艾灸對克羅恩大鼠結腸RoRγt、Foxp3調節(jié)作用研究＊

王碩碩，包春輝，王偉靈，戴 明，吳煥淦，王曉梅，翁志軍，劉慧榮，胡智海＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院 上海 200082；2. 上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經絡研究所 上海 200030；3. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

艾灸對克羅恩大鼠結腸RoRγt、Foxp3調節(jié)作用研究＊

王碩碩1＊＊，包春輝2＊＊，王偉靈1，戴 明3，吳煥淦2，王曉梅2，翁志軍2，劉慧榮2，胡智海1＊＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院 上海 200082；2. 上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經絡研究所 上海 200030；3. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

目的：觀察隔藥灸對克羅恩大鼠結腸Th17特異性轉錄因子維甲酸相關孤核受體γt（RoRγt）和Treg特異性轉錄因子叉頭蛋白P3（Foxp3）的表達調節(jié)作用，探討灸法治療克羅恩病的可能效應機制。方法：SPF級雄性SD大鼠40只，完全隨機分為4組，每組10只：正常組、模型組、隔藥灸組和西藥組（美沙拉嗪），采用三硝基苯磺酸（TNBS）溶液灌腸制備大鼠克羅恩疾病模型，隔藥灸組取穴：天樞（雙）、氣海穴，西藥組：美沙拉嗪灌胃治療。治療干預結束后，采用HE病理染色、免疫組織化學和Real-time PCR方法觀察大鼠結腸降部組織病理學變化、Foxp3 mRNA的表達情況。結果：模型大鼠結腸組織出現(xiàn)克羅恩病的典型病理表現(xiàn)：裂隙狀潰瘍、黏膜層炎癥伴肉芽腫，Th17特異性轉錄因子RoRγt蛋白在模型大鼠結腸黏膜及黏膜下層表達高于正常組大鼠（P＜0.01），隔藥灸和美沙拉嗪對RoRγt蛋白具有下調作用（P＜0.01），且美沙拉嗪的調節(jié)作用強于隔藥灸（P＜0.01）；Treg細胞特異性轉錄因子Foxp3及其mRNA在模型大鼠結腸黏膜及黏膜下層表達均低于正常組大鼠（P＜0.01），隔藥灸和美沙拉嗪對Foxp3及其mRNA都具有上調作用（P＜0.01），但兩組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.01）。結論：隔藥灸可能通過調節(jié)克羅恩病模型大鼠結腸黏膜Th17/Treg細胞平衡中特異性轉錄因子RoRγt、Foxp3的表達來發(fā)揮改善結腸組織潰瘍，緩解腸道炎癥的治療作用。

克羅恩病 隔藥灸 RoRγt Foxp3

克羅恩?。–rohn’s Disease，CD）屬慢性非特異性腸道炎癥性疾病，目前病因尚不十分清楚的，臨床癥見腹痛、腹瀉、腸梗阻，伴有發(fā)熱、營養(yǎng)障礙等腸外表現(xiàn)，具有慢性和消耗性的特征，病程多遷延難愈，近年發(fā)病率逐年升高[1]。目前，臨床應用較多的藥物包括5-氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑、炎性介質抑制劑、靶向生物免疫治療、抗生素等[2]。長久服用藥物存在不良反應和手術術后復發(fā)率的難點。中醫(yī)針灸治療 克羅恩樣腸腑病癥具有悠久的歷史，現(xiàn)代臨床研究也證實針灸治療輕中型CD的療效確切，可顯著改善CD患者的全身癥狀，如減少腹瀉次數(shù)、降低CD活動指數(shù)[3-5]，值得進一步臨床推廣應用和對其效應機制的深入研究。

