高致病性豬繁殖與呼吸綜合征與豬偽狂犬病混合感染的診斷

（信陽農(nóng)林學院牧醫(yī)工程學院，河南 信陽 464000）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征與豬偽狂犬病混合感染的診斷

連慧香

（信陽農(nóng)林學院牧醫(yī)工程學院，河南 信陽 464000）

為了解信陽某豬場發(fā)病仔豬死亡原因，通過流行病學調查、病理解剖、偽狂犬病毒PCR檢測、PRRSV的PCR檢測、PRRSV分離株ORF5基因的PCR擴增及序列分析等方法，對該豬場發(fā)病豬進行了診斷。結果表明，該豬場豬只為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV)和偽狂犬病病毒（PRV）的混合感染。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬偽狂犬病毒；混合感染；診斷

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome）又稱豬藍耳病，該病以母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道疾病為主要臨床特征。自1997年報道以來，PRRS在我國不斷有發(fā)生，特別是2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HPPRRSV）毒株出現(xiàn)以來，被認為是豬“高熱病”的主要病原[1-2]，HP-PRRSV在我國不同規(guī)模的養(yǎng)豬場流行，且常與豬瘟、豬圓環(huán)病毒病等多種病混合感染，不僅給診斷帶來很大的麻煩，還常常耽誤治療，也給養(yǎng)豬業(yè)的疾病防控帶來巨大挑戰(zhàn)[3]。豬偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是一種由偽狂犬病毒引起的急性傳染病[4]，以母豬的繁殖障礙、仔豬的高死亡率且伴有嚴重神經(jīng)癥狀為特征,也是目前嚴重影響中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。

筆者就一起高致病性豬繁殖與呼吸綜合征及豬偽狂犬病混合感染病例的診斷進行報道?，F(xiàn)將詳細情況報道如下：

1 材料與方法

1．1 材料

豫南地區(qū)某豬場送檢的3頭發(fā)病仔豬。

1．2 試劑

TaKaRa LA Taq，RNAiso Plus，RNase inhibitor（40U/μL），M-MLV（Rnase H-）（200U/μL），dNTP Mixture，Premix Ex TaqTM試劑，PMD18-T vector，DNA Marke等工具酶均為大連寶生物公司（TaKaRa）產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒，膠回收試劑盒均購于愛思進生物技術（杭州）有限公司；大腸桿菌（DH5α）為廣西大學動物科技學院惠贈。

1．3 流行病學調查及病理剖解

通過詢問畜主了解豬群發(fā)病情況，按常規(guī)方法對送檢病豬進行剖解，觀察病豬臟器的病理變化。

1．4 實驗室診斷

1.4.1 細菌的分離

在無菌條件下，采集病死豬各組織，進行細菌劃線分離。

1.4.2 PRV的PCR檢測

將該豬場死亡的仔豬在無菌操作下分別采集腦、肺臟、肝臟、脾臟等組織，常規(guī)方法進行研磨，-20 ℃反復凍融3次后，抽提DNA,應用PCR方法分別進行PRV的檢測。PRV引物序列：F：5'-CACGGAGGACGAGCTGGGGC T-3’，R：5'-GTCCACGCCCCGCTT GAAGCT-3’，擴增片段217 bp；PCR擴增反應體系（25μL/樣品）：LA Taq(5U/μL)0.5 μL，2×GCBuffer12.5 μL，dNTP mixtue2 uL，上下游引物各（10μM/L）各1.0 μL，模板DNA3μL，補水至25μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.3 PRRSV的檢測

1.4.3.1 病料的處理和總RNA的提取

將病料剪碎研磨，反復凍融3次后8 000 r/min離心5 min，取上清液，采用Trziol法抽提病毒的總RNA，RT擴增條件：42 ℃恒溫作用1 h，95 ℃5 min，合成的cDNA-20 ℃保存?zhèn)溆没蛘咧苯佑糜谥蟮腜CR反應。

1.4.3.2 病料的檢測

以上述cDNA作為模板，PRRSV檢測引物序列：F：5'-AAGCTGTT AAACAGGGAGTGG-3'，R：5'-C CAAAGAATACCAGCCCATCA-3’，擴增片段443 bp；PCR擴增反應體系（25μL/樣品）：上、下游引物（10μM/ L）各1.0μL，Taq Mix12.5μL，RNase Free dH2O7.5μL，cDNA3μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過凝膠（1.2%瓊脂糖）電泳進行檢測。

1.4.4 PRRSV陽性毒株ORF5基因的擴增及序列分析

利用ORF5引物對PRRS陽性標本進行PCR擴增，PRRSVORF5引物序列：F：5'-AGGTGGGCAACCGTTTTA-3'，R：5'-CATCACTGGCGTGTAGGT AAT-3'，擴增片段738 bp；反應體系50 μL/樣品：cDAN2 μL，LATaq（5 U/μL）（TaKaRa）0.5μL，10×LA Taq Buffer 5μL，dNTPs（2.5 mMeach）8 μL，上、下游引物（10 μM/L）各1.0 μL，RNase Free dH2O32.5μL。ORF5基因PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物膠回收純化后與PMD-18T載體連接，用ORF5引物進行菌液PCR鑒定，篩選陽性克隆，抽提質粒經(jīng)酶切鑒定正確后送至上海杰李公司進行序列測定。測序所獲得的基因序列應用生物軟件Lasergene分析。

