糖尿病大鼠頸性前庭誘發(fā)肌源性電位的觀察

袁藝昕　梁勇　劉小龍　黃雪琴,2　楊襯　張威　李琦

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·實(shí)驗(yàn)研究·

糖尿病大鼠頸性前庭誘發(fā)肌源性電位的觀察

袁藝昕1梁勇1劉小龍1黃雪琴1,2楊襯1張威1李琦1

【摘要】目的觀察糖尿病大鼠不同時(shí)期的頸性前庭誘發(fā)肌源性電位(cervical vestibular evoked myogenic potential，cVEMP)的變化及意義。方法將220只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)及糖尿病組(200只)，應(yīng)用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，再按照造模的時(shí)間將糖尿病組分為糖尿病4、6、8、10、12周組，每組40只，觀察各組大鼠的一般情況及血糖、ABR、cVEMP檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果糖尿病組大鼠造模后出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型糖尿病癥狀，與對(duì)照組比較，血糖升高(P<0.01)、體重下降(P<0.01)；糖尿病組從第6周開始出現(xiàn)ABR反應(yīng)閾值升高(P<0.05)；糖尿病組cVEMP閾值第8周(53.87±11.16 dB nHL)、第10周(67.00±12.74 dB nHL)、第12周(67.00±9.23 dB nHL)升高(P<0.01)，P1波潛伏期第8周(5.01±0.33 ms)、第10周(5.37±0.45 ms)、第12周(5.39±0.24 ms)延長(zhǎng)(P<0.01)，N1波潛伏期第10周(8.98±0.86 ms)、第12周(9.08±0.45 ms)延長(zhǎng)(P<0.01)，但糖尿病組P1-N1波間振幅與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論糖尿病大鼠從造模成功第8周開始，cVEMP閾值開始升高、P1波及N1波潛伏期延長(zhǎng)，出現(xiàn)不同程度的前庭終器損傷，提示cVEMP可作為早期診斷前庭功能損害的方法之一。

【關(guān)鍵詞】糖尿??； 頸性前庭誘發(fā)肌源性電位； 前庭功能

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏而使血糖水平異常增高、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種代謝紊亂性疾病。前庭平衡功能障礙是糖尿病并發(fā)癥之一[1]，Lindsey[2]、Agrawal[3]通過對(duì)糖尿病患者進(jìn)行問卷調(diào)查發(fā)現(xiàn)65歲以上糖尿病患者摔倒年發(fā)生率為39%，是對(duì)照組的3倍，糖尿病患者出現(xiàn)姿勢(shì)不穩(wěn)、摔倒的風(fēng)險(xiǎn)增高，而引起患者前庭平衡功能障礙的病理生理基礎(chǔ)是高血糖導(dǎo)致的微血管病變及周圍神經(jīng)病變。頸性前庭誘發(fā)肌源性電位(cervical vestibular evoked myogenic potentials，cVEMP)是通過高強(qiáng)度的聲刺激在緊張的胸鎖乳突肌上記錄到來源于球囊的的肌電位。cVEMP傳導(dǎo)通路包括球囊斑、前庭下神經(jīng)、前庭側(cè)核、前庭脊髓束及同側(cè)胸鎖乳突肌運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，此通路上的各種病變均可導(dǎo)致cVEMP閾值升高、潛伏期延長(zhǎng)、振幅降低乃至波形消失等。因此，可以用cVEMP來評(píng)價(jià)球囊和前庭下神經(jīng)的功能[4]。Konukseven等[5]對(duì)30例糖尿病患者、糖尿病前期組患者及對(duì)照組進(jìn)行眼性前庭誘發(fā)肌源性電位(ocular vestibular evoked myogenic potentials，oVEMP)和cVEMP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在糖尿病組oVEMP和cVEMP 的P1、N1波潛伏期平均值較糖尿病前期組及對(duì)照組顯著延長(zhǎng)。目前雖已有諸多研究表明糖尿病會(huì)影響患者前庭功能，但因?yàn)榕R床研究容易受到研究對(duì)象用藥、年齡及樣本量等因素的干擾，導(dǎo)致研究結(jié)果不盡相同，而且缺少相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)病理模型說明其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過建立糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠cVEMP閾值、P1、N1波潛伏期及P1-N1波間振幅出現(xiàn)異常的時(shí)間點(diǎn)，為進(jìn)一步研究其病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以便指導(dǎo)對(duì)糖尿病患者平衡功能損傷相關(guān)并發(fā)癥進(jìn)行早期干預(yù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠220只，體重300～350 g(購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，耳廓反射靈敏，鼓膜標(biāo)志正常，無自發(fā)性眼震。將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)及糖尿病組(200只)，再按照造模后觀察時(shí)間將糖尿病組分為糖尿病4、6、8、10及12周組，每組40只。

