窄譜中波紫外線通過(guò)下調(diào)miRNA-25表達(dá)促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖和黑素生成

董　妍，李文彬，鄭　雯，王　娟，馬慧群，曾維惠

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安　710004；2. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西西安　710003)

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◇基礎(chǔ)研究◇

窄譜中波紫外線通過(guò)下調(diào)miRNA-25表達(dá)促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖和黑素生成

董妍1，李文彬2，鄭雯1，王娟1，馬慧群1，曾維惠1

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安710004；2. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西西安710003)

摘要：目的研究窄譜中波紫外線(NB-UVB)對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成、酪氨酸酶活性及miRNA-25表達(dá)的影響，探討NB-UVB與miRNA-25間的關(guān)系以及NB-UVB治療白癜風(fēng)的可能作用機(jī)制。方法以40 mJ/cm2 NB-UVB作用于體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞72 h，觀察NB-UVB對(duì)細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素生成的影響；NB-UVB作用12 h后，檢測(cè)miRNA-25表達(dá)的變化。分別轉(zhuǎn)染miRNA-25模擬物、miRNA-25抑制劑和miRNA-25突變體，觀察細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素生成的變化。使用MTT法檢測(cè)黑素細(xì)胞活性；左旋多巴底物法測(cè)定酪氨酸酶活性；NaOH法檢測(cè)黑素生成，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miRNA-25表達(dá)量。結(jié)果40 mJ/cm2劑量的NB-UVB 作用細(xì)胞72 h后，黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性增大，黑素合成顯著增加(P<0.05)；NB-UVB作用12 h后，miRNA-25表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。下調(diào)miRNA-25表達(dá)后，黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成增加；過(guò)表達(dá)miRNA-25后，黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性降低，黑素生成減少；過(guò)表達(dá)miRNA-25后部分抑制了NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用。結(jié)論NB-UVB可能部分通過(guò)下調(diào)黑素細(xì)胞miRNA-25的表達(dá)，促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、增加酪氨酸酶活性及黑素生成。

關(guān)鍵詞：窄譜中波紫外線；miRNA-25；黑素細(xì)胞；黑素生成

白癜風(fēng)是由于不同原因所致黑素細(xì)胞損傷的獲得性疾病，表現(xiàn)為皮膚色素缺失[1]。其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，患者體液免疫和細(xì)胞免疫失常提示其發(fā)病可能與自身免疫有關(guān)[2]。阻止皮損部位黑素細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，促進(jìn)正常黑素細(xì)胞向皮損部位遷移及黑素細(xì)胞黑素合成是治療白癜風(fēng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

研究發(fā)現(xiàn)，窄譜中波紫外線(narrow-band UVB, NB-UVB)可促進(jìn)黑素細(xì)胞黑素的合成和增加酪氨酸酶活性，可有效緩解白癜風(fēng)癥狀[3-4]，但是其具體機(jī)制仍不清楚。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類高度保守的內(nèi)生源性微小非編碼RNA，長(zhǎng)度為20～25 bp[5-6]，通過(guò)特異性結(jié)合到目的mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region, 3′UTR)阻止靶蛋白的表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生和免疫反應(yīng)等[7-8]。目前關(guān)于NB-UVB的作用機(jī)制與miRNA關(guān)系研究尚少。

我們?cè)谘芯縉B-UVB對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，NB-UVB作用黑素細(xì)胞后miRNA-25表達(dá)降低。本文通過(guò)研究NB-UVB和miRNA-25對(duì)黑素細(xì)胞增殖和黑素合成的影響，探討NB-UVB治療白癜風(fēng)的可能機(jī)制及其與miRNA-25的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料M254培養(yǎng)基、胎牛血清、L-多巴、黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(HMG)購(gòu)自Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、2.5 g/L胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；人表皮黑素細(xì)胞饋贈(zèng)于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院。Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒和High Capacity cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Life Technology公司)；脂質(zhì)體2000 LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Electron公司)；紫外光療儀器(UVB波長(zhǎng)311 nm，德國(guó)Waldmann公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)傳代待細(xì)胞密度約為80%時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入5 mL含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的M254培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，低速離心去除上清，重新加入培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻并接種于培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(50 mL/L CO2，37 ℃)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將黑素細(xì)胞以5 000/200 μL的密度接種于96孔板，每孔200 μL，空白對(duì)照組只加入200 μL培養(yǎng)基。于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，根據(jù)文獻(xiàn)[9]所示，實(shí)驗(yàn)組予以40 mJ/cm2的NB-UVB輻射，對(duì)照組不予以輻射。輻射后分別繼續(xù)培養(yǎng)72 h，于結(jié)束前4 h于各孔加入20 μL 5 g/L的MTT，4 h后小心吸凈上清，加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(A)值。