2 結果

2．1 流行病學調查及病理解剖

該豬場存欄繁殖母豬55頭，后備母豬50頭，公豬4頭，斷奶前仔豬180頭，育肥豬300頭。2015年12月未斷奶仔豬與育肥豬相繼出現(xiàn)了體溫升高、呼吸困難、部分病豬耳朵、四肢內(nèi)側、腹部發(fā)紺，拉黃色稀糞，個別仔豬還出現(xiàn)轉圈等癥狀,隨后倒地死亡。同時，該場懷孕母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎等現(xiàn)象。發(fā)病初期使用黃芪多糖、多種抗生素治療效果不佳，疫情迅速擴散至全場。

剖檢可見肺實變、腫脹；全身多處淋巴結腫大、出血；喉頭有點狀出血；腎腫大表面有出血斑，脾腫大表面有出血點，膀胱內(nèi)膜有散在出血點。

2．2 PRV的PCR檢測

將采集的病料經(jīng)常規(guī)方法處理后，提取總DNA為模板，進行PCR擴增。結果見圖1，擴增出一條約217 bp的片段，因此判定該死亡豬只感染了PRV。

2．3 PRRS的檢測結果

2.3.1 PCR檢測

圖1 偽狂犬病毒的PCR檢測

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測

將病料按常規(guī)方法處理后，提取基因組作為模板，進行PCR擴增并經(jīng)瓊脂糖電泳，結果見圖2，擴增出一條443 bp左右的片段，因此判定死亡豬只感染了PRRSV。

2.3.2 ORF5基因的擴增及序列分析

PCR擴增結果顯示，得到的核苷酸片段與預期結果大小符合，為738 bp（圖3）。暫命名為HN-XY株。

利用Lasergene軟件分析HN-XY株與國內(nèi)外已發(fā)表毒株的ORF5序列核苷酸同源性，結果顯示分離株與高致病性代表株JXA1和HUN4的核苷酸同源性最高為99.2%和99.3%（圖4）。系統(tǒng)遺傳進化樹表明分離株與JXA1同屬一分支，而與中國第一分離株CH-1a親緣關系較遠，處于不同的分支（圖5）。表明分離株為高致病性PRRSV。

圖3 PRRSV陽性毒株ORF5基因PCR擴增

圖4 分離毒株與參考毒株ORF5基因核苷酸同源性比對結果

圖5 基于ORF5核苷酸序列遺傳進化樹

4 討論

通過流行病學調查、病理解剖、偽狂犬病毒PCR檢測、PRRSV的PCR檢測、PRRSV分離株ORF5基因的PCR擴增及序列分析等方法對信陽市某豬場發(fā)生疫情的病例進行實驗室診斷，綜合分析可以確診該場豬發(fā)生的疫病為高致病PRRSV和偽狂犬混合感染。

目前，對于PRRS并沒有特異性的治療方法，做好PRRS的防控工作尤為重要，PRRS疫苗的應用為預防和控制PRRS的發(fā)生發(fā)揮了巨大的作用[5-6]。但是PRRS的不斷變異和新毒株的層出不窮[7-8]，為依賴疫苗進行防控帶來了挑戰(zhàn)。疫苗免疫效果根據(jù)疫苗株與野毒株之間同源性的高低而不同，對變異較大的病毒株交叉免疫保護性較低，免疫效果不理想。由于該場使用的疫苗為傳統(tǒng)的PRRSV弱毒疫苗，這對普通PRRS保護是有效的，但對高致病性的PRRS的交叉保護比較差，遠達不到預防與控制豬群疾病的目的。本次疫情的發(fā)生，就可能是豬繁殖與呼吸綜合征免疫的失敗而造成的。

豬繁殖與呼吸綜合征是一種免疫抑制性傳染病，機體感染后可導致免疫力嚴重下降；另外12月底外界氣溫低，為保暖起見豬場減少了豬舍與外界空氣對流的措施，豬舍內(nèi)空氣不流通再加上衛(wèi)生防疫管理差和飼養(yǎng)密度過大，保育豬抵抗力低；再者經(jīng)過了解該豬場育肥豬35日齡免疫一次豬偽狂病疫苗，母豬產(chǎn)前25 d免疫一次豬偽狂犬病疫苗，由于該豬場未能進行合理次數(shù)的免疫，導致豬體抗體低下，導致本次偽狂犬病的發(fā)生。

本次對發(fā)病豬群進行了診斷，診斷為HP-PRRSV和PRV混合感染，并成功分離到一株高致病性PRRSV毒株，為PRRSV的研究提供了試驗材料。

[1] 童光志,周艷君,郝曉芳,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29(5):323-327.

[2] 薛平,曲向陽.我國高致病性藍耳病研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2014,42(5):1389-1392.

[3] 周緒斌.盤點2010——中國規(guī)?；i場主要豬病的現(xiàn)狀與分析[J].豬業(yè)科學,2011,28(1):50-54.

[4] 馬沛,王和平.豬偽狂犬病的流行情況及凈化對策[J].湖南畜牧獸醫(yī),2013(4):23-25．

[5] 胡守萍,張卓,蔡雪輝，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗和變異株滅活疫苗的免疫效果評價[J].中國預防獸醫(yī)學報,2009,31(5):392-396.

[6] KRITAS S K,ALEXOPOULOS C,KYRIAKIS C S,et al.Performance of fattening pigs in a farm infected with both PRRSV and PCV type 2 following sow and piglet vaccination with an attenuated PRRS vaccine[J].Journal of Veterinary Medicine,2007,54(6):287-291.

[7] 楊漢春.2014年豬病流行情況與2015年流行趨勢及防控對策[J].豬業(yè)科學,2015,32 (2):38-40.

[8] 周磊,楊漢春,姜平，等.豬繁殖與呼吸綜合征防控技術與應用[J].中國畜牧雜志,2015,51(6):62-67.

2016-05-17）

河南省科技攻關項目（162102110034）。

連慧香（1978-），女，講師，碩士研究生，研究方向為動物健康生產(chǎn)與疫病防治。