養(yǎng)精膠囊通過調(diào)控StAR啟動子促進睪酮合成的研究*

孫大林陳廣輝金保方**蔡 濱鄧偉民

1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科（南京 210009）；2河北省中醫(yī)院男科

養(yǎng)精膠囊通過調(diào)控StAR啟動子促進睪酮合成的研究*

孫大林1陳廣輝2金保方1**蔡 濱1鄧偉民1

1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科（南京 210009）；2河北省中醫(yī)院男科

目的探討?zhàn)B精膠囊促進睪丸間質(zhì)（Leydig）細胞合成睪酮（T）功能的具體作用機制。方法在Leydig細胞（MLTC-1細胞系）中加入不同劑量養(yǎng)精膠囊提取液24 h后，用化學(xué)發(fā)光法檢測細胞上清T濃度；用免疫熒光顯微鏡分析類固醇快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）的表達情況；用RT-PCR及Western blot法測StAR mRNA及蛋白質(zhì)的表達；用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測StAR啟動子的活性。結(jié)果低、中、高劑量養(yǎng)精膠囊提取液作用24 h后，均可以促進MLTC-1細胞合成睪酮的功能；養(yǎng)精膠囊提取液可以促進MLTC-1細胞StAR免疫熒光的表達；養(yǎng)精膠囊提取液可以促進MLTC-1細胞StAR mRNA和蛋白質(zhì)的表達；養(yǎng)精膠囊提取液可以提高MLTC-1細胞中StAR啟動子的活性。結(jié)論養(yǎng)精膠囊能通過調(diào)控Leydig細胞中StAR啟動子的活性，促進StAR mRNA和蛋白的表達，進而提高睪酮合成的功能。

養(yǎng)精膠囊; 萊迪希細胞; 睪酮

睪酮（Testosterone，T）是人體內(nèi)主要的循環(huán)雄激素，不僅可以促進生精的啟動和精子的成熟，還與男性性功能、骨骼、肌肉、造血、心血管等多方面功能有重要聯(lián)系[1]。遲發(fā)性性腺機能減退、勃起功能障礙、性欲減退、男性不育癥都與T低下密切相關(guān)。然而，如果外源性補充T，不僅存在安全性問題，引起紅細胞增多，長時間服用還會抑制自身T的分泌。

前期的臨床研究表明[2-5]，養(yǎng)精膠囊可以提高男性不育癥的精子質(zhì)量，提高老年大鼠血清T水平，促進精囊腺的分泌，增加精液量，治療男性性功能障礙和性欲低下。基礎(chǔ)研究也表明[6,7]，養(yǎng)精膠囊能夠提高睪丸間質(zhì)（Leydig）細胞上清的T水平。

類固醇快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）調(diào)控膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運，是T生物合成的時限步驟和關(guān)鍵類固醇合成酶。為了進一步明確養(yǎng)精膠囊的作用機制，我們檢測其對StAR及其啟動子活性的影響。

資料和方法

一、材料和儀器

Leydig細胞（MLTC-l細胞系）由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗室崔毓桂研究員饋贈。胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），CO2培養(yǎng)箱（D-63450，Heraeus），倒置顯微鏡（TE2000-S，Nikon），western曝光機（上海天能技術(shù)有限公司），Applied Biosystems7700實時熒光定量PCR儀（美國Perkin Elmer公司），睪酮試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），StAR兔抗鼠單克隆抗體、β-action鼠抗鼠多克隆抗體、二抗、熒光二抗（美國Santa Cruz公司），Real-time PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司）。

二、藥材

養(yǎng)精膠囊（由炙淫羊藿、熟地黃、黃精、紫河車、當歸等組成）由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科生產(chǎn)提供[院臨（2004）第01002號]。養(yǎng)精膠囊水提物提取方法同參考文獻[6]。實驗時用RPMI-1640培養(yǎng)基制備成低、中、高3種濃度梯度，分別相當生藥量0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL。

三、養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞合成T的影響

6孔板內(nèi)接種2×105個/孔細胞數(shù)，細胞生長至對數(shù)期，分別加入低、中、高劑量養(yǎng)精膠囊提取液。加藥24h后，分別收集細胞上清液，離心（4℃，2 200×g）5min后，收集上清，-20℃保存，用化學(xué)發(fā)光法檢測T濃度。相同方法重復(fù)3次。

