腦爾康對實驗性AD模型大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸含量的影響*

侯吉星　權乾坤　李　璽△　西安市精神衛(wèi)生中心(西安 710061)

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腦爾康對實驗性AD模型大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸含量的影響*

侯吉星權乾坤▲李璽△▲西安市精神衛(wèi)生中心(西安 710061)

摘要目的：觀察中藥腦爾康對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChaT)、興奮性氨基酸含量的影響及可能機制。方法：雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、多奈哌齊組、腦爾康組。采用大鼠雙側海馬一次性注射Aβ1-42制作AD模型，對照組注射等劑量生理鹽水。造模成功后第3天開始空白組和模型組給予生理鹽水ig(0.5mL·d-1)；多奈哌齊組及腦爾康組分別給予相應藥物ig (14.3 mL· d-1)，均每天一次。4周后，用Morris水迷宮法進行行為學測試，取材，免疫組化法觀察ChaT表達，高效液相色譜分析法測定各組大鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量。結果：①與模型組比較，多奈哌齊組及腦爾康組大鼠腦內(nèi)ChaT表達明顯增多(P<0.01)；②與模型組比較，多奈哌齊組及腦爾康組興奮性氨基酸水平有有明顯的下降(P<0.01)，且二者之間的結果無明顯差異。結論：腦爾康可能通過對ChaT表達的保護作用以及下調(diào)AD模型大鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量解除興奮性氨基酸的毒性作用，達到防治AD的目的。

主題詞腦爾康阿爾茨海默病動物，實驗 大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機制仍未完全闡明。目前已經(jīng)提出了膽堿能學說、谷氨酸能學說等假說。大量研究證明，興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(excitatory amino acids，EAA)含量的改變與神經(jīng)退行性病變、學習記憶的形成密切相關[1]。中藥腦爾康已在臨床應用多年，對老年癡呆患者有較好的改善作用。本次研究通過構建AD大鼠模型，應用腦爾康進行早期干預，通過觀察行為學、膽堿能系統(tǒng)有關的酶學變化以及興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)等多方面探討腦爾康抗癡呆的作用機制。

1材料

1.1動物健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(260±10)g，西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號SCXH(陜)2011-004。試驗期間均以固體平衡飼料，自由飲水，在室溫(22±2)℃、濕度(50±5)%的條件下飼養(yǎng)。

1.2主要藥品與試劑中藥腦爾康為院內(nèi)制劑(陜衛(wèi)藥制劑注字920138)，全方由人參、黃芪、川芎、丹參、益智仁、生地、菖蒲、冰片組成，由西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中藥房提供，按傳統(tǒng)方法水煎，制成每毫升含生藥1 g·mL-1。抗ChaT抗體(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，批號121015)；SABC免疫組化試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司產(chǎn)品，批號120913)；谷氨酸、天冬氨酸標準品(美國Sigma公司)；色譜純乙腈(德國MERCK公司)；鹽酸多奈哌齊片(衛(wèi)材蘇州制藥有限公司，批號111013A)。

1.3主要儀器Morris水迷宮儀、數(shù)據(jù)自動采集機分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院動物所)；臺式離心機(上海夏普電器有限公司產(chǎn)品，型號：WP850A)；電動勻漿機(德國Heidolph公司，型號DIAX900)；高效液相色譜分析儀(日本島津公司，型號LC-10AD)；腦立體定位儀(日本太陽株式會社，型號SN-3)。

2方法

2.1動物AD模型制備選擇大鼠雙側海馬區(qū)一次性注射Aβ1-42制備AD模型[2]。將Aβ1-42溶于滅菌生理鹽水中，稀釋為10μg·μL-1，密封后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育7 d，使其成為具有毒性的凝聚態(tài)，4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠?jīng)10%水合氯醛(3.5mL·kg-1)腹腔注射麻醉，固定于大鼠立體定位儀，參照大鼠腦立體定位圖譜，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自硬腦膜垂直進針2.8 mm，每側海馬注射2μL Aβ1-42，緩慢注射5min，留針5 min，緩慢起針?？瞻捉M大鼠注射等體積生理鹽水。術后局部局部消毒后縫合頭皮，肌肉注射青霉素預防感染，連續(xù)3d。

