減阻劑改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室重塑

陳海濱　張新祿　梁鴻彬　劉雪薇　修建成

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣東　廣州　510515)

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·基礎(chǔ)研究·

減阻劑改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室重塑

陳海濱張新祿梁鴻彬劉雪薇修建成

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州510515)

〔摘要〕目的探討靜脈應(yīng)用減阻劑(DRP)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室重塑的影響。方法24只8周齡雄性SHR隨機(jī)分為3組：生理鹽水組(SHR+NS)，減阻劑濃度10 ppm組(SHR+10)和減阻劑濃度20 ppm組(SHR+20)，隔日予靜脈注射DRP 或NS,8只年齡匹配的雄性Wistar(WR+NS)大鼠作為對照組予靜脈注射NS。靜脈給藥60 d后，超聲心動圖評估四組大鼠心功能改變與左心室后壁厚度。分離大鼠左心室心肌，石蠟包埋，HE染色評估左心室心肌肥厚，masson染色評估心肌纖維化，免疫化學(xué)檢測左室心肌內(nèi)皮素(ET)-1表達(dá)。結(jié)果超聲心動圖顯示4組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SHR+10組和SHR+20組較SHR+NS組左室收縮末期后壁厚度顯著減??；SHR+20組較SHR+NS組左室舒張末期后壁厚度顯著減小。左心室心肌HE染色示SHR+20組心肌細(xì)胞橫截面積較SHR+NS組顯著減小。左心室心肌masson染色示SHR+10和SHR+20組較SHR+NS組心肌膠原纖維百分比顯著減少。左心室心肌免疫組化顯示，靜脈應(yīng)用DRP后，SHR+10、SHR+20組左心室心肌ET-1蛋白表達(dá)較SHR+NS組顯著降低。結(jié)論靜脈應(yīng)用DRP可改善SHR左心室重塑，其機(jī)制可能與DRP增加血液剪切應(yīng)力抑制ET1表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕減阻劑；心室重塑；內(nèi)皮素-1；自發(fā)性高血壓大鼠

心臟重塑的定義為基因表達(dá)導(dǎo)致分子、細(xì)胞及間質(zhì)改變，臨床表現(xiàn)為心肌肥厚、纖維化和心臟失代償。其中心室肥厚是高血壓患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚可以減少患者的心血管并發(fā)癥。內(nèi)皮素(ET)-1主要由內(nèi)皮細(xì)胞釋放，作用于分布于心臟、主動脈和腦血管平滑肌細(xì)胞的ETa受體,介導(dǎo)血管收縮、平滑肌細(xì)胞增生和心鈉素的分泌，參與細(xì)胞外基質(zhì)合成過程。研究表明〔1〕高血壓患者內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1增加，血管及心臟ET-1基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)心肌肥厚與纖維化。提高血液流動剪切應(yīng)力可以改變內(nèi)皮細(xì)胞排列及結(jié)構(gòu)，并可以抑制ET-1表達(dá)。減阻劑(DRP)可以顯著改變血液的流體動力學(xué)，提高血液流動的剪切應(yīng)力〔2〕。本文觀察靜脈應(yīng)用DRP對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室重塑的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑健康雄性SHR 24只,8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。8只年齡性別匹配的Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(粵)2011-0015。大鼠均喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，飼養(yǎng)在南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心恒溫、恒濕、人工光照明暗各12 h 的安靜飼養(yǎng)室內(nèi)。DRP聚氧化乙烯(PEO)購于美國Sigma公司，蘇木精伊紅染色(HE)試劑盒及masson 染色試劑盒購于尚鴻生物科技有限公司，大鼠ET-1一抗購于英國Abcam公司。

1.2動物分組及干預(yù)SHR隨機(jī)分為三組：生理鹽水(NS)組(SHR+NS),DRP濃度10 ppm組(SHR+10)和DRP濃度20 ppm組(SHR+20)，8只年齡匹配的雄性Wistar(WR+NS)大鼠為對照組予靜脈注射NS。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隔日用微量泵于尾靜脈以3 ml/h速度輸注DRP或NS 30 min， 連續(xù)給藥60 d。

1.3減阻劑的制備精確稱取50 mg PEO加入25 ml NS，配制成濃度為2 000 ppm的溶液，將配好的PEO 溶液裝入分子截留量為50 000 D的透析袋中，于生理鹽水中透析24 h，用生理鹽水將透析后的溶液稀釋為10及20 ppm兩種濃度,最后采用孔徑0.2 μm 的濾膜過濾除菌后存放于4℃冰箱備用。