1.2糖尿病大鼠模型制備[6]糖尿病組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行糖尿病造模：鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)以0.1 mol/L、pH 4.2～4.6的檸檬酸緩沖液配制成的1% STZ溶液，按55 mg/kg一次性腹腔注射STZ；對(duì)照組予腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。注射后兩組均給予充足的飲水及食物。

1.3觀察指標(biāo)和方法

1.3.1一般情況觀察及血糖檢測(cè)糖尿病大鼠造模后, 觀察各組大鼠進(jìn)食、飲水量，小便的量、色、味，精神狀態(tài)、體形、毛色，造模成功率及死亡率。注射STZ后第7天測(cè)量大鼠尾靜脈隨機(jī)微量血糖，血糖大于16.7 mmol/L則表示糖尿病大鼠造模成功。此后每隔一周測(cè)一次尾靜脈微量血糖。

1.3.2ABR檢測(cè)各組大鼠用2%戊巴比妥鈉0.2 ml/100 g麻醉后，應(yīng)用Smart EP聽覺誘發(fā)電位儀(美國(guó)智聽系統(tǒng)公司)檢測(cè)大鼠ABR閾值；將銀針電極的記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于同側(cè)乳突，接地電極置于后足部；刺激聲為疏密相交替的12.1次/秒的短聲，持續(xù)時(shí)間為0.1 ms，帶通濾波300～3 000 Hz，觀察時(shí)程20 ms，疊加次數(shù)1 024次；在距外耳道口1.5 cm處通過插入式耳機(jī)給聲，刺激聲強(qiáng)從100 dB SPL開始，以10 dB遞減，以能分辨出波Ⅲ的最低刺激強(qiáng)度確定ABR閾值。

1.3.3cVEMP檢測(cè)[7,8]應(yīng)用美國(guó)GSI公司Audera V2.7聽覺誘發(fā)電位儀檢測(cè)各組大鼠cVEMP。大鼠同法麻醉后將大鼠頭部抬起，向前上方牽引，使頸部肌肉盡量處于過伸狀態(tài)。采用銀針插入電極，于雙側(cè)背部頸伸肌平C3頸椎棘突水平插入記錄電極，枕骨正中線插入?yún)⒖茧姌O，后足部插入接地電極。插入式耳機(jī)固定于外耳道深部0.5 cm處，刺激聲為click聲，交替波，刺激強(qiáng)度由100 dB nHL開始，10 dB遞減，重復(fù)率為5.00 Hz，掃描204次，掃描時(shí)間40 s，帶通濾波10～1 000 Hz。每側(cè)耳均接受兩次cVEMP測(cè)試，取平均值。將記錄到的第一個(gè)雙相波分別命名為P1(正波)和Nl(負(fù)波)，P1和N1波出現(xiàn)即認(rèn)為cVEMP引出，閾值為能引出cVEMP的最小刺激強(qiáng)度，絕對(duì)峰間振幅為P1-N1之間的波間振幅。

