金絲桃苷、淫羊藿苷在大鼠附睪精子冷凍保存中的作用＊

盛文潔，聶曉偉，談 勇，陳 娟，劉承勇

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 南京 210023）

金絲桃苷、淫羊藿苷在大鼠附睪精子冷凍保存中的作用＊

盛文潔1,2，聶曉偉1＊＊，談 勇1,2，陳 娟1，劉承勇1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 南京 210023）

目的：本研究旨在觀察金絲桃苷、淫羊藿苷在大鼠精液冷凍保存過程中的應(yīng)用效果，并對(duì)大鼠精液冷凍保存體系進(jìn)行優(yōu)化。方法：將金絲桃苷、淫羊藿苷加入大鼠精液冷凍保護(hù) 劑中，冷凍保存大鼠附睪尾部的精 子，并評(píng)估冷凍前后精子活率指數(shù)，采用伊紅染色評(píng)估精子畸形率。結(jié)果：添加金絲桃苷、淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑可以提高解凍后的精子活率指數(shù)。結(jié)論：金絲桃苷、淫羊藿苷在大鼠精液冷凍保存過程中有一定的保護(hù)作用。

金絲桃苷 淫羊藿苷 大鼠 附睪精子 冷凍保存

近年來，隨著環(huán)境、飲食、遺傳等因素的影響，男性少弱精癥患病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，大部分原因不明，可歸屬于特發(fā)性少弱精癥，西醫(yī)一般以經(jīng)驗(yàn)治療為主，而中醫(yī)中藥特色辨證治療，發(fā)揮了中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢，獲得滿意的效果。中藥治療以補(bǔ)腎為主[1]，菟絲子與淫羊藿均是臨床常用的補(bǔ)腎中藥。我們前期研究結(jié)果顯示在大鼠常用的精液冷凍保護(hù)液配方中添加菟絲子、淫羊藿水提液，可以提高解凍后精子活率指數(shù)（Sperm Motility Index，SMI）。故在大鼠精液冷凍保存時(shí)添加菟絲子、淫羊藿水提液，對(duì)于大鼠精液具有保護(hù)作用[2]，但是關(guān)于其機(jī)制的研究比較少。

多年臨床實(shí)踐證明，少弱精患者的精液通過冷凍保存的方式，經(jīng)過處理后會(huì)得到更多的處理后活動(dòng)精子總數(shù)（Processed Total Motile Sperm， PTMS），并應(yīng)用于宮腔內(nèi)人工授精（Intrauterine Insemination，IUI）。通過提高PTMS，可以使更多患者能夠通過IUI治療成功妊娠，從而顯著降低患者輔助生殖治療費(fèi)用[3]。然而，臨床治療中使用商品化的人類精液冷凍保存系統(tǒng)在保存正常精液時(shí)更有優(yōu)勢，對(duì)少弱精的保存效果較差[4]。2009年底出版的WHO《第五版人類精液分析與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》 首次單獨(dú)列出一個(gè)章節(jié)論述精液冷凍的標(biāo)準(zhǔn)化流程，提到了少弱精的冷凍保護(hù)劑的特殊性，少弱精的冷凍保存已經(jīng)引起了國內(nèi)外專家的重視[5]，但目前對(duì)于適用于少弱精的新型冷凍保護(hù)劑缺乏系統(tǒng)的研究，特別是針對(duì)添加中草藥成分的效用研究甚少。金絲桃苷、淫羊藿苷分別是中藥菟絲子、淫羊藿在藥理研究中得到確認(rèn)的有效成分[6,7]，故在前期研究基礎(chǔ)上，我們將金絲桃苷、淫羊藿苷添加到大鼠精液冷凍保存體系中，探討其在大鼠精液冷凍保存過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選擇清潔級(jí)SD雄性大鼠10只，15周齡，體質(zhì)量380-480 g，取附睪精子用于冷凍保存研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心提供。

1.2 材料與方法

1.2.1 材料

金絲桃苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào): 110737-200415）；淫羊藿苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào): 111521-201205）。

1.2.2 稀釋液的配置

Tris堿375.0 mmoL·L-1（51.11 mg·mL-1），葡萄糖41.0 mmoL·L-1（8.12 mg·mL-1），枸櫞酸124.0 mmoL·L-1（26.06 mg·mL-1）。50 mL稀釋液中含Tris堿2.555 5 g、葡萄糖0.406 g、枸櫞酸1.303 g。最終混合成375.0 mmoL·L-1Tris緩沖液（pH 7.0，滲透壓375 mOsm）。