2.2藥物干預造模成功后，大鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組、腦爾康組。依據(jù)劑量估換計算公式，多奈哌齊組、腦爾康組每天分別給予相應藥物ig(14.3g·kg-1·d-1)；空白組和模型組每天給生理鹽水ig(0.5 mL·d-1)，共28 d。

2.3行為學測試采用Morris水迷宮法檢測大鼠學習記憶成績[3]。

2.4免疫組化檢測ChaT表達水平完成行為學測試后，立即處死大鼠，取腦，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，石蠟切片機切片，切片厚度4μm，每張切片含皮層、海馬、齒狀回，每只小鼠取5張切片，4張進行免疫組化染色，一張HE染色。免疫組織化學法(SABC法)分別檢測各組大鼠海馬區(qū)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChaT)陽性表達情況。用Image pro plus圖像分析軟件測量ChaT的光密度(IOD)值。

2.5高效液相色譜分析法測定各組小鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量大鼠腦組織樣品的處理：腦組織稱重,以1∶10 比例加入0.14 mol·L-1高氯酸,冰浴下充分勻漿,沉淀30 min,離心15 min,取上清液,加0.2mol·L-1KHCO3,混勻后于4℃離心5 min,取上清液,分裝,于- 70℃保存待測。對照品溶液的制備：精密稱取谷氨酸、天冬氨酸對照品10 mg，置于10mL容量瓶中，加0.5 mol·L-1碳酸氫鈉(ph=9.0)溶液1mL，加1% 2,4二硝基氟苯乙腈溶液1mL，置60℃水浴中加熱1 h。加乙腈稀釋至10mL，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：取海馬組織，稱重，加入生理鹽水2mL勻漿，4000r離心10min，取上清液1mL，加入乙腈1mL沉淀，4000r離心10min，取上清液600uL置1.5 mLEP管中，加0.5mol·L-1碳酸氫鈉(ph=9.0)溶液300uL，1%2，4二硝基氟苯乙腈溶液300uL，置60℃水浴中加熱1h，作為供試品溶液。色譜條件：色譜柱：Kromasil C18柱。流動相：乙腈，醋酸鹽緩沖液(6%醋酸鈉水溶液：乙腈=70：30)。流速1mL·min-1，紫外檢測，檢測波長：360nm；柱溫：30℃。采用梯度洗脫法，梯度洗脫條件：0min～乙腈：緩沖鹽=0∶100；0-12min～乙腈：緩沖鹽=12∶88；12-14min～乙腈：緩沖鹽=20∶80；14-20min～乙腈：緩沖鹽=40∶60；20-30min～乙腈：緩沖鹽=60∶40；30-32min～乙腈：緩沖鹽=70∶30；32-37min～乙腈：緩沖鹽=0∶100；37-40min～乙腈：緩沖鹽=0∶100，分別取對照品、供試品10uL進樣、測定。

計算方法：外標法。

3結果

3.1腦爾康對AD模型大鼠ChaT表達的影響乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶ChaT免疫組化染色結果顯示：空白組大鼠皮層區(qū)、海馬CA1、CA3及齒狀回門區(qū)部位可見大量ChaT陽性神經(jīng)元，免疫反應陽性產(chǎn)物較多，染色較深。①模型組在注射Aβ1-42后，海馬CA1、CA3及齒狀回門區(qū)ChaT免疫表達顯著下降，染色變淺，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)。②與模型組比較，多奈哌齊組和腦爾康組海馬CA1、CA3及齒狀回門區(qū)ChaT免疫陽表達較模型組升高(P<0.01)，且二者之間無明顯差異(P >0.05)。

表1　腦爾康及對AD模型大鼠大腦皮層及海馬內(nèi)ChaT免疫陽性表達的變化(IOD)

