利用新型熒光銀納米團(tuán)簇實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的快速精確檢測(cè)

黃科翰、秦翠芳、曹瀟丹、楊太群、陳瑜婷、張三軍、潘海峰、徐建華

精密光譜科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、華東師范大學(xué)、上海 200062

利用新型熒光銀納米團(tuán)簇實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的快速精確檢測(cè)

黃科翰、秦翠芳、曹瀟丹、楊太群、陳瑜婷、張三軍、潘海峰*、徐建華

精密光譜科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、華東師范大學(xué)、上海 200062

谷胱甘肽(GSH) 是一種含有巰基的三肽分子、參與許多細(xì)胞內(nèi)生化過程、具有抗氧化和整合解毒功能、在生物體內(nèi)以及醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域有著極為重要的作用。GSH參與細(xì)胞內(nèi)、體液中的許多重要生化反應(yīng)、其在人體內(nèi)含量的變化、相應(yīng)地提示了人體的健康問題。目前對(duì)GSH的檢測(cè)手段有表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)、電化學(xué)分析、高效液相色譜(HPLC)等、這些方法大都操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)或者需要昂貴的儀器。利用一種新型熒光銀納米團(tuán)簇(Ag NCs)作為探針、通過同時(shí)分析銀納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度變化以及熒光峰位置移動(dòng)實(shí)現(xiàn)了GSH的高精度快速檢測(cè)。在檢測(cè)過程中、GSH分子與熒光探針發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、改變了熒光探針的光化學(xué)特性、其熒光強(qiáng)度因發(fā)生猝滅而減弱、且其熒光峰位置因配體的改變也發(fā)生移動(dòng)。通過對(duì)照組實(shí)驗(yàn)、我們進(jìn)一步證明了所發(fā)展的檢測(cè)方法對(duì)GSH目標(biāo)具有很好的特異性，綜合考察熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的變化數(shù)據(jù)可以很好地區(qū)分GSH以及其他結(jié)構(gòu)類似的分子、同時(shí)探針對(duì)于多種鹽離子及氨基酸等不敏感、能夠很好地保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。我們報(bào)導(dǎo)的熒光探針合成步驟簡(jiǎn)單、過程綠色環(huán)保、GSH檢測(cè)的響應(yīng)速度快、光譜波動(dòng)較小、相對(duì)誤差小。進(jìn)一步的研究有望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的GSH高精度檢測(cè)及成像。

熒光光譜分析; 谷胱甘肽檢測(cè); 熒光探針; 銀納米團(tuán)簇

引 言

谷胱甘肽(GSH)是一種重要的三肽、它由L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸三種常見氨基酸縮合而成、分布于人和動(dòng)物的組織液和體液中[1]。尤其重要的是、體內(nèi)谷胱甘肽含量水平異常、可提示身體患有疾病、例如HIV、帕金森綜合征、肝損傷、炎癥等都會(huì)引發(fā)體內(nèi)谷胱甘肽含量的異常[2]。因此快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)谷胱甘肽、在對(duì)探明GSH在生理、病理上的功能以及揭示與之相關(guān)的含硫蛋白的生理、病理過程、疾病診斷領(lǐng)域的潛在應(yīng)用上具有重大的意義。近年來、許多檢測(cè)手段紛紛出現(xiàn)、比如MnO2量子點(diǎn)熒光探測(cè)[3]、SERS[4]、電化學(xué)分析、高效液相色譜HPLC[5]、毛細(xì)管電泳[6]等。

熒光探針是一種新型的GSH檢測(cè)手段、具有靈敏、準(zhǔn)確、高選擇性以及合成技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)[7-8]。量子點(diǎn)(QDs)、金銀納米顆粒、納米粒子上轉(zhuǎn)換(UCNPs) 等都已經(jīng)作為熒光探針被成功地用于GSH的檢測(cè)[3]、這些方法通常都是基于熒光探針的熒光峰強(qiáng)度的變化而達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)的目的。熒光峰的強(qiáng)度變化通常不易觀察、檢測(cè)相對(duì)誤差大、同時(shí)也需要昂貴精密的儀器、復(fù)雜的技術(shù)操作、很難達(dá)到快速檢測(cè)的要求。