1.2.3 冷凍基礎(chǔ)液的配置

自行配置mKRB培養(yǎng)液：氯化鈣（結(jié)晶）1.71 mM，氯化鉀4.78 mM，硫酸鎂（7水結(jié)晶）1.19 mM，磷酸二氫鉀1.19 mM，氯化鈉94.6 mM，葡萄糖5.56 mM，碳酸氫鈉25.07 mM，丙酮酸鈉0.5 mM，乳酸鈉21.58 mM，鏈霉素50 μg·mL-1+青霉素75 μg·mL-1。

于mKRB培養(yǎng)液中一次性加入0.05% SDS、0.1M棉子糖和20.0%卵黃。在基礎(chǔ)液中加入卵黃后，混勻30 min，6 000 rpm離心30 min，棄沉淀，上清液6 000 rpm離心30 min， HCl調(diào)整pH值為7.3，通過0.45 μm的濾膜進(jìn)行過濾，低溫保存。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)Ⅰ：在配置的基礎(chǔ)液中，對(duì)照組命名為C1，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為1.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg·L-1的金絲桃苷，分別命名為T1、T2、T3、T4、T5、T6。

實(shí)驗(yàn)Ⅱ：在配置的冷凍基礎(chǔ)液中，對(duì)照組命名為C2，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg·L-1的淫羊藿苷，分別命名為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6。

各組冷凍保護(hù)劑均需通過0.22 μm的濾器過濾，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 附睪尾部精子的獲取與稀釋

預(yù)先配制10%水合氯醛，2 mL/只腹腔注射麻醉大鼠,打開腹腔，游離附睪尾，吸取2 mL稀釋液置于353037皿中，將附睪尾浸入皿中，計(jì)數(shù)附睪尾部漿液的精子密度（N）及精子活率（SMI）。用稀釋液、Makler計(jì)數(shù)板進(jìn)行密度調(diào)整，將精子密度調(diào)整為2 000萬/mL備用。

1.2.6 裝管

將冷凍液與大鼠精液按1:1，1:2（體積比）混合后，分裝于冷凍管中。將冷凍液與大鼠精液按1:2混合后,分裝于冷凍麥管中。

1.2.7 冷凍與解凍

冷凍各組冷凍管、麥管前均需4℃預(yù)冷平衡30 min，然后于液氮蒸汽（距液氮表面1-2 cm）中熏蒸10 min，最后 置于液氮中冷凍。從液氮中 取出冷凍麥管，靜置于37℃水浴中10 s，將凍存精液轉(zhuǎn)移至353037皿中，把培養(yǎng)皿放置于37℃培養(yǎng)箱中，10 min后檢測解凍后精子的SMI、SDI。從液氮中取出冷凍管，靜置于37℃水浴中10 min，待完全解凍后檢測解凍后精子的SMI、精子畸形率（Sperm Deformity Index，SDI）。

1.2.8 精子活率指數(shù)（SMI）測定

取1滴精液于載玻片表面,加載蓋玻片,置于高倍鏡下觀察并記錄前向活動(dòng)精子數(shù)、活動(dòng)精子數(shù)。SMI的計(jì)算公式：SMI=[活動(dòng)精子數(shù)+（前向活動(dòng)精子數(shù)×20）/2]%。

1.2.9 精子畸形率（SDI）測定

于清潔載玻片上分別滴取冷凍前和解凍后的大鼠精子懸液，做均勻推片之后，將玻片用無水乙醇固定10 min，2%伊紅水溶液染色30 min，再于高倍鏡下檢查每只大鼠500個(gè)完整精子，記錄正常精子數(shù)，無鉤、胖頭、斷頭的頭部畸形精子數(shù)，以及雙尾、斷尾、尾折疊的尾部畸形精子數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同混合比例對(duì)大鼠精液冷凍保存效果的影響

實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，各組冷凍管按體積比1:1與1:2進(jìn)行混合，結(jié)果表明，大鼠精液與冷凍保護(hù)液按1:2的比例混合與1:1比例混合相比較，解凍后SMI升高，但同組兩者間無顯著性差異（見表1）；隨著金絲桃苷添加濃度的提高，解凍后SDI有升高的趨勢。實(shí)驗(yàn)Ⅰ證明，在添加金絲桃苷的冷凍保護(hù)劑中，大鼠精液與冷凍保護(hù)劑以1:2的比例混合凍存精子的效果更好，其中T4組解凍后SMI最高。

實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，各組冷凍管按體積比1:1與1:2進(jìn)行混合，結(jié)果表明，大鼠精液與冷凍保護(hù)液按1:2的比例混合與1:1比例混合相比較，解凍后SMI升高，但同組兩者間無顯著性差異（見表2）；隨著淫羊藿苷添加濃度的提高，解凍后SDI有升高的趨勢。實(shí)驗(yàn)Ⅱ證明，在添加淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑中，大鼠精液與冷凍保護(hù)劑以1:2的比例混合冷凍效果更好。

