豬病檢測新技術(shù)與未來趨勢大家談

專家觀點

豬病檢測新技術(shù)與未來趨勢大家談

本刊編輯/張金輝

豬病檢測是指獸醫(yī)及其他技術(shù)人員通過臨床檢查、應(yīng)用先進的儀器設(shè)備及實驗室檢查等方法及早確診豬病，減少損失。隨著豬病的流行趨勢越來越復(fù)雜，大家對豬病檢測技術(shù)的關(guān)注度日益提高，相關(guān)的檢測技術(shù)也是層出不窮。那么，目前豬場中普遍采用哪些檢測技術(shù)、又有哪些新的檢測技術(shù)、未來如何發(fā)展等一系列問題，我們非常榮幸邀請到行業(yè)內(nèi)的專家、教授共同探究，從專業(yè)角度分享有關(guān)豬病檢測的專業(yè)知識及應(yīng)用經(jīng)驗、新技術(shù)開發(fā)等，以期為大家提供一些幫助。

特邀嘉賓：（排名不分先后）

左玉柱（河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 預(yù)防獸醫(yī)系主任）

曲向陽（環(huán)山集團養(yǎng)殖事業(yè)部獸醫(yī)總監(jiān)）

王艷豐（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院動物疫病快速診斷中心主任）

焦連國（大北農(nóng)動物醫(yī)學研究中心技術(shù)總監(jiān)）

陶明華（上海海利生物技術(shù)股份有限公司技術(shù)服務(wù)經(jīng)理）

左玉柱主任

曲向陽獸醫(yī)總監(jiān)

王艷豐主任

焦連國技術(shù)總監(jiān)

陶明華技術(shù)服務(wù)經(jīng)理

1 目前，在規(guī)模豬場常見的豬病檢測方法有哪些？存在哪些不足？

王艷豐：目前，豬場的常見病主要是傳染病和寄生蟲病，尤以前者最為嚴重。因此，實驗室檢測的重點主要是豬傳染病。豬傳染病分為細菌性傳染病和病毒性傳染病，細菌性疾病的實驗室檢測方法主要有涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗、動物試驗、血清型鑒定及藥敏試驗等，屬于傳統(tǒng)的實驗室檢測方法，操作繁瑣，需要的時間長。病毒性疾病檢測常用方法主要有3種：一是膠體金檢測卡試紙條，如豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病等，分為抗原檢測卡和抗體檢測卡，檢測所需時間短，但其敏感性較低，且檢測結(jié)果只能提供陽性、弱陽性、陰性的半定量結(jié)果，無法提供數(shù)值性的檢測結(jié)果。因此，該方法目前只能作為初篩診斷試劑，用于疾病的輔助診斷。同時，也無法區(qū)分是疫苗抗體還是野毒抗體；二是抗體（抗原）檢測ELISA試劑盒，目前，常用的豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病、豬圓環(huán)病毒病、豬口蹄疫等，既有國產(chǎn)的，也有進口的，操作方便，檢測結(jié)果快，但需要酶標儀，并且抗體ELISA檢測試劑盒，除豬偽狂犬病等少數(shù)試劑盒外，其他大多無法區(qū)分疫苗抗體和野毒抗體，往往需要根據(jù)抗體水平升高的幅度和抗體離散度、臨床表現(xiàn)等來進行判斷，并且有些國產(chǎn)試劑盒與進口試劑盒檢測結(jié)果存在一定差異。三是PCR檢測方法，科研院所、大專院校及部分畜牧局系統(tǒng)應(yīng)用較多，檢測結(jié)果準確，但需要配套儀器，如PCR基因擴增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等，投入費用高，操作條件要求高，需要專業(yè)人士才能操作。其他，如血凝試驗、中和試驗、凝集試驗及瓊脂擴散試驗等，要么操作復(fù)雜、技術(shù)要求高，需要昂貴儀器，需要一定條件的實驗室才能開展，要么特異性較低，也不適合大批量樣品的檢測。