尺寸極小(<2 nm)的貴金屬納米團(tuán)簇(NCs)、通常由幾個(gè)到幾百個(gè)金屬原子組成、具有介于單個(gè)原子和納米晶體(>2 nm)之間的物理化學(xué)特性[9-10]。由于其受到強(qiáng)的尺寸限制、納米團(tuán)簇(NCs)具有分離的、大小可調(diào)的電子能級(jí)、并具有類分子特性、例如量子化充電[10-11]。最新的研究已表明、發(fā)光的金(Au)銀(Ag)團(tuán)簇(NCs)在生物成像與生物探測(cè)的光學(xué)探針領(lǐng)域極具前景。與Au NCs相比、Ag NCs具有較低的生物毒性、較高的量子產(chǎn)率[12]。

本文報(bào)道一種基于熒光峰波長(zhǎng)移動(dòng)與熒光強(qiáng)度共同作用的新型熒光銀納米團(tuán)簇快速探測(cè)谷胱甘肽的方法、比傳統(tǒng)的依靠熒光峰強(qiáng)度變化探測(cè)的方法可以實(shí)現(xiàn)更精確、更快速的GSH檢測(cè)。作為熒光探針的銀納米團(tuán)簇利用聚(乙烯基甲醚-alt-馬來酸)(PMVEM)作為模板劑制備、合成步驟簡(jiǎn)單制備方便。由于Ag NCs具有很好的生物兼容性、因此本方法還有望應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)GSH探測(cè)或成像、這為熒光探針方法檢測(cè)GSH拓展了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

還原型谷胱甘肽(L-GSH、≥98.0%)、聚(乙烯基甲醚-alt-馬來酸)(PMVEM、Mw ～216000)、硝酸銀(AgNO3、>99%)、巰基琥珀酸(MSA、>97%)購(gòu)自Sigma-Aldrich； 氫氧化鈉(NaOH)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸鈉(NaNO3)、纈氨酸(Val)、組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)均為分析純、購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 所有試劑均未經(jīng)過進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)所用水均為18.2 MΩ去離子水。

暗箱式紫外分析儀(ZF-20D、上海越眾) 、穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(FluoroMax-4、Horiba)、紫外-可見分光光度計(jì)(TU1901、北京普析通用)。

1.2 光催化合成原始熒光銀納米團(tuán)簇(PMVEM-Ag NCs)

合成Ag NCs的方法如參考文獻(xiàn)[13]所述。簡(jiǎn)要的過程如下、稱取204 mg AgNO3加入到10 mL去離子水中攪拌溶解； 417.92 mg PMVEM加入到15 mL去離子水中攪拌溶解、同時(shí)加入～2 mL 2 mol·L-1的NaOH溶液使溶液pH 9。將配置成的PMVEM溶液倒入AgNO3溶液中并遮光不斷攪拌10 min。將混合液在365 nm紫外燈下照射30 min。制得原始PMVEM-Ag NCs。

1.3 谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)

取合成的PMVEM-Ag NCs溶液0.6 mL、加入到2.4 mL去離子水中、混勻、再加入0.6 mL不同濃度的GSH溶液混合均勻、靜置10 分鐘。對(duì)照組與此類似、加入不同的氨基酸與鹽溶液。

2 結(jié)果和討論

2.1 GSH檢測(cè)

AgNO3與PMVEM在365 nm紫外光照射下一步光還原形成PMVEM-Ag NCs。合成的Ag NCs在350 nm處有一個(gè)吸收峰、這是由PMVEM帶有的羧基(—COOH) 產(chǎn)生的、團(tuán)簇的熒光激發(fā)峰在355 nm、與羧基(—COOH) 吸收峰十分接近、團(tuán)簇?zé)晒馐怯婶然兆贤饩€與Ag核產(chǎn)生的配體—金屬(L—M) 電荷轉(zhuǎn)移形成的輻射躍遷所致[13]、PMVEM中羧基(—COOH)與Ag的L—M效應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光峰位于約530 nm處、我們測(cè)得其量子產(chǎn)率約為1%左右。

圖1 (a)PMVEM-Ag NCs在加入不同摩爾百分比[GSH/Ag]后的熒光光譜； (b) PMVEM-Ag NCs水溶液中的熒光強(qiáng)度和峰值位置隨不同摩爾百分比[GSH/Ag]的變化； 激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm

