田基黃總黃酮抗膽管結(jié)扎所致大鼠肝纖維化的研究*

王永剛，譚 沛，李沛波，徐 冰，蘇薇薇，陳周全,彭 維

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心∥廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510275；2.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳518110)

田基黃總黃酮抗膽管結(jié)扎所致大鼠肝纖維化的研究*

王永剛1，譚 沛2，李沛波1，徐 冰2，蘇薇薇1，陳周全2,彭 維1

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心∥廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510275；2.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳518110)

采用膽總管結(jié)扎法制備肝纖維化大鼠模型，對(duì)田基黃總黃酮抗大鼠肝纖維化作用進(jìn)行了研究。從造模首日起，灌胃給藥，每天給予田基黃總黃酮(9、18、36 mg/kg) 1次，4周后，測(cè)定血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、TNF-α水平及肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)的含量及MMP-1、TIMP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，田基黃總黃酮能顯著降低膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、PCⅢ、HA、LN的水平、肝組織中Hyp的含量和TIMP-1蛋白的表達(dá)，說(shuō)明田基黃總黃酮具有良好的抗膽汁性肝纖維化的作用。此外，田基黃總黃酮也能提高肝組織SOD、GSH-Px的活性，降低肝組織MDA及血清中TNF-α的含量。田基黃總黃酮可抑制膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的形成，其抗肝纖維化作用可能與其抗氧化作用及抗TNF-α的分泌有關(guān)。

田基黃總黃酮；肝纖維化；膽總管結(jié)扎

肝纖維化是機(jī)體對(duì)物理、化學(xué)以及生物方面刺激引起的各種慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，也是多種慢性肝病的共有病理變化[1]，其中 25%～40%最終會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[2]，研究肝纖維化的形成機(jī)制及防治方法成為國(guó)內(nèi)外生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

田基黃始載于《生草藥性備要》，為藤黃科植物地耳草HypericumjaponicumThunb. 的干燥全草，民間多用其治療急、慢性肝炎。田基黃具有保肝、抑菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤和防治心血管系統(tǒng)疾病等多種藥理學(xué)作用[3-4]。田基黃含內(nèi)酯、香豆素、酚類、蒽醌、黃酮類、維生素 A 樣物質(zhì)及維生素 B1、B2、間環(huán)己三醇衍生物、色原酮苷衍生物、雙苯吡酮類等成分[5]。田基黃總黃酮是我們從田基黃中提取的有效部位(黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于50%)[6]，目前正在按中藥五類新藥進(jìn)行開發(fā)。筆者對(duì)田基黃總黃酮抗膽管結(jié)扎所致大鼠肝纖維化進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑 田基黃總黃酮(黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.5%)：系本課題組從田基黃(購(gòu)自廣州清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廖文波教授鑒定為藤黃科植物地耳草HypericumjaponicumThunb. 的干燥全草)中提取分離得到，為水煎煮后乙酸乙酯萃取得到；水飛薊素膠囊：德國(guó)馬博士大藥廠生產(chǎn)；TBIL、DBIL、ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、Hyp、GSH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；HA、LN、PCⅢ放免試劑盒購(gòu)自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心；MMP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海凱博生化試劑有限公司；TIMP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.1.2 動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，180～220 g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

1.2 方法

取SD大鼠，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照水飛薊素組(50 mg/kg)；田基黃總黃酮低劑量組(9 mg/kg)、中劑量組(18 mg/kg)、高劑量組(36 mg/kg)，每組10只。參照文獻(xiàn)[7]的方法造模，各組大鼠按4 mL/kg的劑量腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，暴露肝臟下膽管，結(jié)扎肝臟與膽管交界處和膽管與胰腺交界處，將兩處中間的膽管剪除以造成完全膽管阻塞大鼠模型；正常對(duì)照組不作手術(shù)處理。從造模當(dāng)天起，田基黃總黃酮低、中、高劑量組每天分別按劑量按每100 g體質(zhì)量1 mL灌胃給予田基黃總黃酮1次，連續(xù)28 d，水飛薊素組給予水飛薊素。末次給藥1 h后，各組大鼠用乙醚輕度麻醉，心臟采血，取血清采用試劑盒檢測(cè)TBIL、DBIL、ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、TNF-α水平；然后打開腹腔迅速取出肝組織并在生理鹽水下清洗，勻漿后采用試劑盒檢測(cè)SOD、MDA、GSH-Px、Hyp，采用ELISA法檢測(cè)MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示，采用的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)法，P<0.05 表示差異具有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 田基黃總黃酮對(duì)血清中肝功能指標(biāo)TBIL、DBIL、ALT、AST的影響

