高血壓腦出血患者外周血單個核細(xì)胞中P38 MAPK的表達(dá)

李彥明　姜　紅　徐勝東　劉　娟

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏　銀川　750004)

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高血壓腦出血患者外周血單個核細(xì)胞中P38 MAPK的表達(dá)

李彥明姜紅徐勝東1劉娟

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004)

〔摘要〕目的探討P38 MAPK在高血壓腦出血外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法選擇寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科確診的高血壓腦出血患者50例作為實驗組，在發(fā)病后1、3、7、14 d分別抽取靜脈血，用PCR熒光檢測法測定P38 MAPK mRNA的表達(dá)，同時ELISA檢測外周血IL-6/8含量，與正常體檢者(25例，對照組)對比，并分析表達(dá)意義。結(jié)果實驗組患者外周血單個核細(xì)胞核內(nèi)P38 MAPK mRNA表達(dá)和血清IL-6/8含量均高于正常體檢者(P<0.05)，病情越重，P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量越高，在腦出血后3 d時P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量達(dá)到高峰，此后表現(xiàn)為下降趨勢，P38MAPK mRNA及IL-6/8含量之間呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論P38 MAPK、IL-6、IL-8參與了高血壓腦出血的炎癥反應(yīng)，與腦出血后腦組織損傷機制相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕P38絲裂素活化蛋白激酶；高血壓；腦出血；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-8

細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)與出血性腦血管病的組織損傷關(guān)系密切，如白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子等〔1〕。本研究通過評價急性高血壓腦出血患者外周血單個核細(xì)胞P38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)及IL-6、IL-8表達(dá)情況，分析三者之間相關(guān)性，進(jìn)一步探討其對高血壓腦出血炎性損傷的作用。

1資料與方法

1.1研究對象采集2014年3月至2015年2月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科收治的高血壓腦出血患者50例，男29例，女21例，年齡36～68〔平均(54.2±10.2)〕歲。病程1～24 h，平均(11.2±3.2)h，按Glasgow-pittsberg昏迷評分，分為輕癥(26～35分)15例，中癥(21～25分)16例，重癥(14～20分)19例。在門診隨機挑選健康體檢者25例作為對照組，男13例，女12例，年齡38～69〔年齡(53.7±10.1)〕歲。納入標(biāo)準(zhǔn)〔2〕：年齡小于70歲，為首次出血并經(jīng)CT和腦血管造影證實，且符合第四屆全國腦血管病會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦動脈瘤破裂出血者；外傷性出血；顱內(nèi)腫瘤出血；腦疝晚期(雙側(cè)瞳孔散大)者；合并急慢性炎癥以及嚴(yán)重肝腎疾病或其他原因致出、凝血指標(biāo)異常者。

1.2主要試劑及儀器人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物公司，中國)，熒光檢測試劑：GoTaq?qPCR(Promega公司，美國)，P38 MAPK及內(nèi)參照磷酸-3-甘油醛脫氫酶(GAPDH)擴(kuò)增引物(Biosail公司，加拿大)，低溫高速離心機5417R(Eppendorf公司，美國)，7900 RT-PCR儀(ABI公司，美國)，IL-6/IL-8試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，中國)；酶標(biāo)儀(Benchmark，德國)。

1.3方法

1.3.1引物的設(shè)計P38 MAPK及內(nèi)參GAPDH的引物由加拿大的Biosail公司設(shè)計并合成，P38 MAPK上游：5′-AAGTTCCTGTCCACATTGCC-3′，下游：5′-TGGATTCAGTGTCAAGCTGC-3′，產(chǎn)物長度398 bp；GAPDH上游：5′-TCAACAGCGACACCCACTCC-3′，下游：5′-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3′，產(chǎn)物長度126 bp。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測采集高血壓腦出血患者發(fā)病后1、3、7、14 d的外周靜脈血3～5 ml，肝素鈉抗凝處理，分離出外周血單個核細(xì)胞。常規(guī)用Trizol提取各組外周血單個核細(xì)胞總RNA，按說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用 GoTaq?qPCR進(jìn)行熒光檢測，整個PCR反應(yīng)體系如下：2倍的GoTaq?qPCR Master Mix、樣本cDNA 0.2 μg、雙蒸水，建立總體積40 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：96℃ 2 min，96℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s，連續(xù)40個循環(huán)?！癈t值倒數(shù)” 法計算樣本cDNA相對含量，即p38 MAPK cDNA相對含量= p38 MAPK Ct值倒數(shù)/GAPDH Ct值倒數(shù)。