Fig.1 (a)Fluorescent spectra of PMVEM-Ag NCs at different percentages of molar concentration ratio[GSH/Ag]; (b) the photoluminescence intensity (PL) of PMVEM-Ag NCs and fluorescence peak position change with different [GSH/Ag] in aqueous solution. The excitation wavelength was fixed at 355 nm

固定溶液中PMVEM-Ag NCs的濃度、并逐漸增加GSH的濃度、圖1(a)表明隨著摩爾濃度比值[GSH/Ag]的百分?jǐn)?shù)增加、PMVEM-Ag NCs的熒光峰位置逐漸藍(lán)移、同時(shí)熒光強(qiáng)度也不斷減弱。圖1(b)顯示隨著[GSH/Ag]的摩爾比百分比從0～70 、團(tuán)簇?zé)晒夥鍙?30 nm藍(lán)移到447 nm、同時(shí)熒光峰強(qiáng)度也逐漸猝滅、強(qiáng)度降低到原始Ag NCs強(qiáng)度的3.88%。團(tuán)簇?zé)晒夥逦恢眉盁晒夥逯祻?qiáng)度與[GSH/Ag]摩爾濃度比值的關(guān)系大致滿足關(guān)系式

λPL=Ae-R/b+k

IPL=Ce-R/d+l

其中:λPL表示納米團(tuán)簇的熒光峰波長(zhǎng)、IPL表示納米團(tuán)簇的熒光峰值強(qiáng)度、R表示GSH與Ag的摩爾百分比、A、b、k、C、d、l為常數(shù)。

至此、通過同時(shí)檢測(cè)銀納米團(tuán)簇的熒光峰波長(zhǎng)移動(dòng)和強(qiáng)度變化、我們就可以得知GSH與AgNCs的摩爾百分比、在已知PMVEM-AgNCs濃度的條件下、實(shí)現(xiàn)GSH的有效檢測(cè)。探針探測(cè)GSH的檢測(cè)限為0.1mmol·L-1級(jí)別。進(jìn)一步稀釋探針溶液的濃度、提高熒光探測(cè)器的靈敏度、可以將檢測(cè)限降至更低的濃度。

2.2 檢測(cè)機(jī)理

熒光峰的移動(dòng)是由于GSH上帶有的巰基(—SH)刻蝕銀PMVEM-AgNCs形成新的團(tuán)簇所致。由于GSH上巰基(—SH)與Ag結(jié)合能力強(qiáng)過PMVEM上羧基(—COOH)與Ag的結(jié)合能力、團(tuán)簇上的PMVEM被GSH取代、原始PMVEM-AgNCs結(jié)構(gòu)被破壞、并重新與GSH形成新的團(tuán)簇(GSH-AgNCs)、這些團(tuán)簇也能發(fā)出熒光、但其發(fā)光波長(zhǎng)與原始的PMVEM-AgNCs不同。GSH與Ag形成的新納米團(tuán)簇中、由于巰基(—SH)與Ag具有較強(qiáng)的絡(luò)合能力、使GSH分子能與Ag絡(luò)合在一起、GSH上羧基、N原子同時(shí)也與Ag靠近并產(chǎn)生相互作用。GSH中羧基(—COOH)與Ag的絡(luò)合發(fā)出的熒光與PMVEM中羧基(—COOH)絡(luò)合發(fā)出的熒光一致、具有增強(qiáng)熒光的作用；N原子與Ag絡(luò)合產(chǎn)生了新的輻射性LUMO-HUMO能級(jí)、產(chǎn)生的熒光位置大約在420nm左右[13]。整體熒光減弱是由于新形成的熒光團(tuán)簇結(jié)構(gòu)很少、且過量巰基(—SH)同樣會(huì)過度刻蝕新形成的發(fā)光團(tuán)簇。

圖2 (a) PMVEM-Ag NCs在加入不同摩爾百分比[MSA/Ag]后的熒光光譜； (b) PMVEM-Ag NCs水溶液中加入不同摩爾百分比的GSH(紅線)和MSA(藍(lán)線)后的熒光光譜； 對(duì)照組為原始的PMVEM-Ag NCs; 激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm

Fig.2 (a) Fluorescent spectra of PMVEM-Ag NCs with different percentage of molar concentration ratio[MSA/Ag]; (b) fluorescent spectra of PMVEM-Ag NCs with different concentration of GSH (red curve) and MSA (blue curve) in aqueous solution; compared with the fluorescent spectra of original PMVEM-Ag NCs. The excitation wavelength was fixed at 355 nm