由表1可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST水平均顯著升高(P<0.01)，提示該模型大鼠的膽道梗阻明顯，且肝細(xì)胞明顯破壞。田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST的水平與模型對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。說(shuō)明田基黃總黃酮能降低膽總管結(jié)扎所致肝纖維化大鼠的黃疸水平及肝損傷程度。

表1 田基黃總黃酮對(duì)血清中肝功能指標(biāo)TBIL、DBIL、ALT、AST的影

1) 與正常對(duì)照組比較：##P<0.01；與模型對(duì)照組比較：*P<0.05；**P<0.01

3.2 田基黃總黃酮對(duì)肝纖維化指標(biāo)PCⅢ、HA、LN、Hyp的影響

由表2可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中PCⅢ、HA、LN含量和肝組織中Hyp含量均顯著升高(P<0.01)，提示該模型大鼠具有明顯的肝纖維化病理改變。田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠血清中PCⅢ、HA、LN含量和肝組織中Hyp含量與模型對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)，提示田基黃總黃酮對(duì)膽總管結(jié)扎所致大鼠肝纖維化具有抑制作用。

表2 田基黃總黃酮對(duì)肝纖維化指標(biāo)PCⅢ、HA、LN、Hyp的影

1) 與正常對(duì)照組比較：##P<0.01；與模型對(duì)照組比較：*P<0.05；**P<0.01

3.3 田基黃總黃酮對(duì)肝組織 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α的影響

由表3可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性顯著降低(P< 0.01)，而MDA含量明顯提高(P< 0.01)，提示肝纖維化模型大鼠肝臟的抗氧化水平顯著降低，氧化損傷明顯。此外，可通過(guò)多種機(jī)制參與肝纖維化過(guò)程調(diào)控的重要細(xì)胞因子TNF-α也顯著升高(P< 0.01)。而田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠肝組織 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α與模型對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。說(shuō)明田基黃總黃酮能提高肝纖維化模型大鼠肝臟的抗氧化能力，顯著降低肝臟的氧化損傷，也能抑制TNF-α的分泌，從而抑制肝纖維化的發(fā)展。

3.4 田基黃總黃酮對(duì)肝組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

由表4可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)顯著增加(P< 0.01)，而肝組織MMP-1無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示肝纖維化模型大鼠肝臟的TIMP-1蛋白表達(dá)增加，肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)分解減少。而田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)與模型對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。

說(shuō)明田基黃總黃酮能抑制肝纖維化模型大鼠肝臟的TIMP-1蛋白表達(dá)，顯著促進(jìn)肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的分解。

表3 田基黃總黃酮對(duì)肝組織 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α的影

1) 與正常對(duì)照組比較：##P<0.01；與模型對(duì)照組比較：*P<0.05；**P<0.01

組別MMP-1(ng·g-1)TIMP-1(ng·g-1)正常對(duì)照組19 02±4 32210 03±31 56模型對(duì)照組20 99±3 78699 64±121 98##水飛薊素組18 67±4 12336 89±90 12??田基黃總黃酮低劑量組20 00±3 21420 98±76 89??田基黃總黃酮中劑量組17 98±4 65356 98±52 10??田基黃總黃酮高劑量組20 67±2 09319 77±51 28??

1) 與正常對(duì)照組比較：##P<0.01；與模型對(duì)照組比較：*P<0.05；**P<0.01

4 討 論

肝纖維化是是多種慢性肝病的共有病理變化。在各種致病因素作用下，靜止期的肝星狀細(xì)胞(HSC)被激活并增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，其細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成和分泌上調(diào)，而降解減少，最終導(dǎo)致ECM積聚而發(fā)生肝纖維化乃至肝硬化[8]。目前，肝纖維化的治療主要是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、減少 ECM 的增生和沉積、促進(jìn) ECM 降解以及改善微循環(huán)和代謝障礙、減少并發(fā)癥等多個(gè)環(huán)節(jié)[9]。氧化應(yīng)激是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。多種致肝損傷的因素往往伴隨氧化水平的升高或者抗氧化能力的下降，氧化應(yīng)激與肝纖維化病理機(jī)制之間的關(guān)系受到越來(lái)越多的重視[10]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，田基黃總黃酮能顯著降低膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、PCⅢ、HA、LN的水平、肝組織中Hyp的含量和MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)，說(shuō)明田基黃總黃酮具有良好的抗膽汁性肝纖維化的作用。此外，田基黃總黃酮也能提高肝組織SOD、GSH-Px的活性，降低肝組織MDA及血清中TNF-α的含量，提示田基黃總黃酮抗肝纖維化作用可能與其抗氧化作用及抑制TNF-α的分泌有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)為田基黃總黃酮抗肝纖維化的臨床試驗(yàn)提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們前期研究表明田基黃中槲皮苷、異槲皮苷和田基黃苷三個(gè)化合物具有保肝退黃作用[11]，田基黃總黃酮抗肝纖維化作用是否與此類化合物有關(guān)，還需要進(jìn)一步深入研究。

[1] ELLIS E L, MANN D A. Clinical evidence for the regression of liver fibrosis [J]. Journal of Hepatology, 2012, 56(5):1171-1180.