2結(jié)果

2.1一般情況觀察與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重下降等典型糖尿病癥狀，精神萎靡，活動(dòng)力下降，毛發(fā)發(fā)黃，后期有部分糖尿病大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變、壞疽、腹水等癥狀?？傇炷３晒β?6.50%(153/200)，總死亡率22.22%。正常對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)狀況良好，未出現(xiàn)以上表現(xiàn)。將糖尿病組中耳鏡檢查外耳道干凈、鼓膜完整的119只大鼠納入進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，余則剔除。

2.2各組大鼠血糖與體重與對(duì)照組相比，各組糖尿病大鼠血糖明顯升高(F=64.07，P<0.01)，體重明顯下降(F=17.44，P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明DM造模成功(表1)。

表1　對(duì)照組與糖尿病不同時(shí)期組大鼠血糖、體重及

注：與對(duì)照組比較， *P<0.05， **P<0.01

2.3各組大鼠ABR反應(yīng)閾比較糖尿病不同時(shí)期組ABR反應(yīng)閾值從第6周開始升高，并隨著病程延長(zhǎng)ABR反應(yīng)閾值升高更加顯著，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.4各組大鼠cVEMP比較圖1為對(duì)照組與糖尿病第4、6、8、10、12周組cVEMP的結(jié)果。表2為對(duì)照組與糖尿病不同時(shí)期組cVEMP各項(xiàng)指標(biāo)之間的比較，可見，糖尿病第4、6周組的cVEMP閾值與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而糖尿病第8、10、12周組的閾值與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。糖尿病第4、6周的P1波潛伏期與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而糖尿病第8、10、12周組的P1波潛伏期與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。糖尿病第4、6、8周組的N1波潛伏期與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而糖尿病第10、12周組的N1波潛伏期與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。糖尿病不同時(shí)期組的cVEMP的P1-N1波間振幅與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.87，P>0.05)。

表2　對(duì)照組與糖尿病不同時(shí)期組大鼠cVEMP閾值、P1、N1波潛伏期及振幅比較±s)

注：與對(duì)照組比較， *P<0.05， **P<0.01

3討論

內(nèi)耳對(duì)體內(nèi)血糖濃度及胰島素水平的改變極敏感，葡萄糖可為細(xì)胞提供鈉鉀泵所需的能量以維持正常生理功能，當(dāng)葡萄糖代謝紊亂時(shí)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)耳能量供應(yīng)障礙，內(nèi)淋巴液及外淋巴液離子濃度改變使得迷路電位發(fā)生變化，引發(fā)眩暈[9]。Perez等[10]對(duì)飲食誘導(dǎo)的糖尿病沙鼠進(jìn)行了短潛伏期前庭誘發(fā)電位檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)糖尿病組短潛伏期前庭誘發(fā)電位的第一波潛伏期比對(duì)照組顯著延長(zhǎng)且振幅顯著降低，表明糖尿病沙鼠出現(xiàn)了前庭終末器官功能障礙。但短潛伏期前庭誘發(fā)電位是利用旋轉(zhuǎn)角加速度刺激沙鼠，以遠(yuǎn)場(chǎng)方式記錄電位，由于加速度對(duì)雙耳均產(chǎn)生刺激，結(jié)果易受到對(duì)側(cè)耳功能狀況的影響，因此其應(yīng)用及結(jié)果的可靠性受到了限制。糖尿病早期便出現(xiàn)外周前庭系統(tǒng)以及中樞前庭系統(tǒng)受損，但因?yàn)榍巴ジ惺芙K器受單一血管終末支支配，相對(duì)中樞前庭系統(tǒng)更容易受損，因而早期常表現(xiàn)為周圍前庭功能減退[11]。

