按疾病所屬內(nèi)腑的不同，而取其相應(yīng)的下合穴治療。

本研究通過番瀉葉煎劑灌胃創(chuàng)立FD模型，首先，通過電針干預(yù)后，經(jīng)western blot檢測大鼠空腸SERT蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，電針刺激天樞穴相較于其他三組能夠明顯提高大鼠空腸SERT蛋白的表達(dá)，因此推測，電針刺激天樞穴可能通過提高SERT蛋白的表達(dá),增加空腸腸神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)的5-HT攝取，減弱神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，致使空腸腸蠕動(dòng)及分泌功能減弱，改善空腸動(dòng)力障礙抑制腸蠕動(dòng)，使功能性腹瀉大鼠空腸功能恢復(fù)正常，這可能是電針治療功能性腹瀉的機(jī)制之一；其次，經(jīng)RT-PCR檢測大鼠空腸SERTmRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，電針刺激天樞穴相較于其他三組能夠明顯升高大鼠空腸SERT蛋白的表達(dá)，因此推測，電針刺激天樞穴可能通過上調(diào)大鼠空腸黏膜SERT基因型的轉(zhuǎn)錄效率，從而使SERT基因表達(dá)上調(diào)，增加5-HT的重?cái)z取速率，從而影響5-HT相應(yīng)生理效應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，改善空腸動(dòng)力障礙抑制腸蠕動(dòng)，使功能性腹瀉大鼠空腸功能恢復(fù)正常。

本研究證實(shí)了電針對(duì)FD具有確切的療效，其作用機(jī)理可能與調(diào)節(jié)SERT蛋白及mRNA的表達(dá)相關(guān)，以天樞穴對(duì)其調(diào)節(jié)更為顯著，本法可能通過影響SERTmRNA轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而改變SERTmRNA蛋白表達(dá)量，最終良性調(diào)節(jié)FD大鼠空腸動(dòng)力。我們通過不同穴位之間的比較，最終明確了針刺調(diào)節(jié)空腸動(dòng)力障礙的穴位特異性，初步闡明了電針治療腹瀉的部分作用機(jī)制。

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(收稿2016-01-05；修回2016-01-25)

【中圖分類號(hào)】R442.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.04.060

*國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)(2011CB505204)

△西安醫(yī)學(xué)院(西安710002)

▲陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽712000)