深入研究探針的機(jī)理對(duì)于改進(jìn)探針的性能以及開發(fā)新型的探針等都具有重要的意義。發(fā)光金屬納米團(tuán)簇的發(fā)光機(jī)理曾被認(rèn)為是金屬核的量子局限效應(yīng)(quantum confinement)、不同的發(fā)光波長(zhǎng)是由于金屬核大小差異引起的。所以對(duì)于基于金屬納米團(tuán)簇探針的機(jī)理解釋中、也采用量子局限效應(yīng)的概念。例如、Mrudula[14]解釋是由于S對(duì)于Ag核的刻蝕作用引起的。

但是近期的研究結(jié)果更傾向于發(fā)光金屬納米團(tuán)簇的發(fā)光機(jī)理是由于配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移引起的。我們對(duì)于PMVEM-Ag NCs檢測(cè)GSH的機(jī)理也進(jìn)行了研究。PMVEM-Ag NCs對(duì)于一種與GSH類似的分子巰基琥珀酸(MSA)的響應(yīng)如圖2(a)所示。MSA分子與GSH分子有著相同數(shù)目的羧基(—COOH)、巰基(—SH)、但不含N原子。由圖2(a)可見、隨著MSA分子濃度的增加、PMVEM-Ag NCs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱、但是熒光峰位置一直位于530 nm處。由于MSA的巰基(—SH)與Ag絡(luò)合作用很強(qiáng)、MSA分子可以刻蝕Ag NCs使團(tuán)簇的尺寸減小。在MSA加入之后、PMVEM-Ag NCs的熒光只是強(qiáng)度減弱而熒光峰位置不變的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象再次證明了Ag NCs的發(fā)光機(jī)理為配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移、而不是量子限域效應(yīng)。所以PMVEM-Ag NCs的發(fā)光機(jī)理是由于羧基到銀原子的電荷轉(zhuǎn)移。加入MSA之后、MSA的巰基(—SH)與Ag的強(qiáng)絡(luò)合作用破壞了羧基到銀原子的電荷轉(zhuǎn)移通道以及原始的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)、使得PMVEM-Ag NCs熒光強(qiáng)度不斷減弱直至消失、而MSA上中羧基(—COOH)與Ag的絡(luò)合發(fā)出的熒光與PMVEM中羧基(—COOH)絡(luò)合發(fā)出的熒光一致、所以熒光一直處于530 nm處不變。

PMVEM-Ag NCs對(duì)于GSH和MSA分子響應(yīng)的對(duì)比關(guān)系如圖2(b)所示。GSH除了帶有與MSA相同數(shù)目的巰基(—SH)與羧基(—COOH)之外、還帶有氮(N)。GSH與PMVEM-Ag NCs相互作用過程中、巰基(—SH)與Ag的強(qiáng)絡(luò)合能力使GSH分子能與團(tuán)簇結(jié)合在一起、GSH上羧基、N原子同時(shí)也與Ag靠近并產(chǎn)生相互作用。GSH中羧基(—COOH)與Ag的絡(luò)合發(fā)出的熒光與PMVEM中羧基(—COOH)絡(luò)合發(fā)出的熒光一致。但是、GSH中的N原子與Ag絡(luò)合產(chǎn)生了新的電子躍遷通道、產(chǎn)生的熒光位置大約在420 nm左右。所以、隨著GSH濃度的增加、體系的熒光峰逐漸藍(lán)移。比較Fig.2(b)中相同檢測(cè)物濃度(GSH/Ag=5%與MSA/Ag=5%、GSH/Ag=10%與MSA/Ag=10%)的曲線、可見相同檢測(cè)物濃度下的GSH比MSA體系的發(fā)光更強(qiáng)、這是因?yàn)镚SH中的N與Ag配合后提供了比MSA更多的電子躍遷通道。所以PMVEM-Ag NCs的熒光特性對(duì)于檢測(cè)物分子含有巰基(—SH)、羧基(—COOH)、和N原子的官能團(tuán)及數(shù)目均有響應(yīng)。值得注意的是、雖然凡是含有巰基(—SH)的分子都會(huì)對(duì)熒光探針具有刻蝕作用、從而導(dǎo)致熒光猝滅； 但是水溶性很弱的分子或者與Ag絡(luò)合后水溶性不強(qiáng)的分子、盡管含有N原子、也難以在水相中觀測(cè)到熒光峰有規(guī)律穩(wěn)定移動(dòng)的現(xiàn)象、檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為快速猝滅熒光或者熒光峰移動(dòng)現(xiàn)象不明顯。這決定了PMVEM-Ag NCs的光譜響應(yīng)特性對(duì)于檢測(cè)物GSH分子具有很好的識(shí)別性。