焦連國：目前在規(guī)?；i場常見的豬病檢測方法有：1）ELISA方法：根據(jù)檢測對象不同設(shè)計了直接法、間接法、夾心法等不同類型的ELISA方法。ELISA是目前檢測抗體最常用與應(yīng)用最廣泛的方法。其面臨挑戰(zhàn)有：①敏感性有待提高，特別是檢測抗原；②臨床標準不統(tǒng)一，缺乏具有公信力的產(chǎn)品評價機構(gòu)；③檢測結(jié)果與金標準還有一定差距，例如：抗體檢測是IgG抗體，而與中和抗體并不完全一致。2）免疫熒光方法：其應(yīng)用較廣的是采集扁桃體檢測豬瘟病毒，由于試劑與專業(yè)人員等的限制，目前應(yīng)用較少。3）基因檢測技術(shù)：包括PCR、RT-PCR及基因測序等技術(shù)?；驒z測技術(shù)是目前抗原檢測中最主要的技術(shù)，基因測序的應(yīng)用，便于區(qū)分疫苗毒與野毒，進一步提高了其應(yīng)用價值。基因檢測技術(shù)的不足：①結(jié)果陽性不代表臨床發(fā)病，還需要與剖檢、生產(chǎn)相結(jié)合，科學評估；②標準不統(tǒng)一，沒有行業(yè)標準，假陽性或假陰性可能導(dǎo)致誤判；③取樣不合理，盲目下結(jié)論，不同檢測機構(gòu)檢測結(jié)果差異大。4）細菌分離與藥敏試驗：目前實驗室細菌分離與藥敏試驗開展不多，需要專業(yè)化實驗室真正分離出致病性細菌并進行鑒定和增菌，最后篩選出敏感性藥物。5）其他檢測技術(shù)：膠體金、乳膠凝集、間接血凝等。其具有操作簡單、不需要特殊設(shè)備等特點，而在基層有一定應(yīng)用，但由于其敏感性和特異性的不足，多應(yīng)用于初步判斷。

曲向陽：目前我公司診斷實驗室的傳染病診斷方法依然以病原學檢測與血清學檢測為主。顯微病理診斷有待建立。

1）病原分離：雖然病原分離與鑒定相對耗時，但依然是很多疾病診斷的“黃金標準”。但很多規(guī)模化豬場診斷實驗室尚未開展此工作，或雖具備病原菌（或病毒）分離的設(shè)備條件，但在生產(chǎn)中實踐應(yīng)用的較少。目前環(huán)山集團養(yǎng)豬事業(yè)部診斷實驗室已掌握了常見細菌（大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等）的分離與鑒定方法?？蛇M一步進行藥敏試驗，可疑病原菌的血清型鑒定、毒力評價等，豐富了病原菌庫，也極大地提高了臨床診治的效率。但因勞動量限制，目前我們通常不依照科赫法則（Koch postulates）對所分離細菌進行致病性回歸驗證（感染的病原菌有時并不具備致病性）。明年我們將新建細胞間，屆時我們將開展感染病毒的分離與鑒定工作。

2）分子生物學診斷：目前以常規(guī)的PCR診斷為主。操作便捷，也可較快地獲知結(jié)果。但樣品選擇、試劑盒是否標準化及實驗室交叉污染的控制等會極大地影響診斷結(jié)果。在實驗室PCR結(jié)果的基礎(chǔ)上，需要與臨床癥狀、剖檢病變結(jié)合，進行綜合診斷。目前我們將該方法主要用于豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬瘟、豬流行性腹瀉等病毒性疾病的診斷與凈化控制過程。

3）血清學診斷：如：中和試驗、ELISA、膠體金試劑條、免疫磁珠法等。目前主要利用ELISA評價免疫后抗體的水平。臨床成熟應(yīng)用的血清學疾病診斷方法主要是偽狂犬（PRV）ELISA gE抗體試劑盒。試劑盒已經(jīng)標準化。但因為當前國內(nèi)種豬群PRV的感染率較高，母源抗體攜帶的gE抗體（可持續(xù)12～14周齡以上）有時會干擾結(jié)果的解讀。對于PRV陰性場，PRV的gE抗體的產(chǎn)生也需要7～10 d以上，發(fā)病初期的gE抗體滴度低，很容易做出假陰性的判斷。對于發(fā)病初期，最好利用PCR進行診斷結(jié)果驗證。對于已完成豬藍耳病凈化且不免疫藍耳疫苗的豬場，也可利用PRRSV血清抗體檢測作為豬藍耳病毒感染的有效診斷方法。未來也可嘗試利用唾液樣品，進行陰性場PRRSV感染的監(jiān)控。

4）顯微病理診斷：因病理切片制備的設(shè)備投入大，病理切片解讀需要較豐富的臨床經(jīng)驗，故目前我們實驗室尚未開展此方法。但病理診斷依然是最可靠、最傳統(tǒng)的診斷方法，值得學習、推廣。