1.4超聲心動圖評估大鼠心功能改變與左室重塑靜脈給藥60 d后，實(shí)驗(yàn)大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺上后，給予左胸備皮，應(yīng)用配備高分辨率系統(tǒng)的Sequoia512(Acuson,Siemens)超聲機(jī)，并使用17L5 probe( Acuson,USA)探頭，將超聲探頭定位于前胸產(chǎn)生最佳的胸骨旁短軸二維影像處，在乳頭肌水平記錄胸骨旁心臟短軸M型超聲圖像，每只大鼠重復(fù)2遍測量取平均值，記錄左室收縮末期直徑(LVESD)、左室舒張末期直徑(LVEDD)、左室收縮末期后壁厚度(LVPWS)和左室舒張末期后壁厚度(LVPWD),計(jì)算大鼠左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)〔LVFS = (LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100%〕及大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)〔LVEF=(左室舒張末期容積-左室收縮末期容積)/ 左室舒張末期容積× 100%〕。

1.5左心室心肌病理切片及免疫組織化學(xué)染色每組隨機(jī)取4只大鼠分離左心室心肌，放入4℃冰箱中預(yù)冷的NS中漂洗干凈血漬，于濾紙上輕壓吸水后，標(biāo)記后投入10%中性甲醛溶液固定48 h，而后進(jìn)行石蠟包埋，制成4 μm厚的切片，進(jìn)行HE染色、masson染色及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，中性樹膠封固。在OLYBAS顯微鏡下觀察采集各個(gè)切片放大400倍圖像數(shù)張，并用Image-Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件并測量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行單因素方差分析、Welch校正檢驗(yàn)Bonferroni檢驗(yàn)及DunnettT3檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1DRP可顯著改善SHR大鼠左室后壁肥厚超聲心動圖示SHR+10和SHR+20組較SHR+NS組LVESD〔(3.22±0.22)mm，(3.19±0.16)mm vs(2.33±0.13)mm,P<0.05〕、LVEDD〔(6.19±0.23)mm,(5.94±0.17)mm vs(5.38±0.17)mm,P<0.05〕顯著增加,LVPWS顯著降低〔(2.65±0.12)mm，(2.63 ±0.14)mm vs(3.31±0.21)mm,P<0.05〕；SHR+20組較SHR+NS組LVPWD〔(2.03±0.14)mm vs(2.58±0.048)mm,P<0.05〕顯著減低。SHR+10組〔(2.19±0.11)mm〕與SHR+NS組無明顯差異，WR+NS組LVESD〔(3.67±0.18)mm〕、LVEDD〔(6.75±0.19)mm〕、LVPWS〔(2.62±0.15)mm〕及LVPWD〔(1.91±0.11)mm〕與SHR+NS組均有明顯差異(P<0.05)，而WR組和SHR各組間LVFS〔WR+NS組(0.16±0.03)，SHR+NS組(0.56±0.03)，SHR+10組(0.48±0.03)，SHR+20組(0.46±0.03)〕及LVEF〔WR+NS組(0.76±0.03)，SHR+NS組(0.86±0.03)，SHR+10組(0.78±0.03)，SHR+20組(0.76±0.03)〕無差異(P>0.05)。見圖1。

2.2DRP可顯著改善SHR左心室心肌肥厚SHR+20組心肌細(xì)胞橫截面積較SHR+NS組明顯下降〔(291.72 ±29.08)μm2vs(630.97 ±54.15)μm2,P= 0.016〕。SHR+NS組較WR+NS組〔(309.34±9.91)μm2〕心肌細(xì)胞橫截面積顯著增加，而SHR+10組和SHR+20組與WR+NS組心肌細(xì)胞橫截面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖2。

圖1　超聲心動圖評估大鼠心功能及左心室室壁厚度

圖2　各組大鼠左心室心肌HE染色(×400)

2.3DRP可顯著SHR壓大鼠左室心肌纖維化心肌masson三色染色示SHR+10和SHR+20組較SHR+NS組心肌膠原纖維百分比顯著減少〔(2.70 ±0.34)%，(2.38 ±0.34)% vs(6.58 ±0.49)%,P< 0.05〕，其中SHR+20組較SHR+10組對心肌肥大的抑制效果更強(qiáng)，但兩組之間并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SHR+NS組較WR+NS組〔(1.86±0.37)%〕心肌膠原纖維百分比顯著增加(P<0.05)。而SHR+10和SHR+20組較WR+NS組心肌膠原纖維百分比無顯著差異。見圖3。

2.4DRP可顯著抑制SHR大鼠左心室心肌ET-1表達(dá)ET-1在4組大鼠左心室心肌均有表達(dá)，SHR大鼠左心室心肌表達(dá)明顯高于WR大鼠。經(jīng)過靜脈應(yīng)用DRP后，SHR+10組、SHR+20組左心室心肌ET-1表達(dá)較SHR+NS組顯著降低；SHR+20組較SHR+10組ET-1表達(dá)顯著減少。見圖4。

