外周循環(huán)血微小RNA表達水平與冠心病發(fā)病風險的關聯分析

寧明安　劉立鵬　陳書影　程康　瞿發(fā)林　郭文怡

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內科

?

·臨床研究·

外周循環(huán)血微小RNA表達水平與冠心病發(fā)病風險的關聯分析

寧明安劉立鵬陳書影程康瞿發(fā)林郭文怡

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內科

【摘要】目的探討微小RNA-133a(miRNA-133a)、miRNA-208a和miRNA-499a在冠心病患者外周循環(huán)血中的表達水平及其臨床意義。方法選擇冠心病患者290例，冠狀動脈陰性對照組110例，收集兩組樣本臨床資料；運用實時定量聚合酶鏈反應檢測樣本血漿中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平，并分析其表達差異。結果(1)與冠狀動脈陰性對照組比較，冠心病組miRNA-133a[0.62(0.32-0.92)比0.39(0.21-0.72)，Z=8.80]、miRNA-208a[5.85(2.31-9.78)比5.06(2.17-9.13)，Z=2.32]和miRNA-499a[5.07(2.08-9.54)比3.12(1.96-5.03)，Z=10.08] 表達水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)；(2)根據Gensini評分將所有研究對象分為4組，各組之間miRNA-133a[0.36(0.21-0.66)比0.48(0.36-0.85)比0.60(0.42-0.87)比0.70(0.56-0.92)，H=64.84]、miRNA-208a[4.99(2.17-6.73)比5.16(3.56-8.04)比5.85(4.31-8.63)比6.18(4.84-9.78)，H=21.54]和miRNA-499a[2.94(1.96-4.93)比3.55(2.02-6.63)比4.51(2.38-7.54)比6.24(4.08-9.54)，H=89.70]表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)，且表達水平變化與Gensini評分即冠狀動脈粥樣硬化狹窄程度呈正相關(miRNA-133a：r=0.343，P<0.01；miRNA-208a：r=0.395，P<0.01；miRNA-499a：r=0.410，P<0.01)。結論冠心病患者外周循環(huán)血中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平較冠狀動脈陰性對照者有顯著差異，且表達水平變化與Gensini評分即冠狀動脈粥樣硬化狹窄程度呈正相關。

【關鍵詞】微小RNA；冠狀動脈疾病；逆轉錄；實時定量聚合酶鏈反應；Gensini評分

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類高度保守的內源性小分子單鏈非編碼RNA，幾乎存在于所有真核微生物中[1]。其可通過與特定靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)互補性結合促使其降解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平對基因表達進行調控[2]。研究發(fā)現外周循環(huán)血中存在miRNAs，作為調節(jié)因子在心臟發(fā)育、血管發(fā)育和血管再生中起著重要作用[3]。目前在人類基因組中已發(fā)現約800種miRNAs，估計總共有超過1 000種miRNAs在人類基因組中表達[4]。而且miRNAs不易受溫度、pH值及放置時間長短的影響，因此具有非常好的穩(wěn)定性[5]。miRNAs將可能作為一種新型的生物標記物在冠心病患者的診斷和預后中發(fā)揮重要作用[6]，并且有望成為冠心病的一個新型治療靶點[7]。

冠心病是心血管疾病中的常見病，具有高發(fā)病率和高致死率的特點，已成為人群最主要的死亡病因[8]。因此，冠心病應早期預防、早期發(fā)現和早期診斷，從而阻止該病進行性發(fā)展，改善患者的遠期預后，提高患者的治愈率和生存率。本研究旨在觀察冠心病患者血漿中miRNAs表達水平變化，探討其與冠狀動脈狹窄程度的相關性，對早期診斷和預防冠心病具有重要意義，為進一步探討冠心病的基因診斷和治療提供重要的理論依據。

1對象和方法

1.1研究對象

選取2014年12月至2015年5月于第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心內科住院并行冠狀動脈造影明確診斷為冠心病的患者290例作為病例組，年齡>18歲，無血緣關系，冠狀動脈三支主要血管中，至少有一支狹窄程度≥50%[9]。同時選取基線資料配對的110例疑診冠心病患者，行冠狀動脈造影后，冠狀動脈三支主要血管的狹窄程度均<50%，能夠明確排除冠心病，作為對照組。記錄所有研究對象的完整病史信息。排除標準：(1)惡性腫瘤病史；(2)終末期腎臟疾病，肝功能衰竭；(3)1個月內輸血史；(4)骨髓移植術史；(5)急性感染。本研究經第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院倫理委員會批準同意。所有研究方案均取得患者或家屬知情同意。

1.2研究方法

1.2.1病史資料收集所有研究對象的年齡、性別、身高、體重、吸煙史、飲酒史、既往高血壓和糖尿病病史等資料。

1.2.2生化檢查收集所有研究對象的采血檢測的生化檢查資料，包括谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素氮、尿酸、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoproteincholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoproteincholesterol，LDL-C)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)。