2 市場上出售的很多方便、快捷的豬病檢測試劑盒是否使用過？您認為有哪些優(yōu)缺點？

曲向陽：目前曾使用的標準化診斷試劑盒包括：ELISA試劑盒、PCR試劑盒、膠體金快速診斷試劑條等。

1）ELISA試劑盒商品化的較多，但需要對所選試劑盒的品質(zhì)（特異性與敏感性）進行評價，ELISA結(jié)果的解讀對于很多規(guī)?；i場的技術(shù)人員來說依然是難點。如：豬瘟、豬藍耳病、豬偽狂犬病、口蹄疫、豬圓環(huán)病毒病、豬支原體肺炎等。

2）FIRST-test 回腸炎診斷試劑盒，采用免疫磁珠法，對勞森氏菌直接檢測。特異性好，敏感性強，可在回腸炎的感染評價上應(yīng)用。但因豬場中回腸炎感染比例高，不推薦將此方法作為急性回腸炎診斷的方法（可依靠剖檢診斷，病變較典型）。

3）PCR試劑盒偶有使用。我們主要以自己建立的PCR檢測體系為主。因病原的變異，有時會導(dǎo)致PCR檢測假陰性，需要定時更新PCR檢測體系。

4）膠體金試劑條：目前效果較好的是PEDV試劑條、瘦肉精檢測試劑條等。敏感性與特異性相對較好。

王艷豐：目前，市場上銷售的豬病檢測試劑盒較多，既有國產(chǎn)的（如武漢科前、北京世紀元亨等），也有進口的（如美國IDEXX、韓國金諾、荷蘭BioChek、瑞士Prionics等），每個實驗室可以根據(jù)檢測對象、檢測要求和檢測目的，選擇適合自己實驗室的豬病檢測試劑盒。優(yōu)點是簡單便于操作，敏感性和特異性高，批間變異系數(shù)小，檢測所需時間短，2～3 h內(nèi)即可以出現(xiàn)結(jié)果。但在實際應(yīng)用中也存在一些問題，如不同公司生產(chǎn)的豬病檢測試劑盒對同一份血清抗體檢測結(jié)果存在差異，有時差異較大，靈敏度也存在差異，符合率低；試劑盒檢測結(jié)果與參考血清的中和試驗結(jié)果符合率低；由于不同的試劑盒有不同的檢測方法，如單抗阻斷、雙單抗阻斷和多抗阻斷等，有些試劑盒其板孔包被抗原的來源也不同，故每種試劑盒的特異性與敏感性完全相符的可能性較小，用不同試劑盒檢測抗體，其抗體的阻斷率會出現(xiàn)差異。

3 豬病檢測過程中如何正確地進行病料的采集與保存？

焦連國：病料的正確采集與保存是至關(guān)重要的，是實驗室檢測的第一步。病料的采集要按照下面進行：1）準確掌握發(fā)病信息：詳細掌握豬場的疫病狀況，評估可能的疫病種類；2）要選擇發(fā)病典型有代表性的豬；3）樣本數(shù)量科學：這是目前檢測中的不足之處，往往被忽視。建議按發(fā)病前中后各取2頭豬，共取6頭，流產(chǎn)胎兒采集6窩，每窩采集典型胎兒2頭，流產(chǎn)母豬的血液采集10～15份；4）做好剖檢記錄：現(xiàn)場記錄與拍照相結(jié)合，由于檢測的疫病種類有限，特別是細菌性疾病，剖檢是評估細菌病危害的重要途徑；5）科學采集病料，不同病原體對豬的侵害器官是不同的，同一種病原體在不同組織器官的含量與存在時間是不同的。例如：豬偽狂犬病原檢測最敏感的是腦組織。采樣一般要采集到豬的腦、扁桃體、肺臟、腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、腸道（豬腹瀉）、血液等。6）病料采集一定要快，減少暴露在外界的時間，特別是要做細菌分離的，避免腐爛變質(zhì)。采集病料要注意避免病料的交叉污染，盡量減少消毒液浸泡與洗滌組織。病料保存要注意：1）血液冷藏保存，運送時放到泡沫箱內(nèi)并加冰袋；2）組織與胎兒冷凍保存，溫度越低，病原體保存越久；3）細菌分離的樣品，短期冷凍后盡快送檢。