Thl7細胞和Treg細胞在IBD的關系中日益受到重視，二者存在相互轉化現(xiàn)象。目前，恢復體內的Thl7/Treg平衡對動物模型和IBD患者的療效不斷得到驗證[6]。這些研究都補充了 Thl/Th2免疫介導的不足，揭示Thl/Th2亞群失衡并不能說明它們在疾病中起絕對作用。多種療法進一步的研究證實，ThI7/Treg轉化平衡是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素，這可能成為人類導致IBD的原因之一[7]。維甲酸相關孤核受體γt（Retinoid-related Orphannuclear Receptor γt，RORγt）是Thl7細胞特異性轉錄因子，參與自身免疫性疾病、感染和腫瘤等多種病理過程，在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要的意義[8]。Treg依賴特異性轉錄因子叉頭蛋白P3 （FoxP3）以維持穩(wěn)定表達，釋放IL-10、轉化生長因子-β（TGF-β）等細胞因子來抑制自身反應性T細胞的增殖活化，維持自身免疫耐受[9]。CD4+T細胞的亞群各自發(fā)揮不同的功能，并相互制約并且在一定的條件下可以互相轉化[10]。Thl7和Treg細胞各自在調控免疫反應中發(fā)揮了不同的作用。它們參與了免疫炎癥級聯(lián)反應中抗原的識別，細胞信號通路的激活，炎癥效應的放大，下游炎性因子的釋放等諸多環(huán)節(jié)。因此，干預其中任何一個必要環(huán)節(jié)都可能起到緩解病情的作用[11]。為此，本研究制作CD大鼠模型，從Th17特異性轉錄因子RoRγt和Treg特異性轉錄因子Foxp3及其mRNA的調節(jié)作用角度，來觀察隔藥灸對CD大鼠的治療效果，為灸法治療CD效應機制的闡明提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及模型制備

SPF級雄性SD大鼠40只，體質量140±10 g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。實驗室內溫度20±2℃，相對濕度60±10%，自由飲食飲水，模型制作成功后完全隨機分組為4組，每組10只：正常組、模型組、隔藥灸組、美沙拉嗪組。參照國際公認Morris法[12]制作CD大鼠模型，即TNBS合乙醇溶液灌腸。實驗前禁食不禁水24 h，1%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔麻醉，將5%（W/V）的TNBS與50%乙醇按2:1體積比混合成灌腸液，按照3 mL·kg-1體重，于距肛門6-8 cm處注入灌腸液，1次/周，共4次。

1.2 分組與治療

隔藥灸組取穴：天樞（雙）、氣海，穴位定位參照普通高等教育“十五”國家級規(guī)劃教材《實驗針灸學》[13]。藥餅配方：將附子、肉桂、丹參、黃連等藥材研末后加適量黃酒調和，用模具制成直徑0.5 cm、厚0.3 cm大小，上置約90 mg小艾炷施灸，每次每穴各灸2壯，每日1次，連續(xù)治療10天。美沙拉嗪組：采用美沙拉嗪溶液灌胃。每日投藥量：根據(jù)《藥理學實驗方法》，按成人（70 kg體重）與大鼠（200 g體重）1:0.018比例配制美沙拉嗪溶液，每日2次投藥，共灌胃10天。

1.3 實驗試劑和儀器

三硝基苯磺酸TNBS（美國Sigma公司，批號：Q1894）；兔抗大鼠RoRγt、Foxp3 一抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號：SC-28705）；EnVision二抗試劑盒（上?；蚩萍脊?，批號：GK500710）；逆轉錄酶反應體系（上海基爾頓生物科技有限公司）；美沙拉秦腸溶片（德國Losan Pharma GmbH 公司，批號：C1420018878）。

1.4 指標檢測

1.4.1 結腸組織病理學觀察

經HE染色后，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠結腸組織病理學變化。

1.4.2 結腸組織RoRγt、Foxp3表達的測定

采用Envision法檢測，石蠟切片進行檸檬酸緩沖液微波加熱抗原修復；0.01 mol·L-1PBS沖洗5 min×3次；0.3%H2O2滅活內源性過氧化物酶；0.01 mol·L-1PBS沖洗5 min×3次；滴加兔抗鼠RoRγt（1:500）、Foxp3（1:1 000）一抗，37℃孵育2 h，0.01 mol·L-1PBS沖洗5min×3次；滴加山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；0.01 mol·L-1PBS沖洗5 min× 3次；滴加DAB顯色液（EnVision試劑盒，上?；蚩萍脊荆?，顯微鏡下控制顯色時間；采用Motic圖像分析系統(tǒng)分析陽性目標 平均積分光密度（Integral Optical Density，IOD）。

1.5 Real-time PCR技術檢測大鼠結腸Foxp3 的mRNA表達

從結腸組織中提取總RNA，用逆轉錄酶反應體系合成cDNA，相對基因表達量由CT法來控制。以GAPDH為內參照，F(xiàn)oxp3引物由Primer Express設計合成。FoxP3-mRNA的Sense：5’-GAGAAAG TGGCAGGGAAGGAGT-3’和Antisense：5’-TCTGAGGCAGGCTGGATAACG-3’。

1.6 統(tǒng)計分析法

實驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)有表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法進行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠結腸組織病理學變化（HE染色）