2.2 不同冷凍介質(zhì)對(duì)精液冷凍保存效果的影響

實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，各組使用麥管和冷凍管按體積比1:2進(jìn)行混合，結(jié)果表明麥管冷凍效果明顯優(yōu)于冷凍管,其中T2、T3、T4組兩者間有顯著性差異（P＜0.05）；不同組麥管之間比較差異顯著（P＜0.05）；隨著金絲桃苷添加濃度的提高，解凍后SDI有升高的趨勢。實(shí)驗(yàn)Ⅰ證明，在添加金絲桃苷的冷凍保護(hù)劑中，麥管冷凍效果明顯優(yōu)于冷凍管。

實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，各組使用麥管和冷凍管按體積比1:2進(jìn)行混合，結(jié)果表明麥管冷凍效果明顯優(yōu)于冷凍管，同組兩者間有顯著性差異（P＜0.05）；不同組麥管之間比較差異顯著（P＜0.05）；隨著淫羊藿苷添加濃度的提高，解凍后SDI有升高趨勢。實(shí)驗(yàn)Ⅱ證明，在添加淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑中，麥管冷凍效果明顯優(yōu)于冷凍管。

3 金絲桃苷、淫羊藿苷最佳添加濃度的確定

實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，T4組解凍后SMI最高，解凍后SMI達(dá)到27.63%，即添加50 μg·L-1金絲桃苷的冷凍保護(hù)劑解凍后SMI最高，與其他組相比差異極顯著；實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，Y4組解凍后SMI最高，即添加20.0 μg·L-1淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑解凍后SMI最高，與其他組相比有顯著性差異。

表2 添加淫羊藿苷的冷凍保護(hù)劑冷凍效果比較

3 討論

多年臨床實(shí)踐證明中醫(yī)藥治療少弱精可以明顯改善患者精子質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子水煎劑對(duì)人精子的運(yùn)動(dòng)功能和膜功能有明顯促進(jìn)作用，菟絲子可能在治療男性不育[8]中有一定的療效，并且可能在輔助生殖過程中提高IUI的成功率[9]。雷公藤多苷可導(dǎo)致的生精細(xì)胞損傷、凋亡可由菟絲子黃酮緩解[10]，且菟絲子黃酮能通過對(duì)表皮生長因子mRNA、蛋白表達(dá)量的提高而對(duì)雷公藤多苷所導(dǎo)致雄性幼鼠的生殖損傷起保護(hù)作用[11]。菟絲子醇提物能顯著促進(jìn)未成年小鼠睪丸以及附睪的發(fā)育，顯示其可能具有促性腺激素的類似作用，在離體培養(yǎng)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，可與人絨毛膜促性腺激素起協(xié)同作用，促使大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌增加，顯示其可在下丘腦-垂體-性腺軸的不同環(huán)節(jié)起作用來對(duì)機(jī)體的生殖內(nèi)分泌活動(dòng)進(jìn)行調(diào)整。最新研究表明，淫羊藿、菟絲子等中藥應(yīng)用于冷凍保存人、豬精液有一定優(yōu)化效果，推測其機(jī)理可能是多種化學(xué)成分協(xié)同作用的結(jié)果，可能通過改變精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的各種成分（磷脂、膽固醇等）的含量或者比例起優(yōu)化作用；也可能通過溶解磷脂改變了精子膜的流動(dòng)性,使膜脂的有效性得到保護(hù),并且使精子細(xì)胞的通透性得到改善,從而使精子在凍存過程中減少低溫?fù)p傷的風(fēng)險(xiǎn)[12,13]；亦可能其適宜濃度可對(duì)抗活性氧[14]對(duì)正常精子所造成的膜、頂體結(jié)構(gòu)及線粒體[15]的損傷，并且可顯著提高精子懸液超氧化物歧化酶的活力，同時(shí)降低丙二醛含量，且其抗氧化作用為通過干預(yù)ROS對(duì)精子膜脂質(zhì)進(jìn)行過氧化反應(yīng)[16-18]。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著金絲桃苷、淫羊藿苷添加濃度的提高，解凍后SDI亦有升高的趨勢，其原因可能是大鼠精子結(jié)構(gòu)與其他哺乳動(dòng)物相比有很大差異，比如大鼠精子有狹小而細(xì)長的鐮刀狀頭部及更為細(xì)長的尾巴[19,20]，所以決定了大鼠精子對(duì)如物理損傷、pH值變化、滲透壓變化、溫度變化等一系列環(huán)境變化[21，22]極其敏感。在金絲桃苷、淫羊藿苷的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷、淫羊藿苷劑量的增加并不能明顯提高血藥濃度,而且吸收情況較差,可能主要是由于高劑量對(duì)藥物溶解度顯著降低所導(dǎo)致[23,24]，故推測高濃度金絲桃苷、淫羊藿苷在精子冷凍過程中亦無保護(hù)作用，造成解凍后畸形率增高。而各組解凍后SDI與SMI相比較，精子的活動(dòng)力與畸形精子率之間呈明顯負(fù)相關(guān)，與高媛等[25]的研究結(jié)果相一致。大鼠精子與其他哺乳動(dòng)物精子冷凍保存體系存在顯著差異，主要是由于大鼠精子質(zhì)膜上脂質(zhì)的含量和成分不同[26]，使大鼠精子冷凍難度更大，有實(shí)驗(yàn)研究將大鼠、小鼠和人類精子分別在人類精子低滲腫脹檢測液中孵育30 min后的變化進(jìn)行比較，觀察發(fā)現(xiàn)人類精子和小鼠精子尾部均出現(xiàn)尾間不同程度的彎曲腫脹或完全腫脹，小鼠精子與人類精子的變化相似，而大鼠精子尾部未出現(xiàn)任何彎曲或腫脹現(xiàn)象[27]。Hammerstedt R. H.等[28]的研究比較了多種生物的精子質(zhì)膜的磷脂成分，發(fā)現(xiàn)大鼠精子細(xì)胞膜的成分具有特異性，這種特異性可能增加了大鼠精子的冷凍難度。大鼠作為一種廣泛應(yīng)用于很多研究領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，更需要建立一套完善的冷凍精子保存體系以應(yīng)對(duì)日益增多的人類疾病模型。目前對(duì)于大鼠精子冷凍體系的研究還不完善，今后將進(jìn)一步對(duì)大鼠精子細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行探索，并對(duì)生物學(xué)機(jī)理進(jìn)行研究，可能研發(fā)出適用于大鼠精子的完整冷凍體系。