1.3.3外周血IL-6、IL-8的檢測采集高血壓腦出血患者發(fā)病后1、3、7、14 d的外周靜脈血3～5 ml，運用ELISA法檢查，步驟參照試劑使用說明進(jìn)行外周血IL-6、IL-8的檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗，相關(guān)性采用Spearman分析。

2結(jié)果

見表1，表2。腦出血患者外周血單個核細(xì)胞核內(nèi)P38 MAPK mRNA表達(dá)與IL-6、IL-8含量高于對照組(P<0.05)，在腦出血后3 d時P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量達(dá)到高峰，此后表現(xiàn)為下降趨勢。隨著病情的加重，P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量越高(P<0.05)。P38 MAPK mRNA表達(dá)量和IL-6呈正相關(guān)(r=0.79，P<0.05)；P38 MAPK mRNA表達(dá)量和IL-8的濃度呈正相關(guān)(r=0.84，P<0.05)；血清IL-6濃度和IL-8的濃度呈正相關(guān)(r=0.85，P<0.05)。

表1　實驗組與對照組P38 MAPK mRNA表達(dá)與

與對照組比較：1)P<0.05

表2　不同病情P38 MAPK mRNA表達(dá)與IL-6、IL-8

與對照組比較：1)P<0.05；與輕癥比較：2)P<0.05

3討論

高血壓腦出血后的損傷機制復(fù)雜，血腫的占位效應(yīng)以及血腫對腦組織的直接破壞作用影響著預(yù)后。腦出血后多種血液成分被激活，其中包括重要的IL等炎性細(xì)胞因子，直接參與出血后損傷的炎性反應(yīng)〔3〕。

MAPKs是胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要通路，是多個信號傳遞的交點和共同通路，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布廣泛，將細(xì)胞外刺激信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，影響著細(xì)胞增殖、分化和應(yīng)激調(diào)控〔4〕。三級激酶級聯(lián)傳遞信號，即MKKK、MKK、MAPK，是該家族信號傳導(dǎo)的共同特點。P38是MAPKs家族中重要一員，具有α，β，δ和γ四個亞型，其中p38α與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。近些年，P38對炎性反應(yīng)介入的發(fā)病影響的研究較為廣泛，研究顯示其具有細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要作用，在生物學(xué)刺激下經(jīng)過磷酸化等激活，在細(xì)胞核等重要部位發(fā)揮作用〔5〕。陸兆雙等〔6〕研究證明p38MAPK通過介導(dǎo)IL-6和IL-8的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子合成。

本研究結(jié)果提示P38 MAPK mRNA及IL-6/8不僅參與了腦出血后的炎性反應(yīng)的發(fā)生，而且對炎性反應(yīng)的發(fā)展起到促進(jìn)作用。在腦出血后3 d時P38 MAPK mRNA及IL-6/8含量達(dá)到高峰，此后表現(xiàn)為下降趨勢，提示高血壓腦出血后炎性損傷機制〔7，8〕：腦出血急性期，血液分解物誘發(fā)腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生，血腫周圍分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腦組織水腫發(fā)展，促進(jìn)腦組織細(xì)胞的損傷；上述的細(xì)胞因子、化學(xué)因子可能會破壞血腦屏障，進(jìn)而導(dǎo)致腦水腫，這也是外周血中炎性因子被檢測的病理生理基礎(chǔ)；并且外周血中炎性因子的表達(dá)促進(jìn)了腦水腫的發(fā)展；炎性反應(yīng)的發(fā)生，激活機體免疫系統(tǒng)，從而病情越重，炎性細(xì)胞因子釋放越多，炎性免疫反應(yīng)就越強烈，腦組織細(xì)胞損傷越重。劉緒宏等〔9〕研究采用往動物中樞注入致病因子的方式，結(jié)果顯示外周血中炎性因子高于腦組織本身。

綜上所述，P38 MAPK可能在高血壓腦出血的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且參與了腦組織的損害，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活I(lǐng)L-6、IL-8等炎癥因子的釋放，進(jìn)一步加重高血壓腦出血后炎癥反應(yīng)。

4參考文獻(xiàn)

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9劉緒宏，李柱一，劉煜，等.重癥肌無力乙酰膽堿受體抗體致中樞損害時IL-6水平的研究〔J〕.武警醫(yī)學(xué)，2000；11(4)：195-8.

〔2015-12-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No.81460214)

通訊作者：劉娟(1970-)，女，博士，教授，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

〔中圖分類號〕R33

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2084-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.016

·心、腦血管及代謝性疾病·

1濟(jì)源市婦幼保健院(濟(jì)源市婦女兒童醫(yī)院)

第一作者：李彥明(1979-)，男，碩士，講師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)及科研研究。