1.2.3酪氨酸酶活性測(cè)定細(xì)胞接種于96板，實(shí)驗(yàn)組予以40 mJ/cm2的NB-UVB輻射，對(duì)照組不予以輻射。刺激后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清，PBS清洗2次，每孔加入TritonX-100(10 g/L)90 μL后，-80 ℃放置30 min，室溫融化，每孔加入L-多巴(1 g/L)100 μL，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔A值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4黑素含量測(cè)定細(xì)胞接種于12孔板，實(shí)驗(yàn)組予以40 mJ/cm2的NB-UVB輻射，對(duì)照組不予以輻射。刺激后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清，胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化并吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗2次，加入1 mol/L含10% DMSO的NaOH，80 ℃水浴2 h后將溶液吸至96孔板，每孔150 μL，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5miRNA轉(zhuǎn)染miRNA-25模擬物、miRNA-25抑制劑和miRNA突變體(陰性對(duì)照)均由上海吉瑪公司合成。用脂質(zhì)體2000按照說(shuō)明書(shū)操作將以上核酸轉(zhuǎn)入黑素細(xì)胞，6 h后更換培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Real-time PCR檢測(cè)miRNA-25表達(dá)分別提取NB-UVB作用后12 h的黑素細(xì)胞總RNA，采用High Capacity cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-25的表達(dá)，U6作為內(nèi)參。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS12.0軟件。對(duì)符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用Student’t檢驗(yàn)或者單因素方差分析，各組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)；方差齊性檢驗(yàn)使用Levene檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或者方差齊性，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或者H檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中方差齊性檢驗(yàn)P<0.10為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響使用40 mJ/cm2劑量的NB-UVB作用72 h后，實(shí)驗(yàn)組黑素細(xì)胞增殖、黑素的生成和酪氨酸酶活性增高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1窄譜中波紫外線(NB-UVB)對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響

Tab.1Effects of NB-UVB on cell proliferation, melanogenesis and tyrosinase activities in melanocytes

(A, ±s)

2.2NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞miRNA-25表達(dá)的影響使用40 mJ/cm2劑量的NB-UVB作用12 h后，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄并對(duì)miRNA-25進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組miRNA-25表達(dá)量降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，圖1)。

2.3miRNA-25對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響將實(shí)驗(yàn)分為miRNA-25組、miRNA-25抑制劑組和miRNA陰性對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染miRNA-25

模擬物、miRNA-25抑制劑和miRNA-25突變體，并按照說(shuō)明操作，轉(zhuǎn)染后72 h檢測(cè)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，miRNA-25組黑素細(xì)胞增殖和黑素生成減少，酪氨酸酶活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陰性對(duì)照相比，miRNA-25抑制劑組黑素細(xì)胞增殖、黑素生成、酪氨酸酶活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miRNA-25組相比，miRNA-25抑制劑組黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖1NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞miRNA-25表達(dá)的影響

Fig.1 Effects of NB-UVB on the expression of miRNA-25 in melanocytes

以U6作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)化處理。與對(duì)照組比較，**P<0.01。

表2miRNA-25對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響

Tab.2Effects of miRNA-25 on cell proliferation, melanogenesis and tyrosinase activities in melanocytes

(A, ±s)