人類球囊的主要作用是感知平衡，但也有聲敏感特性。球囊是前庭器官對(duì)聲音最敏感的部分，可能是其位于蹬骨足板下，最易受到鼓膜傳來聲波的影響。cVEMPs是目前評(píng)價(jià)球囊功能(前庭下神經(jīng))的唯一方法[12]，Bektas等[13]對(duì)2型糖尿病患者與正常對(duì)照組進(jìn)行了VEMP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組間無論潛伏期、振幅均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Kamali等[9]對(duì)10例伴周圍神經(jīng)病變的1型糖尿病患者、14例不伴周圍神經(jīng)病變的糖尿病患者及正常對(duì)照組進(jìn)行cVEMP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除了糖尿病伴周圍神經(jīng)病變患者的cVEMP潛伏期較正常對(duì)照組延長(zhǎng)外，其余指標(biāo)均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能與這兩項(xiàng)研究的樣本量少有關(guān)。Konukseven等[5]對(duì)30例糖尿病患者、30例糖尿病前期患者及31例正常對(duì)照組行cVEMP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)cVEMP的P1波潛伏期延長(zhǎng)程度與糖尿病組血漿糖化血紅蛋白(HbA1c)和空腹血糖水平呈正相關(guān)，并提出亞臨床前庭神經(jīng)性疾病是糖尿病并發(fā)癥之一。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的制造糖尿病動(dòng)物模型方法[6]， 成功制作了糖尿病大鼠模型， ABR測(cè)試發(fā)現(xiàn)自糖尿病造模后第6周開始，糖尿病組大鼠出現(xiàn)ABR反應(yīng)閾值升高，說明糖尿病大鼠耳蝸功能受損，并隨著病程的發(fā)展逐步加重。Matsuzaki等[14]對(duì)豚鼠應(yīng)用阿卡米星肌肉注射，通過藥物破壞大鼠耳蝸功能，而保留前庭功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組豚鼠ABR未引出，但仍可引出VEMP，說明VEMP不受耳蝸功能的影響，其肌源性電位是源于前庭感受器，而非耳蝸感受器。盡管目前對(duì)于聽覺功能障礙是否會(huì)影響VEMP仍有一定爭(zhēng)議，但大多數(shù)研究表明這種影響不明顯，尤其是在聽功能部分損壞的情況下。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)糖尿病組及對(duì)照組大鼠進(jìn)行cVEMP的測(cè)試方法及參數(shù)設(shè)置均參考國(guó)外動(dòng)物cVEMP的測(cè)試方法[7，8]，對(duì)P1、N1波判斷除參考相關(guān)文獻(xiàn)外，同時(shí)每個(gè)強(qiáng)度重復(fù)測(cè)試2次，使P1、N1波形具有良好的重復(fù)性，對(duì)照組及糖尿病4～6周組結(jié)果與Sakakura[7]測(cè)試大鼠cVEMP中各指標(biāo)的正常值相符。cVEMP各項(xiàng)指標(biāo)中，閾值最穩(wěn)定，推測(cè)當(dāng)外周前庭終器出現(xiàn)損害時(shí)，球囊感知聲強(qiáng)敏感性下降，需要更強(qiáng)的刺激才可引出。cVEMP波潛伏期延長(zhǎng)考慮是因迷路后脫髓鞘病變，特別是前庭脊髓束病變，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低，除了cVEMP神經(jīng)傳導(dǎo)通路的變性外，糖尿病導(dǎo)致的肌肉骨骼退化也可能會(huì)影響測(cè)試結(jié)果[5]。Myers等[15,16]對(duì)糖尿病動(dòng)物進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，糖尿病血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致球囊與橢圓囊出現(xiàn)了微血管病變以及神經(jīng)髓鞘病變，糖尿病動(dòng)物血液粘稠度增加及紅細(xì)胞變形能力減弱，使得紅細(xì)胞運(yùn)輸氧至周圍器官的能力下降，神經(jīng)組織灌注受限，逐漸出現(xiàn)外周神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘、軸索變性等改變。文中結(jié)果顯示隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，糖尿病大鼠cVEMP的閾值與N1、P1波潛伏期從第8周開始逐漸出現(xiàn)不同程度的異常，而糖尿病大鼠cVEMP的波間振幅與對(duì)照組比較卻無明顯差異，振幅與胸鎖乳突肌肌力成正比，肌力改變會(huì)使振幅出現(xiàn)改變，但肌力與振幅這種未量化的關(guān)系指標(biāo)很難客觀評(píng)價(jià)前庭功能，除非將cVEMP 標(biāo)準(zhǔn)化[17,18]。本實(shí)驗(yàn)過程中大鼠頭部拉伸的程度不一，肌力難以達(dá)到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可能是導(dǎo)致各組間振幅無明顯差異的原因。