陶明華： 1）選擇臨床癥狀比較典型，能代表整個豬群發(fā)病特點的病豬2～3頭以上進行剖解。在客戶同意的情況下，如有必要，可以剖檢1～2頭發(fā)病豬群前5～7 d的健康豬，了解豬病的發(fā)病規(guī)律。 2)送檢的病料主要以腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟、腎臟、脾臟為主，注意做細菌分離的內(nèi)臟必須完整，解剖時避免污染。 3)細菌性疾病的診斷及檢測，需要對送檢的病豬停藥5～7 d（包括針劑注射和飼料、飲水給藥），方可解剖病豬，取所需病料送檢。4)血清學抗體檢測時，根據(jù)豬場的不同階段，按照每個階段的群體隨機抽樣5%～10%份血樣。每份血樣采集2～5 mL，靜置平放15～20 min，充分析出血清后2～8 ℃冷藏保存。5)樣品登記及豬場背景信息描述清楚（場名、樣品數(shù)量、送檢人及聯(lián)系方式、豬場免疫程序、豬群疫病發(fā)生情況及用藥治療等，一式兩份（一份留檔，一份同病料送至檢測實驗室）。6)注意事項:①采取病料的種類，根據(jù)不同的疫病或檢驗?zāi)康模扇∠鄳?yīng)的血樣，活體組織，臟器、腸內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他病料。②內(nèi)臟病料的采取，建議剖檢活體：如患豬已死亡3 h以上，不予采取病料。③活豬組織取出后，不能直接放入冷凍環(huán)境，先置于室溫待溫度降下來后再放入冰箱或冰盒中儲存。④做好人身防護，必須帶手套，必要時帶口罩，嚴防人畜共患病。

4 面對大專院校、科研院所、豬病檢測實驗室等諸多的豬病檢測單位，應(yīng)如何去選擇檢測單位？如何確保檢測的準確性，要注意什么？

左玉柱：近年來，由于豬病日益復(fù)雜化，混合感染較多，單純依靠臨床診斷很難確診，因此各大專院校、科研院所和豬病檢測實驗室等都逐漸推出了實驗室檢測服務(wù)。豬場在選擇檢測單位時，首先應(yīng)該考慮檢測單位的中立性，只有中立的，不代理銷售產(chǎn)品的實驗室才能保證結(jié)果的可靠性。其次，應(yīng)該考慮檢測單位的技術(shù)水平，檢測過程不但涉及到儀器設(shè)備，試劑盒，而且涉及到檢測人員的操作，這些都是直接影響檢測效果的因素。因此，要確保檢測的準確性，在選擇檢測單位時，還需要注意以下問題：

1）檢測單位有相應(yīng)的硬件設(shè)施。檢測過程中，無論是采用ELISA方法對抗體進行檢測，還是采用PCR方法對病原進行檢測，都需要相應(yīng)的儀器設(shè)備，因此如果一個檢測單位不具備相應(yīng)的硬件設(shè)施，那么該單位采用的檢測方法應(yīng)該是一些便捷的，不需要特殊儀器設(shè)備的方法，這些方法的簡單快捷，但往往準確度差。

2）檢測單位采用的試劑盒是應(yīng)該是質(zhì)量比較過關(guān)的試劑盒，許多檢測單位為了在收費價位上迎合豬場的需要，采取了一些低價質(zhì)劣的試劑盒，盡管檢測費用比較低，但是準確度很差，不但起不到指導(dǎo)生產(chǎn)的作用，而且可能會誤導(dǎo)豬場。

3）檢測單位要具備相應(yīng)的技術(shù)實力。許多檢測機構(gòu)認為只要購置了相應(yīng)的試劑盒，就可以按照操作說明進行，但在實驗過程中涉及需要操作細節(jié)，這些細節(jié)影響了結(jié)果的準確性和可靠性。另外，檢測數(shù)據(jù)的分析，也需要與生產(chǎn)實踐緊密結(jié)合，否則也很難指導(dǎo)生產(chǎn)，這些需要既熟悉檢測操作，又熟悉疫病的基礎(chǔ)理論和臨床特點的技術(shù)人員來完成。

