流動注射法探究模擬酶催化過氧亞硝酸根氧化酪氨酸的動力學(xué)特征

安學(xué)靜、羅云敬、張辰暘

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院、北京 100124

流動注射法探究模擬酶催化過氧亞硝酸根氧化酪氨酸的動力學(xué)特征

安學(xué)靜、羅云敬*、張辰暘

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院、北京 100124

流動注射分析儀； 氯化血紅素； 血紅蛋白； 過氧亞硝酸根

引 言

過氧亞硝酸根(Peroxynitrite、ONOO-)是生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧化合物、具有強(qiáng)硝化、氧化和致癌性、能與生物體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及維生素等生物大分子反應(yīng)而誘發(fā)心腦血管等疾病[1]。表征ONOO-分子活性的研究方法主要集中在紫外-可見光度法、熒光光譜法、電化學(xué)法和化學(xué)發(fā)光法。過氧亞硝酸根對細(xì)胞損傷作用迅速、且在生物體內(nèi)含量較低、易降解、對其在含量的測定十分困難。目前、檢測ONOO-含量的方法主要集中在熒光探針法和非酶反應(yīng)法[2]、但熒光探針合成困難、選擇性差； 非酶反應(yīng)法靈敏度差、而酶催化反應(yīng)法可克服上述缺點(diǎn)、有望檢測生物體的ONOO-含量。王瑞勇等[2]建立了測定ONOO-含量的新方法、基于模擬酶能夠催化ONOO-氧化酪氨酸產(chǎn)生具有熒光特性的二聚體酪氨酸的反應(yīng)原理、利用熒光光譜法測定了其含量、效果令人滿意。

熒光光譜法反映了模擬酶催化ONOO-氧化反應(yīng)的靜態(tài)猝滅過程、對于模擬酶催化該體系的反應(yīng)機(jī)制卻不甚明了[3-7]。流動注射分析儀是研究快速反應(yīng)動力學(xué)的重要手段、在分子水平和生化反應(yīng)機(jī)理研究方面發(fā)揮著重要作用、但對于其應(yīng)用在模擬酶催化的動力學(xué)機(jī)理的研究方面鮮有報道[8-10]。Michael等[11]利用停流熒光法研究發(fā)現(xiàn)酶的催化活性是通過高能級到基態(tài)之間的動態(tài)轉(zhuǎn)化過程實(shí)現(xiàn)的； 李永生等[12]利用流動注射光譜法建立了過氧化物酶活性的測定方法。尚未見血紅蛋白或氯化血紅素催化過氧亞硝酸根對酪氨酸催化反應(yīng)機(jī)理和動力學(xué)參數(shù)的報道。鑒于此、本實(shí)驗(yàn)利用流動注射法探究血紅蛋白和氯化血紅素催化ONOO-氧化酪氨酸的動力學(xué)行為、計算兩種酶催化該體系的Km和Vmax、從而比較血紅蛋白和氯化血紅素催化該體系的反應(yīng)機(jī)理和不同催化活性、得到不同溫度、pH值下的速率常數(shù)、對模擬酶催化法測定ONOO-含量、動力學(xué)催化機(jī)理及其引起疾病的防治具有潛在的生物學(xué)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SFM-300/MOS-250流動注射儀與光譜分析系統(tǒng)(法國比奧羅杰公司)、Bio-Kine32V4.27動力學(xué)曲線模擬軟件(法國比奧羅杰公司)、PHS-25數(shù)顯酸度計(上海精密科學(xué)儀器公司)、ER-182A電子天平(上海天平儀器廠)、TB-85水浴循環(huán)裝置(日本島津公司)、PR020XXM1純水機(jī)(北京PALL純水公司)。

血紅蛋白(Hemoglobin、Hb)和氯化血紅素(Hemin)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司、二甲基亞砜(DMSO)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase、SOD)、酪氨酸(Tyrosine、Tyr)購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司、4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)用緩沖溶液為Tris-HCl緩沖液、實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水、其他試劑均為分析純。

1.2 方法

將反應(yīng)溶液分別注入流動注射分析儀的S1、S2和S3注射器中、于水浴中充分反應(yīng)、S1：3 mL 1.0 mmol·L-1的Tyr和1 mL 0.25 μmol·L-1的Hb/Hemin混合液； S2：10 mL 0.24 μmol·L-1的ONOO-溶液； S3：10 mL Tris-HCl緩沖液、S1∶S2∶S3=1∶3∶1、λex/em=317/408 nm。流通池體積為100 μL、光程為10 mm、儀器死時間為1.0 ms、狹縫寬為2.5 nm。Hb、Hemin、ONOO-、Tyr的終濃度分別為注入時的1/20、1/20、3/5、3/20。

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬酶催化ONOO-氧化Tyr反應(yīng)機(jī)理的推斷