圖1　對(duì)照組及糖尿病4、6、8、10、12周組大鼠的cVEMP波形

綜上所述，本研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠從第8周開始出現(xiàn)外周前庭終器及前庭傳導(dǎo)通路損傷，表現(xiàn)為cVEMP閾值明顯升高、P1波潛伏期延長(zhǎng)。糖尿病的嚴(yán)重程度和病程都可能對(duì)患者的前庭功能產(chǎn)生影響，cVEMP為糖尿病的早期診斷和檢測(cè)及進(jìn)一步研究糖尿病的病理機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。

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(2016-01-14收稿)

(本文編輯周濤)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-2615：54

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160426.1554.040.html

Cervical Vestibular Evoked Myogenic Potential in Diabetes Rats

Yuan Yixin*, Liang Yong, Liu Xiaolong, Huang Xueqin, Yang Chen, Zhang Wei, Li Qi

(*Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Nanfang Hospital，Southern Medical University, Guangzhou, 510515,China)

【Abstract】ObjectiveTo verify whether cervical vestibular evoked myogenic potential (cVEMP) can be used as an effective method to assess vestibular functions in diabetic rats, we examined and analyzed cervical vestibular evoked myogenic potential (cVEMP) in different duration diabetic rats and normal rats. MethodsA total of 220 male SD rats were randomly divided into control group (n=20) and diabetes group (n=200). The diabetic rats were further divided into 4,6,8,10, and 12 week groups (40 rats each group) according to the diabetes duration. Diabetes was induced by STZ. The general situation,ABR and cVEMP were conducted in all the groups.ResultsAll diabetic groups appeared typical diabetic symptoms including polydipsia, polyuria, more food, weight loss (P<0.01) and blood glucose elevation (P<0.01). The threshold of ABR was significantly elevated (P<0.05) in the 6,8,10, and 12 week diabetic group. Compared to the normal group, the threshold of cVEMP was significantly elevated in 8 week(53.87±11.16 dB nHL),10 week(67.00±12.74 dB nHL),12 week(67.00±9.23 dB nHL) diabetes groups(P<0.01) and the mean latency of P1 peak was significantly prolonged (P<0.01) in 8 week(5.01±0.33 ms),10 week(5.37±0.45 ms),and 12 week(5.39±0.24 ms) . The mean latency of N1 peak was significantly prolonged (P<0.01) in 10 week (8.98±0.86 ms), and 12 week (9.08±0.45 ms) compared to the control group. As to P1-N1 amplitudes, there was no significantly difference among all groups (P>0.05).ConclusionIn the cVEMP test , the threshold increased, the PI peak latency and N1 peak latency prolonged from the 8 th week of diabetes rats models. Vestibular functions were descent gradually due to different degrees of vestibular end-organ impairment.All data indicated that VEMP could be used as an early diagnostic method.

【Key words】Diabetes mellitus；Cervical vestibular voked myogenic potentials；Vestibular function

【中圖分類號(hào)】R587.1；R764.34

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2016)03-0260-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.03.010

作者簡(jiǎn)介：袁藝昕，女，湖南人，醫(yī)學(xué)碩士，主要研究方向?yàn)槎茖W(xué)。通訊作者：梁勇(Email:yliang@smu.edu.cn)

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣州510515)；2廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科