四、養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR免疫熒光的影響

24孔板內(nèi)接種1×104個/孔細胞數(shù)，細胞生長至對數(shù)期，分別加入低、中、高劑量養(yǎng)精膠囊提取液。加藥24h后，行細胞免疫熒光實驗，觀測StAR細胞免疫熒光表達的影響。

五、養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響

6孔板內(nèi)接種2×105個/孔細胞數(shù)，細胞生長至對數(shù)期，分別加入相應(yīng)劑量養(yǎng)精膠囊提取液。實驗組分為空白、低、中、高養(yǎng)精膠囊組及人絨毛膜促性腺激素（HCG）組共5組。24h后收集并處理細胞，用RTPCR及Western blot法測StAR mRNA及蛋白的表達。

六、養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR啟動子活性的影響

96孔板內(nèi)接種5 000個/孔細胞數(shù)，實驗分為空白組、1mg/mL養(yǎng)精膠囊組及HCG組。待細胞生長50%豐度時，用lipo3000將200 ng StAR啟動子質(zhì)粒和10 ng phRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞之中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。隨后吸除培養(yǎng)液，PBS洗3遍，加入相應(yīng)濃度養(yǎng)精膠囊提取液，6 h后行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐Ｐ∈骃tAR啟動子質(zhì)粒南京銳真生物有限公司制作。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）的格式表示。均數(shù)的比較用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、養(yǎng)精膠囊對T合成的影響

在加入養(yǎng)精膠囊提取液24 h后，低、中、高劑量組均可以顯著促進MLTC-1細胞合成睪酮的功能，與空白組有顯著差異（P＜0.05），并有劑量依賴性，具體見表1。

表1 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞睪酮合成的影響

表1 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞睪酮合成的影響

與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n 睪酮(ng/105細胞)空白組 3 3.20±0.45低劑量組 3 4.31±0.37△中劑量組 3 4.43±0.19△△高劑量組 3 5.87±0.61△△

二、養(yǎng)精膠囊對StAR免疫熒光的影響

免疫熒光實驗的結(jié)果表明，MLTC-1細胞加入養(yǎng)精膠囊提取液24 h后，StAR的表達量隨著養(yǎng)精膠囊濃度的提高而顯著增加，其中高劑量尤為顯著，具體見圖1。

圖1 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR免疫熒光強度表達的影響（×200）

三、養(yǎng)精膠囊對StAR mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響

在MLTC-1細胞中加入養(yǎng)精膠囊提取液24 h后，Real-time PCR的實驗結(jié)果表明，StAR mRNA的表達隨著劑量的增長而增強，呈劑量依賴性，特別是高劑量組可以顯著提高StAR mRNA的表達（P＜0.05）。HCG組作為陽性，與空白組相比較有顯著差異（P＜0.05），具體見表2。

表2 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR mRNA表達的影響

表2 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR mRNA表達的影響

與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n StAR/GAPDH mRNA

Western blot的實驗結(jié)果表明，養(yǎng)精膠囊提取液可以促進StAR蛋白質(zhì)的表達，并呈劑量依賴性，低、中、高養(yǎng)精膠囊組與空白組相比較，均有顯著差異（P均＜0.05）。養(yǎng)精膠囊組與陽性對照HCG組的作用相類似，具體見表3。

表3 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR 蛋白表達的影響

表3 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR 蛋白表達的影響

與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n StAR/GAPDH蛋白

四、養(yǎng)精膠囊對StAR啟動子活性的影響

細胞免疫熒光實驗的結(jié)果表明，高劑量養(yǎng)精膠囊提取液和HCG組作用24h后，可以顯著促進MLTC-1細胞中StAR啟動子表達的活性，與空白對照組相比較均有顯著差異（P＜0.05），具體見表4。