酪氨酸具有熒光特性、在λex/em=230/305 nm下能夠檢測其熒光強(qiáng)度。模擬酶具有催化特性、能催化ONOO-氧化Tyr、對Tyr的熒光強(qiáng)度具有靜態(tài)猝滅作用、產(chǎn)物為具有熒光特性的酪氨酸二聚體、其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為317和408 nm。Tyr對酪氨酸二聚體熒光強(qiáng)度的變化沒有干擾、且二聚體性質(zhì)穩(wěn)定、可根據(jù)檢測其熒光強(qiáng)度的大小及變化推斷模擬酶催化該體系的動力學(xué)特性。

實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度Tyr在Hb和Hemin兩種模擬酶催化下對產(chǎn)物二聚體熒光強(qiáng)度影響的動力學(xué)曲線[圖1(a)]、顯示濃度較低時、初速率均隨著Tyr濃度的增加而增強(qiáng)、表現(xiàn)為一級反應(yīng)、當(dāng)Tyr濃度為1.0 mmol·L-1時、曲線與0.9 mmol·L-1時幾乎重合、當(dāng)濃度繼續(xù)增大時、二聚體熒光強(qiáng)度均不再增強(qiáng)、反應(yīng)初速率均不再增大、說明Tyr已達(dá)到飽和、表現(xiàn)為零級反應(yīng)、符合典型的酶催化反應(yīng)的特征、遵循Michaelis-Menten的動力學(xué)規(guī)律。

根據(jù)流動注射分析儀中的動力學(xué)曲線模擬軟件Bio-Kine、計算出反應(yīng)初速率V0(dIF/dt) 與Tyr濃度的關(guān)系(圖2)。

由截距1/Vmax和斜率Km/Vmax算出以Tyr為底物兩種酶催化的Km和Vmax分別為：

圖1 催化的不同Tyr動力學(xué)曲線(a) Hb和(b) Hemin

Fig.1 Kinetic curve of dimer Tyr with different Tyr concentration catalyzed by (a) Hb and (b) Hemin

圖2 不同濃度Tyr的Lineweaver-Burk圖

同時、實(shí)驗(yàn)以不同濃度ONOO-(6×10-7～4×10-5mol·L-1)為底物探究了其對Hb和Hemin催化該體系的反應(yīng)初速率的影響情況、結(jié)果見圖3(a)和(b)。

圖3 催化的不同ONOO-動力學(xué)曲線(a) Hb和(b) Hemin

Fig.3 Kinetic curve of dimer Tyr with different ONOO-concentration catalyzed by (a) Hb and (b) Hemin

圖4 不同濃度ONOO-的Lineweaver-Burk圖

2.2 不同溫度下兩種酶催化活性的比較

溫度是影響酶活性的重要影響因素之一。本實(shí)驗(yàn)在生理pH下考察了不同溫度(15、25、30、37、45 ℃)對兩種酶催化該體系的影響。利用流動注射分析儀得到在不同溫度下及不同濃度的兩種酶時的動力學(xué)曲線、根據(jù)動力學(xué)曲線模擬軟件Bio-Kine擬合出表觀速率常數(shù)kobs(見表1)。

表1 不同溫度下隨Hb濃度變化的kobs

表2 不同溫度下隨Hemin濃度變化的kobs

將動力學(xué)曲線模擬軟件Bio-Kine擬合出的kobs代入公式kobs=k0+[catalyst]kcat、作kobs與酶濃度圖(見圖5)、其中k0為無酶時的kobs、[catalyst]為酶的濃度、斜率即為kcat。

由表1可以看出：37 ℃下、無Hb時、反應(yīng)的kobs均很低、Hb的濃度由0.5 nmol·L-1增加到50 nmol·L-1時、其對應(yīng)的kobs由0.009 0 s-1增大到0.025 8 s-1、由此說明反應(yīng)的kobs隨著Hb的增加而增大、從而得出Hb對ONOO-氧化Tyr的反應(yīng)具有顯著的催化作用。

圖5 不同溫度下催化該體系的反應(yīng)速率

再由圖5(a)可以得出：Hb在15,25,30,37和45 ℃下催化ONOO-氧化Tyr的反應(yīng)速率常數(shù)kcat分別為3.043×105、7.705×105、4.418×105、3.373×105、1.127×105mol·L-1·s-1。結(jié)果表明：Hb對ONOO-氧化Tyr的反應(yīng)的催化活性受到溫度的影響、溫度較低時、隨著溫度的升高、kcat變大； 溫度上升至25 ℃時、速率常數(shù)達(dá)到最大值kcat=7.705×105mol·L-1·s-1、此溫度下催化反應(yīng)速率最快； 溫度繼續(xù)上升、反應(yīng)速率呈下降趨勢、當(dāng)溫度上升至45 ℃時應(yīng)速率最慢kcat=1.127×105mol·L-1·s-1、下降了85.37%、說明Hb催化該體系時適宜在比較溫和(常溫)條件下進(jìn)行。