2.3 檢測(cè)的特異性

圖3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)。加入不同對(duì)照分子引起的PMVEM-Ag NCs的熒光峰值位置變化(a)和熒光強(qiáng)度變化(b)。(目標(biāo)分子摩爾百分比為20%、激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm)I和I0分別表示加入不同對(duì)照分子后和未加入的熒光強(qiáng)度

Fig.3 The control group experiments. The variations of fluorescence peak positions(a)and fluorescence intensities (b)of PMVEM-Ag NCs corresponding to different detection target. (The molar concentration ratio is 20%,and the excitation wavelength was fixed at 355 nm)IandI0represent the fluorescence intensities with and without target samples,respectively

3 結(jié) 論

通過一種簡(jiǎn)單的合成步驟、我們制備了一種銀納米團(tuán)簇作為檢測(cè)GSH的熒光探針。通過觀測(cè)銀納米團(tuán)簇的熒光峰位置移動(dòng)以及熒光強(qiáng)度變化、發(fā)展了一種對(duì)GSH探測(cè)的新方法。這種檢測(cè)方法對(duì)GSH具有非常好的特異性、濃度檢測(cè)更精確、響應(yīng)非?？?。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明、該探針對(duì)GSH具有較高的選擇性、對(duì)于多種鹽離子及氨基酸等不敏感。此外、我們還討論了該探針的探測(cè)機(jī)理。該研究為有針對(duì)性的開發(fā)新型探針具有重要的指導(dǎo)作用。由于Ag NCs具有很好的生物兼容性的優(yōu)點(diǎn)、進(jìn)一步的研究有望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的GSH檢測(cè)及成像、并拓展更多的應(yīng)用。

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*Corresponding author

Precise and Rapid Detection of Glutathione by Using Novel Fluorescent Ag Nanoclusters

HUANG Ke-han,QIN Cui-fang,CAO Xiao-dan,YANG Tai-qun,CHEN Yu-ting,ZHANG San-jun,PAN Hai-feng*,XU Jian-hua

State Key Laboratory of Precision Spectroscopy、East China Normal University、Shanghai 200062、China

Glutathione (GSH) is an important three-peptide molecule,which has the functions of antioxidation and detoxification,and plays a crucial role in the fields of biology,medicine and food science. It is involved in many important biochemical reactions in cells and body fluid,and the changes of GSH content reflect the specific health problems of human body. Current methods of GSH detection are always complicated,time-consuming and expensive instrument depended,such as surface enhanced Raman spectroscopy (SERS),electrochemical analysis,high performance liquid chromatography (HPLC) and so on. The probe’s photochemical properties can be modified by the reaction between GSH and nanoclusters,which will result in the changes of fluorescence intensity and wavelength. In this paper,a new method to realize precise and rapid GSH detection is developed by using silver na-noclusters as a fluorescent probe,and simultaneously measures the probe’s fluorescence intensity and wavelength. The synthesis of the fluorescence probe reported in this paper possesses the advantages of steps-simple and pollution free,and the GSH detection method has faster response,more accurate measurement and smaller relative error over the traditional methods. The good specificity of GSH detection among other molecules with the similar structure is further proved in control group experiments by comparing the differences of their fluorescence intensities and wavelength. The measurement accuracy is fully assured due to the insensitivity of the probe to a variety of salt ions and amino acids. This technique can be further employed in the intracellular detection and imaging of GSH.

Fluorescence spectral analysis; Glutathione detection; Fluorescent probe; Silver nanoclusters

Oct. 27,2015; accepted Feb. 10,2016)

2015-10-27、

2016-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61178085)和上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(15ZR1410100)資助

黃科翰、1987年生、華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室碩士研究生 e-mail: 271550179@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：hfpan@phy.ecnu.edu.cn

O641; O649

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3973-05