表4 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR啟動子活性的影響（

表4 養(yǎng)精膠囊提取液對MLTC-1細胞StAR啟動子活性的影響（

與空白組比較，△△P＜0.01

組別 n 相對倍數(shù)空白組 3 1.00±0.00養(yǎng)精膠囊組 3 3.26±0.27△△HCG組 3 5.24±0.27△△

討 論

Leydig細胞位于睪丸間質(zhì)內(nèi)，主要分泌睪酮和細胞因子等，在男性的性別分化和發(fā)育、第二性征和生殖道功能等方面均有重要作用。Leydig細胞胞漿內(nèi)含有大量連接成網(wǎng)狀的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、發(fā)達的高爾基復(fù)合體和管狀嵴線粒體。其中，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有豐富的合成類固醇的酶，高爾基復(fù)合體能在促性腺激素刺激后，囊泡發(fā)生膨脹，可能與類固醇的合成和分泌相關(guān)。細胞內(nèi)的線粒體除有板層狀嵴的線粒體之外，還有管狀嵴線粒體，線粒體內(nèi)富含類固醇生成酶。Leydig細胞中常見有脂滴，脂滴周圍含有可溶性酯酶。在酯酶的作用下，脂滴中的膽固醇酯可釋放出游離的膽固醇作為合成類固醇的原料。人體內(nèi)95%的T是由Leydig細胞合成和分泌的。Leydig細胞以膽固醇為原料，在類固醇激素合StAR調(diào)控下，膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)運到內(nèi)膜，然后在細胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶的作用下生成孕烯醇酮，孕烯醇酮又在一系列類固醇合成酶作用后合成為T[8]。

大量研究表明[9-11]，補腎法可以調(diào)控性腺軸，促進T的合成。養(yǎng)精膠囊是基于“腎藏精”理論，根據(jù)“陽化氣，陰成形”和“精血同源”理念，由補腎填精、養(yǎng)血活血為法而制成，成分包括熟地黃、淫羊藿、紫河車、黃精、沙苑子、煅牡蠣、黃芪、當歸、炙水蛭、王不留行、荔枝核11味中藥。方中熟地黃甘溫入腎，滋養(yǎng)腎陰，填精益髓；淫羊藿辛甘溫陽，補腎祛濕。兩者共為君藥，補腎填精、滋陰助陽。紫河車為血肉有情之品，擅補腎益精；黃精補脾益腎，補后天之精以養(yǎng)先天；沙苑子、煅牡蠣補腎固精，助“腎藏精”之功；黃芪與當歸組成當歸補血湯，取精血同源，養(yǎng)血補精功效，共為臣藥。炙水蛭、王不留行、荔枝核活血行氣，改善睪丸微循環(huán)，為佐藥。因此，我們把養(yǎng)精膠囊作為益腎填精法的代表方藥。前期的研究也表明[6]，養(yǎng)精膠囊能提高機體合成T的功能，但是其具體的作用機制并不清楚。

本研究基于前期的實驗基礎(chǔ)，進一步深入探索補腎方養(yǎng)精膠囊促T合成的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)精膠囊可以顯著促進Leydig細胞中StAR mRNA和蛋白的表達，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。分子實驗表明，養(yǎng)精膠囊還可以促進StAR啟動子的活性（P＜0.05）。因此，我們可以得出結(jié)論，養(yǎng)精膠囊是通過提高StAR啟動子的活性，促進StAR mRNA和蛋白質(zhì)的表達，進而激活T的合成。

小鼠和人的StAR基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全清楚，結(jié)構(gòu)基因分別為615kb、248kb，均具有7個外顯子和6個內(nèi)含子，外顯子長度一致；大鼠StAR基因有7個外顯子，外顯子7編碼整個215 kb的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）。StAR的啟動子受到多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控，包括GATA-4基因、類固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP）、類固醇合成因子-1（SF-1）、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）等[12]。由于中藥作用的多途徑和多靶點特性，可能通過以上一種或多種途徑發(fā)揮調(diào)控StAR啟動子活性的功能，這需要進一步研究。

根據(jù)本實驗結(jié)果，可以明確養(yǎng)精膠囊治療男性性功能障礙和不育癥的作用機制。鑒于遲發(fā)性性腺功能減退癥（LOH）主要是由血清T下降所致，發(fā)病的核心機制是睪丸Leydig的數(shù)量減少和功能減退[13]。這與養(yǎng)精膠囊的治療作用的機制相吻合。因此，我們推測養(yǎng)精膠囊用于治療LOH，可能同樣效果顯著。當然，這還有待于臨床實驗的證實。the role of androgen therapy. Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2007; 3(4): 338-344