P1：miRNA-25組與miRNA-25抑制劑組比較；P2：miRNA-25組與miRNA陰性對(duì)照組比較；P3：miRNA-25抑制劑組與miRNA陰性對(duì)照組比較。

2.4轉(zhuǎn)染miRNA-25部分下調(diào)了NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用將實(shí)驗(yàn)分為miRNA-25組、miRNA-25抑制劑組和miRNA陰性對(duì)照組，按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明操作，轉(zhuǎn)染后6 h對(duì)各組進(jìn)行40 mJ/cm2劑量的NB-UVB照射，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后檢測(cè)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性。結(jié)果顯示，NB-UVB促進(jìn)了各組黑素細(xì)胞增殖、黑素生成，增加了酪氨酸酶活性。其中，miRNA-25抑制劑組促進(jìn)作用最為明顯，與陰性對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miRNA-25組作用最弱，與陰性對(duì)照組相比，除黑素細(xì)胞增殖外，其他指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。表明miRNA-25部分抑制了NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用。

3討論

盡管NB-UVB已廣泛用于臨床白癜風(fēng)的治療，但是其具體治療機(jī)制還不完全清楚。目前研究發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)局部免疫、促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖及黑素的合成、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌有關(guān)[10]。本研究通過(guò)觀察NB-UVB照射后黑素細(xì)胞的增殖、黑素生成、酪氨酸酶活性以及miRNA-25的表達(dá)情況，探討特異microRNA對(duì)黑素細(xì)胞的影響，為探索NB-UVB治療白癜風(fēng)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NB-UVB可以促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖及黑素生成，增加酪氨酸酶活性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NB-UVB還可以下調(diào)miRNA-25的表達(dá)。體外轉(zhuǎn)染miRNA-25模擬物后，抑制了黑素細(xì)胞增殖、黑素的生成和酪氨酸酶活性，而轉(zhuǎn)染miRNA-25抑制劑后卻出現(xiàn)了相反的結(jié)果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)過(guò)表達(dá)miRNA-25后，顯著降低了NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，對(duì)miRNA-25表達(dá)的調(diào)控可能是NB-UVB治療白癜風(fēng)的重要機(jī)制之一。

表3miRNA-25下調(diào)窄譜中波紫外線(NB-UVB)對(duì)黑素細(xì)胞的作用

Tab.3miRNA-25 down-regulated the effects of NB-UVB on melanocytes

(A, ±s)

P1：miRNA-25組與miRNA-25抑制劑組比較；P2：miRNA-25組與miRNA陰性對(duì)照組比較；P3：miRNA-25抑制劑組與miRNA陰性對(duì)照組比較。

黑素細(xì)胞的功能失調(diào)在白癜風(fēng)的發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，但是其具體的致病機(jī)制目前仍不清楚。我們?cè)谘芯縉B-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，NB-UVB可以抑制miRNA-25的表達(dá)，這與JIAN等[11]研究結(jié)果一致。但是miRNA-25的具體作用仍不清楚，對(duì)此我們觀察了miRNA-25在黑素細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)miRNA-25可以抑制黑素細(xì)胞增殖、黑素生成和酪氨酸酶活性，推測(cè)其作用可能與NB-UVB治療白癜風(fēng)有關(guān)。進(jìn)一步的研究證實(shí)了我們的猜想，當(dāng)下調(diào)miRNA-25表達(dá)后顯著增強(qiáng)了NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用，而當(dāng)過(guò)表達(dá)miRNA-25后部分抑制了NB-UVB的作用，表明NB-UVB對(duì)黑素細(xì)胞的作用可能部分是通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA-25的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)，是黑素合成過(guò)程中酪氨酸酶及酪氨酸酶蛋白1基因的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控酪氨酸酶活性及黑素的生成[12]；此外，MITF還參與黑素細(xì)胞凋亡調(diào)控，它通過(guò)促進(jìn)下游抗氧化基因的表達(dá)，清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，保護(hù)黑素細(xì)胞免受破壞[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)皮損區(qū)黑素細(xì)胞MITF表達(dá)降低，而氧化應(yīng)激是MITF降低的主要原因之一[14-15]。SHI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激不僅可以使白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞MITF的表達(dá)降低，同時(shí)還可誘導(dǎo)miRNA-25表達(dá)升高。進(jìn)一步研究表明，miRNA-25可以直接結(jié)合于MITF mRNA 3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)，阻止MITF的表達(dá)。除此之外，miRNA-25還可間接破壞角質(zhì)細(xì)胞旁分泌，減少干細(xì)胞因子(SCF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)黑素細(xì)胞的保護(hù)作用，最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞的退化。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NB-UVB可能通過(guò)消除白癜風(fēng)患者局部皮損的氧化應(yīng)激進(jìn)而緩解病情[16]，其作用機(jī)制可能是NB-UVB通過(guò)調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞miRNA-25，間接調(diào)控MITF及其下游抗氧化基因的表達(dá)，以及促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞分泌SCF和bFGF，間接發(fā)揮作用。