正常組大鼠結腸結構完整，未見水腫或增生，腸壁肌層、漿膜層完整。模型組結腸黏膜面潰瘍，局部黏膜上皮缺失，裂隙狀潰瘍形成，固有層間質、黏膜下層結締組織水腫，大量嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤等炎癥病理表現(xiàn)，符合克羅恩病結腸病理學表現(xiàn)。經隔藥灸治療后，結腸組織可見潰瘍愈合，充血水腫程度減輕，黏膜固有層增厚，杯狀細胞增生。經美沙拉嗪治療后，結腸組織也呈現(xiàn)出同隔藥灸治療組類似的改善。這說明隔藥灸同美沙拉嗪能夠緩解和改善CD大鼠結腸組織的形態(tài)結構的改變及炎癥程度，各組大鼠結腸病理染色如下圖1所示。

圖1 大鼠結腸組織病理學變化

2.2 結腸組織RoRγt、Foxp3表達情況

由實驗結果可知，正常組大鼠腸黏膜上皮細胞及粘膜固有層單個核細胞胞漿中均可見RoRγt蛋白的表達；與正常組相比，模型組腸黏膜上皮細胞胞質、淋巴細胞RoRγt蛋白表達增強（P＜0.01）；經過隔藥灸和美沙拉嗪治療后，RoRγt蛋白在上述大鼠腸黏膜部位的表達減弱（P＜0.01），與隔藥灸組相比，美沙拉嗪組的下調作用更為明顯（P＜0.01），如圖2所示。

正常組大鼠腸黏膜上皮、黏膜間質內淋巴細胞Foxp3蛋白均有表達；與正常組相比，模型組大鼠腸黏膜上皮細胞、腺上皮細胞Foxp3蛋白表達減弱（P＜0.01）；隔藥灸和美沙拉嗪能夠上調Foxp3在上述部位的表達（P＜0.01），如圖3所示。

2.3 結腸組織RoRγt、Foxp3 的mRNA表達

模型組大鼠結腸組織Foxp3 mRNA表達量低于正常組大鼠（P＜0.01），隔藥灸組Foxp3 mRNA表達較模型組明顯上調（P＜0.01），美沙拉嗪也能夠上調CD大鼠結腸Foxp3 mRNA的表達，調節(jié)作用強于隔藥灸組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），如圖4所示。

圖2 各組大鼠結腸組織RoRγt蛋白表達

圖3 各組大鼠結腸組織Foxp3蛋白表達

3 討論

灸法在現(xiàn)代臨床中治療克羅恩病具有很好的療效[14]，尤其在臨床癥狀的改善、病情活動的維持緩解以及防治并發(fā)癥等方面，與現(xiàn)代醫(yī)學療法相比具有一定優(yōu)勢，可以作為輔助療法用于輕、中度活動期克羅恩病的治療，且操作簡便無副作用，本課題組長期從事針灸治療克羅恩病的臨床與基礎研究工作，作者在臨床有效的基礎上，采用目前國際公認的TNBS灌腸法制備實驗性CD大鼠模型，開展針灸治療CD的作用機制研究。

圖4 各組大鼠結腸組織Foxp3 mRNA表達

以往實驗已經證實，針灸在調節(jié)Thl/Th2細胞平衡紊亂方面存在調節(jié)作用[15，16]，Thl7細胞和Treg細胞在IBD的關系中日益受到重視，二者存在相互轉化關系。目前，恢復體內的Thl7/Treg平衡對動物模型和IBD患者的療效均已得到不斷的驗證[6]。初始CD4+T細胞周圍TGF-β濃度較低且存在IL-16時，TGF-β能誘導RORγt的產生，促使初始CD4+T分化為Thl7細胞[17]，同時抑制FoxP3+Treg細胞的產生。而TGF-β濃度較高時，可上調FoxP3的表達，并抑制RORγt的產生，從而阻止初始CD4+T分化為Thl7細胞。這說明細胞因子調節(jié)的RORγt/FoxP3平衡決定了初始CD4+T受抗原刺激后向Thl7細胞或Treg方向分化。