注：與空白組比較▲P<0.01；與模型組比較◆P<0.01

3.2腦爾康及對AD模型大鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量的影響谷氨酸(glutamate，Glu)與天冬氨酸(aspartate，Asp)是腦組織內(nèi)含量較高的兩種氨基酸，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息專遞，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸主要分布在大腦皮層、小腦、海馬及紋狀體；天冬氨酸則主要分布小腦、丘腦。用高效液相色譜法測定各組大鼠海馬內(nèi)Glu和Asp，結果顯示：①模型組Glu和Asp含量高于空白族，有顯著性差異(P<0.01)；②與模型組比較，多奈哌齊組、腦爾康組Glu含量明顯減少(P<0.01)；且二組Glu含量無明顯差異(P>0.05)。

表2　腦爾康對AD模型大鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量的影響

注：與空白組比較▲P<0.01；與模型組比較◆P<0.01

4討論膽堿能系統(tǒng)受損在AD發(fā)病機制中占用重要地位，各種原因引起的基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷以及與此相關的皮層及海馬等腦區(qū)的膽堿能神經(jīng)傳遞受損，在AD患者記憶及認知功能損傷過程中起重要作用。對大多數(shù)AD患者的腦研究顯示，在許多皮層區(qū)域ChaT活性與這些皮層區(qū)域老年斑的密度呈現(xiàn)不恒定的顯著負相關關系，本研究造模后，經(jīng)水迷宮實驗確定的AD大鼠，發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)神經(jīng)元排列紊亂、不規(guī)則，部分神經(jīng)元脫失；免疫組化染色顯示大腦皮層和海馬部位ChaT免疫陽性表達顯著降低。此病理改變符合對AD患者腦的病理檢查所見，較好地模擬了AD患者的特征性病變，是本實驗進行AD病因病機以及治療AD有效手段探索的重要依據(jù)。

在AD的發(fā)病機制中，谷氨酸能假說越來越受到重視。相關研究證實[4]Glu及其受體參與神經(jīng)元信息傳遞，與學習記憶功能的形成密切相關，其作為神經(jīng)樞及大腦皮質(zhì)的補劑，主要存在于神經(jīng)末梢谷氨酸囊泡內(nèi)，對于興奮傳遞及神經(jīng)細胞的保護都具有特殊的重要意義。我們的研究結果顯示，AD大鼠海馬組織的Glu和Asp含量顯著高于空白組，提示模型組大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸代謝紊亂。與模型組比較，腦爾康組、多奈哌齊組Glu含量均顯著低于模型組，可見腦爾康可降低AD大鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量，使AD大鼠海馬內(nèi)興奮性氨基酸含量趨近于正?？瞻捉M。提示 AD 模型大鼠海馬區(qū) Glu 大量釋放并堆積于突觸間隙，使谷氨酸受體過度興奮激活，從而引起一系列以神經(jīng)細胞或其他組織細胞死亡為終結的病理生理變化，可能是Aβ1-42所致海馬神經(jīng)元損傷造成學習記憶障礙的機制之一，腦爾康能夠在一定程度上降低Glu水平從而起到抗癡呆作用。

參考文獻

[1]CoyleJ,Puttfarcken P.Oxidative stress,glutamate and neurodegenerative disorders.Science 1993,262：689-694.

[2]E.Hare,D.T.Weldon,P.W.Mantyh,et al.Dalayed behavioral effects following intrahippocampal injection of aggregated a beta(1-42).Brain Research,1999,815(1):1-10.

[3]葉翠飛，張麗，艾厚喜，等．2種水迷宮實驗對擬癡呆模型動物學習記憶功能測試的比較[J]．中國行為醫(yī)學科學，2004,13(3)：252.

[4]呂高萍． 阿爾茨海默病中西醫(yī)早期診斷的研究進展[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2012，08：2142．

(收稿2015-03-11；修回2015-04-19)

【中圖分類號】R749.16

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.01.064

*陜西省科技攻關計劃項目[2007K16-07(5)]

▲西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院(西安710004)

△通訊作者