2 薛宇陽, 金保方, 葉佳, 等. 養(yǎng)精膠囊對大鼠精囊分泌功能的影響研究. 吉林中醫(yī)藥 2011; 31(4): 375-376

3 金保方, 黃宇烽, 楊曉玉, 等. 養(yǎng)精膠囊治療弱精子癥的臨床觀察. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 2006; 22(5): 286-289

4 金保方, 黃宇烽, 夏欣一, 等. 養(yǎng)精膠囊聯(lián)合鋅硒寶對不育患者精子DNA完整性的影響. 中國男科學(xué)雜志 2006; 20(12): 45-49

5 金保方, 黃宇烽, 陸曉和. 養(yǎng)精膠囊治療男性性功能障礙的臨床觀察. 中華男科學(xué)雜志 2006; 12(3): 272-274, 276

6 孫大林, 崔毓桂, 金保方, 等. 養(yǎng)精膠囊對Leydig細胞增殖、凋亡和睪酮合成的影響. 中國男科學(xué)雜志 2012; 26(3): 15-18

7 Sun D, Cui Y, Jin B, et al. Effects of the Yangjing Capsule Extract on Steroidogenesis and Apoptosis in Mouse Leydig Cells. Evid Based Complement Alternat Med 2012; 2012: 985457

8 游海燕. Leydig細胞睪酮合成的調(diào)節(jié). 中國男科學(xué)雜志2003; 17(2): 138-141

9 朱泉, 江魏. 中醫(yī)補腎法提高男性血清睪酮水平的研究-基于7個臨床對照試驗的Meta分析. 醫(yī)學(xué)信息 2005; 18(9): 1153-1155

10 錢風雷, 曾繁輝, 馮煒權(quán), 等. 補腎中藥對運動大鼠下丘腦-垂體-性腺軸功能的調(diào)節(jié)作用. 中國運動醫(yī)學(xué)雜志2005; 24(5): 571-575

11 張云如, 廖文君, 華瑞成. 補腎中藥對老年腎虛征下丘腦-垂體-性腺軸作用的研究. 實用老年醫(yī)學(xué) 1997; 11(1): 94-96

12 王草葉, 王玉邦. 類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白研究進展. 中華男科學(xué)雜志 2006; 12(8): 733-736

13 孫大林, 金保方. 中醫(yī)藥在男性生殖內(nèi)分泌疾病中的應(yīng)用. 國際生殖健康/計劃生育雜志 2014; 33(6): 458-461

（2016-10-15收稿）

1 Richmond EJ, Rogol AD. Male pubertal development and

Study on Yangjing Capsule promoting testosterone synthesis through regulating StAR promoter

Sun Dalin1, Chen Guanghui2, Jin Baofang1**, Cai Bin1, Deng Weimin1
1. Andrology Department of Integrative Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China;
2. Department of Andrology, Hebei Province Hospital of Traditional Chinese Medicine

Jin Baofang, E-mail: hexiking@126.com

ObjectiveTo explore the mechanism of Yangjing Capsule increasing the synthesis of testosterone in Leydig cells.MethodsLeydig cells (MLTC-1 cell line) were incubated for 24 h with different dose of Yangjing Capsule extract. T in culture supernatant was determined using chemiluminescence. The expression of StAR was detected by immunofuorescence microscopy. RT-PCR and western blot were used to detect the expression of StAR mRNA and protein. The activity of StAR promoter was detected by double luciferase reporter assay.ResultsAfter 24 h, the low, medium and high dose of Yangjing capsule extract all promoted the synthesis of testosterone in MLTC-1 cells. The Yangjing Capsule extract forced the immunofuorescence expression of StAR, and also upregulated the expression of StAR mRNA and protein in MLTC-1 cells. Simultaneously, Yangjing Capsule extract enhanced the activity of StAR promoter in MLTC-1 cells.ConclusionYangjing Capsule can strengthen the activity of StAR promoter and increase the expression of StAR in Leydig cells, and ultimately improve the function of testosterone synthesis.

Yangjing Capsule; Leydig cells; testosterone

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.005

R 698.2

資助：國家自然科學(xué)青年基金（No. 81403402）；國家自然科學(xué)基金（No. 81273760；81473678）

**通訊作者，E-mail: hexiking@126.com；Tel: 025-83272219