通過該課題的研究我們已經(jīng)證明添加一定濃度的淫羊藿苷或金絲桃苷的冷凍保護(hù)劑可以有效提高大鼠精液冷凍保存效果。添加50 μg·L-1金絲桃苷的大鼠精液冷凍保護(hù)劑解凍后SMI可以達(dá)到27.0%以上。這一證據(jù)表明中藥單體成分的添加可能有改善大鼠精液冷凍保存效果。在今后的科研工作中，我們希望能夠?qū)⒏嗟闹兴巻误w有效成分用于人精液冷凍保存研究，最終研發(fā)適用于少弱精患者的新型冷凍保護(hù)劑。

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Effect of Hyperoside and Icariin on Rat Epididymal Sperm Cryopreservation

Sheng Wenjie1,2, Nie Xiaowei1, Tan Yong1,2, Chen Juan1, Liu Chengyong1
(1. Department of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China; 2. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

This study was aimed to observe the effects of hyperoside and icariin on the cryopreservation of rat epididymal sperm and optimize the cryopreservation system. Hyperoside and icariin were added to rat semen cryoprotectant when rat epididymal sperm was cryopreserved. Sperm motility index (SMI) before and after cryopreservation was evaluated and sperm deformity index (SDI) was evaluated by hematoxylin-eosin staining. The results showed that adding hyperoside and icariin to rat semen cryoprotectant can improve the SMI after the sperm was thawed. It was concluded that hyperoside and icariin can protect rat epididymal sperm in the process of rat epididymal sperm cryopreservation.

Hyperoside, icariin, rat, epididymal sperm, cryopreservation

10.11842/wst.2016.03.022

R698

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-09-24

修回日期：2015-01-04

＊ 國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81403426）補(bǔ)腎促排卵中藥對(duì)DOR小鼠雄原核及早期胚胎去甲基化的影響及作用機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：聶曉偉；江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)課題資助項(xiàng)目(Y14017)：補(bǔ)腎活血中藥及其有效成分對(duì)胚泡著床障礙大鼠子宮內(nèi)膜的影響，負(fù)責(zé)人：聶曉偉；江蘇省組織部、江蘇省人力資源和社會(huì)保障廳、江蘇省財(cái)政廳“六大人才高峰”第十二批高層次人才資助項(xiàng)目（WSN-05）：中藥有效成分在少弱精冷凍保存及配子體外受精中的應(yīng)用，負(fù)責(zé)人：聶曉偉；江蘇省教育廳2015年江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目，負(fù)責(zé)人：談?dòng)隆?/p>

＊＊ 通訊作者：聶曉偉，助理研究員，主要研究方向：生殖醫(yī)學(xué)和生殖生物學(xué)。