由表2和圖5(b)得知：不同溫度下、無Hemin時反應(yīng)的kobs均很低、且隨著Hemin的增加、相應(yīng)的kobs不斷增大、說明Hemin對該體系同樣具有明顯的催化作用； 同時、溫度對Hemin催化氧化Tyr的反應(yīng)具有明顯影響。Hemin在15、25、30、37和45 ℃下催化ONOO-氧化Tyr的反應(yīng)速率常數(shù)kcat分別為0.861×105、1.059×105、1.652×105、3.679×105、2.321×105mol·L-1·s-1。結(jié)果顯示：隨著溫度的升高、Hemin催化該體系的kcat不斷增大、在25、30和37 ℃時分別加快了1.23、1.56和2.23倍、從37到45 ℃時、速率減慢了1.59倍、說明Hemin催化該體系的最適條件為生理溫度37 ℃下。

數(shù)據(jù)顯示、Hb和Hemin催化該體系的現(xiàn)象均符合酶催化受溫度影響的一般規(guī)律、Hb在最適溫度下的kcat=7.705×105mol·L-1·s-1顯著大于Hemin在最適溫度下的kcat=3.679×105mol·L-1·s-1、是Hemin的2.09倍。

2.3 不同pH值下兩種酶催化活性的比較

pH值是影響酶活性的又一重要影響因素。本文進(jìn)一步考察了Hb在最適溫度25 ℃下pH值分別為7.0、7.5、8.0和8.5、Hemin在最適溫度37 ℃下pH值分別為8.5、9.0、9.5和10.0下催化該體系的kcat。由于Hemin不易溶于水、而易溶于NaOH溶液、因此實(shí)驗(yàn)監(jiān)測了其在偏堿性條件下的催化活性。得到不同pH值不同酶濃度的kobs(見表3)。

表3 不同pH下隨Hb濃度變化的kobs

表4 不同溫度下隨Hemin濃度變化的kobs

圖6 不同pH下催化該體系的反應(yīng)速率(a) Hb和(b) Hemin

由表2得出不同pH值條件下不同濃度的兩種酶的kcat。由圖6(a)得知：pH 7.0、7.5、8.0和8.5時、Hb催化該體系的kcat分別為7.861×105、8.237×105、1.035×106和9.058×105mol·L-1·s-1、根據(jù)不同濃度Hb在不同pH值時的kcat可以看出、pH 8.0>8.5>7.5>7.0、隨著pH值的增加kcat增大、當(dāng)pH達(dá)到8.0時、kcat不再增大、說明Hb催化該體系的kcat達(dá)到最大、進(jìn)而闡明Hb催化ONOO-氧化Tyr的反應(yīng)適宜在pH 8.0條件下進(jìn)行。

再由圖6(b)得知：pH 8.5、9.0、9.5和10.0時、Hemin催化該體系的kcat分別為3.682×105、4.104×105、6.842×105和5.079×105mol·L-1·s-1、pH 9.5>10.0>9.0>8.5、因此Hemin在pH 9.5時kcat達(dá)到最大、說明Hemin催化ONOO-氧化Tyr的最適宜反應(yīng)pH值為9.5。最適pH下、Hb催化該體系的kcat=1.035×106mol·L-1·s-1與Hemin催化該體系的kcat=6.842×105mol·L-1·s-1相比較、Hb是Hemin的2.81倍。

pH對模擬酶的影響主要作用于模擬酶活性中心或者相關(guān)位點(diǎn)基團(tuán)的解離狀態(tài)[12]、不同pH值下其解離狀態(tài)不盡相同。由數(shù)據(jù)顯示、pH對Hb和Hemin催化活性的影響均是先隨pH增大而增強(qiáng)、達(dá)到最適pH后開始下降、說明該催化反應(yīng)隨pH變化的曲線為鐘罩型[12]、符合酶催化受pH影響的典型特征。

3 結(jié) 論

通過對模擬酶催化該體系動力學(xué)的研究、反映出模擬酶催化法研究ONOO-的氧化反應(yīng)機(jī)制和生物酶的催化信息、為探究生物體內(nèi)高活性自由基反應(yīng)機(jī)理、建立高靈敏度的新方法測定ONOO-含量、揭示酶反應(yīng)的實(shí)質(zhì)以及ONOO-所引起相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有潛在的生物學(xué)研究意義。

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*Corresponding author

Research on the Reaction Dynamics between Peroxynitrite and Tyrosine Catalyzed with Mimic Enzyme through Flow Injection Analyzer

AN Xue-jing,LUO Yun-jing*,ZHANG Chen-yang

College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Flow injection analyzer; Hemin; Hemoglobin; Peroxynitrite

Dec. 14,2015; accepted Apr. 19,2016)

2015-12-14、

2016-04-19

北京市教育委員會科技計劃面上項(xiàng)目(KM201210005032)和國家科技支撐計劃項(xiàng)目(2015BAK44B00)資助

安學(xué)靜、1990年生、北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院 e-mail: anxuejing@emails.bjut.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: luoyj@bjut.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-4052-06