盡管我們觀察到NB-UVB及miRNA-25對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響，證明了兩者具有相關(guān)性，但是其具體調(diào)控機(jī)制仍然未知，特別是miRNA-25調(diào)控黑素細(xì)胞的下游直接靶點(diǎn)及NB-UVB與miRNA-25是否直接相關(guān)，這些仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，NB-UVB可能通過(guò)下調(diào)miRNA-25的表達(dá)，發(fā)揮其對(duì)白癜風(fēng)的治療作用。同時(shí)，本文也為白癜風(fēng)治療方法的研究及NB-UVB治療白癜風(fēng)的機(jī)制提供新的研究方向和思路。

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(編輯邱芬)

NB-UVB promotes melanogenesis and cell proliferation through downregulating the expression of miRNA-25 in human melanocytes

DONG Yan1, LI Wen-bin2, ZHENG Wen1, WANG Juan1, MA Hui-qun1, ZENG Wei-hui1

(1. the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004;2. Department of Dermatology, Shaanxi TCM Hospital, Xi’an 710003, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of narrow-band UVB (NB-UVB) on melanocytes proliferation, melanin production, tyrosinase activities and miRNA-25 expression so as to explore the relationship between NB-UVB and miRNA-25 and the possible mechanism of NB-UVB for treatment of vitiligo. MethodsMelanocytes cultured in vitro were treated with 40 mJ/cm2 dose of NB-UVB for 72 h, the effects of NB-UVB on cell proliferation, tyrosinase activity and melanin content were investigated. After NB-UVB stimulation for 12 h, the effect of NB-UVB on miRNA-25 expression in melanocytes was detected. Melanocytes were transfected with miRNA-25 mimics, miRNA-25 inhibitor and miRNA-25 mutant, respectively, the changes of cell proliferation, tyrosinase activitiy and melanin content were observed. Cell viability was detected using MTT method. Tyrosinase activities were measured with levodopa as the substrate. NaOH assay was used for the detection of melanin content. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect miRNA-25 expression. ResultsAfter NB-UVB of 40 mJ/cm2 dose was used for the cells cultured for 72 h, the viability of melanocytes, tyrosinase activities, and melanin content were significantly increased (P<0.05). After NB-UVB stimulation for 12 h, miRNA-25 expression was significantly lower than that in the control group (P<0.05). After knockdown of miRNA-25, the cell proliferation of melanocytes, tyrosinase activities and melanin content were increased, whereas overexpression of miRNA-25 decreased the cell proliferation, tyrosinase activities and melanin production. Overexpression of miRNA-25 partially inhibited the effect of NB-UVB on the treatment of melanocytes. ConclusionNB-UVB may promote cell proliferation, increase tyrosinase activities and melanin formation through partially downregulating the expression of miRNA-25 in melanocytes.

KEY WORDS:narrow-band UVB; miRNA-25; melanocyte; melanogenesis

收稿日期：2015-11-27修回日期：2015-12-29

通訊作者：曾維惠. E-mail: zengwh88@126.com

中圖分類號(hào)：R758.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603020

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160419.1019.004.html(2016-04-19)