圖3　各組大鼠左心室心肌masson染色(DAB,×400)

圖4　各組大鼠左心室心肌ET-1表達(dá)(DAB，×400)

3討論

心肌細(xì)胞是參與心臟重塑過程中的主要細(xì)胞，其他的成分包括間質(zhì)、成纖維細(xì)胞、膠原和冠狀動脈血管。臨床表現(xiàn)為左心室肥厚和心臟擴(kuò)大，其相應(yīng)的組織學(xué)改變主要為心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化，其中左心室肥厚是高血壓的早期改變，隨著心肌肥大引起的肌纖維重構(gòu)排列紊亂、心肌收縮功能障礙，必然進(jìn)一步發(fā)展為心力衰竭。左心室肥厚是引起心力衰竭不斷加重的病理生理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致患者心血管事件發(fā)生率顯著增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與高血壓的預(yù)后密切相關(guān)。

高血壓是內(nèi)皮損傷的始動因素之一，內(nèi)皮功能紊亂又可促進(jìn)高血壓的發(fā)生與進(jìn)展。研究表明〔3〕，在高血壓狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱和(或)內(nèi)皮依賴性收縮功能增強(qiáng)以及血管壁炎癥反應(yīng)增強(qiáng)等。ET-1參與許多疾病,包括高血壓、動脈粥樣硬化或纖維化的病理過程〔4〕。高血壓患者內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1增加，血管及心臟ET-1基因表達(dá)上調(diào)，增加的ET-1又可進(jìn)一步升高血壓，促進(jìn)心肌肥厚與纖維化〔5～7〕。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者逐漸開展了DRP在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究，初步結(jié)果顯示，靜脈應(yīng)用DRP后可顯著減低血流阻力，明顯增加組織器官微循環(huán)的血流灌注，對于缺血性心血管疾病、失血性休克、腦卒中、糖尿病等的治療有重要的潛在價(jià)值〔8～10〕。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，靜脈應(yīng)用DRP后可顯著增加大鼠腹主動脈血流速度，而不影響?zhàn)ざ?，由公式?jì)算可得主動脈內(nèi)血液流動剪切應(yīng)力顯著增加〔11〕。靜脈應(yīng)用DRP后血流剪切應(yīng)力增加,抑制ET-1表達(dá)減弱了ET-1對SHR心肌肥厚的刺激，ET-1通過調(diào)節(jié)膠原纖維合成及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)/組織MMP活性刺激纖維化過程〔12〕，使SHR大鼠左心室心肌纖維化被顯著抑制。綜上所述，靜脈應(yīng)用DRP通過增加血液流動的剪切應(yīng)力抑制ET-1表達(dá)，顯著改善了左心室重塑，為DRP在心血管病治療上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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〔2015-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)

Drag-reducing polymers improving left ventricular remodeling in spontaneous hypertensive rats

CHEN Hai-Bin,ZHANG Xin-Lu,LIANG Hong-Bin,et al.

Department of Cardiology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of drag-reducing polymers (DRP) on the hypertension-induced left ventricular remodeling in spontaneous hypertensive rats (SHR).Methods24 male SHR were randomly divided into three groups,8 male,age matched Wistar rats (WR) were selected as control.SHR received intravenous injection of normal saline (SHR+NS),DRP of 10 ppm (SHR+10) and DRP of 20 ppm (SHR+20),respectively.WR in the control group only received equal-volume of normal saline (WR+NS).After 60 days,echocardiography was used to evaluate cardiac function and left ventricular remodeling in SHR.The cross-sectional areas of cardiomyocytes and collagen volume fraction in left ventricle were quantified from each group.The expression of endothelin (ET)-1 of left ventricle was examined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the SHR+NS group,left ventricular end-systolic posterior wall thickness (LVPWS) was decreased in SHR+10 and SHR+20 group.Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness (LVPWD) in SHR+20 was attenuated compared with SHR+NS group.The cross sectional areas of left ventricular cardiomyocytes in SHR+20 were attenuated compared with SHR+NS.The collagen volume fraction in left ventricle of SHR+10 and SHR+20 were decreased compared with SHR+NS.The expression of ET-1 in left ventricle of SHR+10 and SHR+20 were significantly attenuated compared with SHR+NS after DRP administration.ConclusionsChronic treatment with DRP can protect against left ventricular remodeling in SHRs.

【Key words】Drag reducing polymers；Left ventricular remodeling；Endothelin-1；Spontaneous hypertensive rats

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470598)

通訊作者：修建成(1974-)，男，博士，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病的臨床與基礎(chǔ)研究。

〔中圖分類號〕R541.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2049-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.001

第一作者：陳海濱(1989-)，男，碩士，主要從事冠心病的臨床與基礎(chǔ)研究。