陶明華：選擇中立的實驗室檢測，不要去帶有商業(yè)性的檢測機構(gòu)。

5 您所了解的最新豬病檢測技術(shù)有哪些？請簡單介紹下這些新檢測技術(shù)。

左玉柱：豬病檢測技術(shù)現(xiàn)在較多，血清學檢測方面包括ELISA方法，免疫膠體金方法，正向（反向）間接血凝法等；病原檢測包括PCR（RT-PCR）法，熒光定量PCR法，熒光顯微鏡法，ELISA法；細菌學方面的分離培養(yǎng)和染色法。在眾多的方法中，檢測抗體使用較多的是ELISA方法，檢測病原（病毒）應(yīng)用較多的是PCR（RT-PCR）方法和熒光定量PCR方法；檢測細菌采用細菌的分離培養(yǎng)。

ELISA方法逐漸成為國際和國內(nèi)檢測抗體的常用方法，ELISA方法具備較多的優(yōu)點，比如檢測可以批量化操作，利用其對規(guī)?；i場進行檢測；檢測結(jié)果數(shù)字化，減少了人為判定結(jié)果的誤差；抗原的特異性高，使得檢測也具備高度的特異性，減少了其他抗體的干擾。PCR檢測方法，是基于病原基因水平的檢測技術(shù)，該方法具備特異，靈敏等優(yōu)點，不需要對病原進行分離鑒定，直接進行基因的特異擴增，從而根據(jù)特異性的條帶進行病原的定性。而熒光定量PCR方法，是在傳統(tǒng)PCR的方法上進一步采用發(fā)光技術(shù)使產(chǎn)物得以量化，從而不但可以進行定性檢測，而且可以對模板進行相對定量，了解感染的程度。由于該檢測需要使用熒光定量PCR儀，因此在一些基層檢測單位一般難以開展。

6 您認為未來豬病檢測技術(shù)應(yīng)朝哪個方向發(fā)展？

左玉柱：對于檢測技術(shù)的開發(fā)，許多研究機構(gòu)一直致力于簡便快捷的檢測技術(shù)，以其便于在基層推廣應(yīng)用。但這些便捷的檢測方法，盡管具備操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點，但檢測結(jié)果往往特異性差，因此目前一般只是養(yǎng)殖戶或小型養(yǎng)殖場使用。而隨著我們養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和升級，散戶會逐漸退出市場，規(guī)?；曫B(yǎng)程度會越來越高，這種情況下，對檢測結(jié)果的要求也會越來越嚴，因此今后豬病檢測技術(shù)，應(yīng)該朝著數(shù)據(jù)化，特異性，敏感性發(fā)展。檢測機構(gòu)也將越來越走向?qū)I(yè)化，不但擁有相應(yīng)的儀器設(shè)備，采用優(yōu)質(zhì)的試劑盒，而且具備一流的檢測技術(shù)人員和數(shù)據(jù)分析專家，這些對檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用都極為關(guān)鍵和重要。

焦連國：我國正從養(yǎng)豬大國向追求產(chǎn)品質(zhì)量的養(yǎng)豬強國邁進,未來一段時間我國養(yǎng)豬業(yè)面臨的最大挑戰(zhàn)仍是疫病。豬群健康是疫病防控之本，疫病的控制不能只停留在被動免疫和治療上，而是豬場需要建立一套因地制宜、切實可行的疫病預(yù)警與免疫監(jiān)測評價系統(tǒng)，從而避免僅僅注重治病與表面重視疫苗免疫而忽視了豬群本身的健康。未來豬病檢測技術(shù)是利用各種敏感性高與特異性強的檢測手段驗證豬體內(nèi)病原體是否存在的過程。它包括病理學、血清學、病原學、分子生物學診斷等一種或多種檢測方法。豬場通過相關(guān)檢測技術(shù)一方面可以確定病原和豬體之間的關(guān)系，明確疫病存在狀況，在一定的時間段對病原體的發(fā)生、發(fā)展、流行、分布及相關(guān)因素進行系統(tǒng)的調(diào)查與疫情監(jiān)測；另一方面通過免疫抗體的檢測結(jié)果以衡量免疫水平，進行免疫評估。未來檢測技術(shù)發(fā)展方向具有以下幾點：1）注重抗原檢測，與檢測抗原相關(guān)的技術(shù)得到發(fā)展與應(yīng)用；2）檢測技術(shù)更科學，利用最先進儀器與技術(shù)，在提高特異性的同時會更加注重提高敏感性；3）樣本檢測更加廣泛：血液、唾液、鼻拭子、乳汁、胎兒、精液、組織等樣本的檢測技術(shù)得到研究與應(yīng)用；4）行業(yè)檢測標準會統(tǒng)一：這有利于各實驗室技術(shù)交流與檢測水平評價。