[2] 孔維涵. 單味中藥抗肝纖維化作用研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué), 2011, 23(2):68-68.

[3] 廖仰平, 賴岳曉, 葉建新, 等. 田基黃及其制劑的研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2012, 18(3):109-111.

[4] 林慧，梅全喜，孔祥廉，等. 田基黃在肝病中的臨床應(yīng)用及藥理作用研究概況[J]. 今日藥學(xué), 2011, 21(9): 550-552.

[5] 毛羽，王沖，杜奕欣，等. 田基黃主要成分抗缺氧活性的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2012, 23(5): 1111-1112.

[6] WANG Ning, LI Peibo, WANG Yonggang, et al. Hepatoprotective effect ofHypericumjaponicumextract and its fractions [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 116(1): 1-6.

[7] 孫俠，黃小瓊，鐘海潮，等. 四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎致SD大鼠肝纖維化病理學(xué)比較 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 22(3): 36-39.

[8] WELLS R G. Mechanisms of liver fibrosis: new insights into an old problem [J]. Drug Discovery Today: Disease Mechanisms,2006, 3(4):489-495.

[9] 梁健，周小瀟，鄧鑫，等. 肝纖維化的臨床研究進(jìn)展[J]. 河北中醫(yī), 2012, 34(2): 294-296.

[10] 李俊峰，鄭素軍，段鐘平. 氧化應(yīng)激在肝纖維化中的作用及治療對(duì)策[J]. 世界華人消化雜志, 2013, 21(17): 1573-1578.

[11] 李沛波, 王永剛, 吳釘紅, 等. 田基黃中三個(gè)黃酮類化合物保肝退黃作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2007, 28(1):40-43.

Therapeutic effects of total flavonoids ofHypericumjaponicumagainst liver fibrosis induced by bile duct ligation in rats

WANGYonggang1,TANPei2,LIPeibo,XUBing2,SUWeiwei,CHENZhouquan2,PENGWei

(1.Guangzhou Quality R&D Center of Traditional Chinese Medicine, State Key Laboratory of Biocontrol and Guangdong Provinceral Key Laboratory of Plant Resources,School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China;2.China Resources Sanjiu Medical & Pharmaceutical Limited Company, Shenzhen 518110, China)

The purpose of this study was to investigate the therapeutic effects of total flavonoids ofHypericumjaponicumagainst liver fibrosis induced by bile duct ligation in rats. Liver fibrosis model was established by bile duct ligation. After bile duct ligation, the treatment groups orally received total flavonoids ofHypericumjaponicum(9,18,36 mg·kg-1·d-1) daily for 4 weeks. Then, rats were all executed. Serum and liver tissues were obtained. Serum levels of TBIL, DBIL, ALT, AST, HA, LN, PCⅢ, TNF-α and the activities of SOD, GSH-Px and the contents of MDA, Hyp, MMP-1 and TIMP-1 in liver tissues were detected. Results showed that total flavonoids ofHypericumjaponicumcould significantly alleviate liver fibrosis, as indicated by decreasing levels of TBIL, DBIL, ALT, AST, HA, LN, PCⅢ, TNF-α, Hyp and TIMP-1. Moreover, total flavonoids ofHypericumjaponicumcould effectively enhance the activities of SOD, GSH-Px and decrease the content of MDA. Our results show that total flavonoids ofHypericumjaponicumis effective in attenuating liver fibrosis induced by bile duct ligation in rats, at least partly, via enhancing the activation of antioxidant enzymes and inhibiting release of TNF-α.

total flavonoids ofHypericumjaponicum; liver fibrosis; bile duct ligation

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.01.002

2015-02-09

廣東省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012A080202011);廣州開發(fā)區(qū)科技領(lǐng)軍人才資助項(xiàng)目(2015p-158)

王永剛(1974年生)，男；研究方向：天然產(chǎn)物(嶺南植物)藥物應(yīng)用研究；E-mail:awad7476@163.com

R961

A

0529-6579(2016)01-0012-04