本研究檢測了各組大鼠結腸組織中與Th17細胞分化發(fā)育具有關鍵作用的轉錄因子RORγt。結果顯示，采用TNBS灌腸方法刺激大鼠，與正常組大鼠相比，模型組大鼠結腸黏膜上皮細胞RORγt蛋白表達升高，結合結腸炎癥的病理表現(xiàn)，說明RORγt蛋白表達增加可能增強了黏膜局部幼稚T細胞向Th17細胞分化這一過程而促進炎癥反應，當用隔藥灸和美沙拉嗪干預后，使得結腸黏膜RORγt蛋白表達出現(xiàn)下調，說明在這個過程中隔藥灸可能通過下調RORγt蛋白的表達來發(fā)揮抗炎的作用。作者對具有抗炎作用的Treg細胞特異性轉錄因子FoxP3及其mRNA檢測后發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠相比，模型組大鼠腸黏膜上皮、黏膜間質內淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質FoxP3表達降低，結合模型組大鼠結腸炎癥病理表現(xiàn)，說明轉錄因子FoxP3蛋白的降低可能使得Treg細胞分化受阻而導致炎癥的增強，經過隔藥灸和美沙拉嗪治療后，結腸黏膜FoxP3的表達出現(xiàn)上調。同時，結腸炎癥減輕，對結腸FoxP3 mRNA的檢測結果也顯示出類似的變化趨勢，這說明Treg細胞轉錄因子FoxP3在TNBS誘導的結腸炎癥過程中發(fā)揮了抗炎作用。以上結果說明，Thl7細胞和Treg細胞中的RoRγt、Foxp3在隔藥灸治療CD的效應機制中也發(fā)揮了重要作用。

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Study on Regulation Function of Moxibustion on Expressions of RoRγt and Foxp3 in Colon of Rats with Crohn Disease

Wang Shuoshuo1, Bao Chunhui2, Wang Weiling1, Dai Ming3, Wu Huangan2, Wang Xiaomei2, Weng Zhijun2, Liu Huirong2, Hu Zhihai1
(1. Shanghai TCM Integrated West Medicine Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200082, China; 2. Shanghai Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai University of TCM, Shanghai 200030, China; 3. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200032, China)

This study was aimed to observe the regulation function of herbs-partition moxibustion on the expressions of RoRγt and Foxp3 in the colon of rats with crohn disease (CD), and to explore the mechanism of moxibustion in the treatment of CD. A total of 40 male SD rats of specific pathogen free grade were randomized into the normal group, the model group, the herbs-partition moxibustion group and the west medicine group (mesalazine), with 10 rats in each group. Trinitro-benzene-sulfonic acid (TNBS) was used to develop CD models.Tianshu(ST25, both sides) andQihai(RE6) were selected in herbs-partition moxibustion group. In the west medicine group, rats

mesalazine by gavage. At the end of the intervention, histopathological changes and Foxp3 mRNA expression in rats’ descending colon were detected by using HE pathological dyeing, immunohistochemistry and real-time PCR. The results showed that colon tissues of rats in the model group expressed typical pathologic signs of CD: crack ulcer and mucosa inflammatory granuloma. The protein expression of RoRγt in the model rat colonic mucosa and submucosa was higher than that of the normal group (P＜ 0.01). Both herbs-partition moxibustion and mesalazine can decrease the protein expression of RoRγt (P＜0.01). The regulation function of mesalazine was stronger than that of herbs-partition moxibustion (P＜0.01). The protein expression of Foxp3 and mRNA in the model rat colonic mucosa and submucosa was lower than that of the normal group (P＜0.01). Both herbs-partition moxibustion and mesalazine can lift the protein expression of Foxp3 and mRNA (P＜0.01), but there was no statistical difference between two groups (P＞0.01). It was concluded that the possibly mechanisms of herbs-partition moxibustion to improve the colon tissue ulcers and alleviate the intestinal inflammation were through the regulation on the expression of RoRγt and Foxp3 in the CD model rat colonic mucosa Th17/Treg cell.

Crohn disease, herbs-partition moxibustion, RoRγt, Foxp3

10.11842/wst.2016.03.007

R245

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2016-02-14

修回日期：2016-03-04

＊ 科學技術部國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973計劃”項目（2015CB554501）：艾灸效應的啟動機制及其內源性調節(jié)作用的機理研究，負責人：吳煥淦；教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃項目（NCET-13-0907）：針灸治療克羅恩病臨床與基礎研究，負責人：劉慧榮；上海市科委自然科學基金基礎研究項目（13ZR1439400）：艾灸對克羅恩病腸道免疫穩(wěn)態(tài)失衡及腦腸神經信息的調節(jié)機制研究，負責人：劉慧榮；上海中醫(yī)藥大學上海市重點學科資助項目（S30304-A17）：艾灸對克羅恩病大鼠腸神經系統(tǒng)的調節(jié)機制研究，負責人：王曉梅。

＊＊ 王碩碩和包春輝為并列第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：胡智海，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要研究方向：針灸干預胰島素抵抗研究。