1.2.3冠狀動脈造影及Gensini評分[10]所有研究對象的冠狀動脈造影均采用橈動脈或股動脈途徑進行，術中盡量使冠狀動脈各段能充分顯示。冠狀動脈病變狹窄程度采用Gensini評分，根據評分結果將所有研究對象分為4組：A組99例，Gensini評分≤22分，B組98例，Gensini評分23～55分，C組102例，Gensini評分56～96分，D組101例，Gensini評分≥97分。

1.2.4血液樣本的采集和儲存所有研究對象在胸痛發(fā)作24 h內行冠狀動脈造影術前抽取橈動脈血5 ml于含EDTA抗凝劑采血管中，靜置1 h，室溫1 200 rpm離心15 min，提取上清液分裝到去RNA酶的EP管中，再以8 000 rpm充分離心5 min，取上層血漿每500 μl分裝至RNAse-free EP管中，最終每例患者收集2～3管，然后放置到-80℃低溫冰箱中保存待用。

表1　兩組樣本基本臨床資料比較

1.2.5miRNAs檢測將離心得到的血漿取500 μl到新的離心管中，用RNAiso Plus(TaKaRa，Code No.9109)，按照試劑操作說明提取各樣本總RNA，放置于-80℃低溫冰箱中保存集中進行逆轉錄。各樣本均取20 ng總RNA應用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，Code No.RR036A)，按照試劑操作說明配制成10 μl體系的RT反應液進行逆轉錄，得到cDNA。以RNU6B為內參。各樣本逆轉錄產物均取2 μl應用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，Code No.RR820A)，按照操作說明配制成25 μl體系的PCR反應液，使用ABI 7500儀應用TaqMan探針實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和PCR雙重特異性引物擴增技術檢測miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a的Ct值。以RNU6B為內參。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1兩組樣本臨床資料及生化指標比較

表1、2顯示，病例組和對照組的年齡、性別、體重、體質指數(body mass index，BMI)、高血壓病史、糖尿病病史、FBG、水平差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。與對照組比較，病例組的吸煙比以及TG、TC、LDL-C、肌酐和尿酸均顯著高于對照組，HDL-C水平低于對照組(均為P<0.01)。

表2　兩組樣本基本生化指標比較

2.2根據Gensini評分分組的樣本間臨床資料及生化指標比較

表3、4顯示，將所有研究對象根據Gensini評分按照四分位數間距分為4組，分析結果表明各組間年齡、性別、體重、BMI、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史、FBG、HDL-C、肌酐和尿酸水平的差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；各組間TG、TC和LDL-C的差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

表3　根據Gensini評分分組的基本臨床資料比較

表4　根據Gensini評分分組的基本生化指標比較

2.3實時熒光定量PCR相對定量檢測miRNA結果

表5顯示，與對照組比較，病例組miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。結果以中位數和四分位數間距表示。

表5　兩組樣本miRNA檢測結果比較[M(P25-P75)]

表6顯示，將所有研究對象根據Gensini評分按照四分位數間距分組，分析結果表明各組間miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。

2.4相關性分析

圖1、2、3顯示，Pearson直線相關分析表明，血漿中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平與Gensini評分呈正相關，即表達水平變化與冠狀動脈狹窄程度呈正相關，相關系數(r)分別為0.343、0.395和0.410(均為P<0.01)。

3討論

目前發(fā)現與冠心病相關的miRNAs很多，其中研究較多的有miRNA-1、miRNA-126、miRNA-133、miRNA-208和miRNA-499等，這些血管內皮特異性表達的miRNAs在冠心病患者表達水平異常，提示它們可能是冠心病的潛在生物標志物，但尚未得出一致結論[11-15]。并且，此類miRNAs在外周循環(huán)血中的表達水平與冠心病患者冠狀動脈病變狹窄程度是否具有相關性尚不清楚。

表6　根據Gensini評分分組的miRNA檢測結果比較[M(P25-P75)]

圖1　miRNA-133a與Gensini評分的關聯性分析

圖2　miRNA-208a與Gensini評分的關聯性分析

圖3　miRNA-499a與Gensini評分的關聯性分析

D′ Alessandra等[16]研究發(fā)現，大鼠冠狀動脈閉塞6 h后心肌梗死區(qū)miRNA-1和miRNA-133的表達水平均下降；而在血清或血漿中檢測到的miRNA-1、miRNA-133和miRNA-499的表達水平則升高，表明miRNA-1和miRNA-133在心肌損傷后才釋放入血，并在心肌梗死患者出現癥狀后156 min即能檢測到miRNA-1和miRNA-133的高峰值，且此數值比cTnI峰值出現更早、數值更高。Eitel等[17]研究126例ST段抬高型心肌梗死患者，也發(fā)現血清或血漿中miRNA-133a表達水平的升高與心肌損傷修復、損傷面積擴大和再灌注損傷密切相關。上述研究表明，血清或血漿miRNA-133可能是一種有意義的早期診斷急性心肌梗死的生物標記物，對于早期接受再灌注治療挽救心肌有重要意義。

miRNA-499在肌肉中特異表達，在肌球蛋白基因調控中起重要作用。Li等[18]研究發(fā)現，與健康組相比，有6種miRNAs(miRNA-l、miRNA-134、miRNA-186、miRNA-208、miRNA-223和miRNA-499) 在急性心肌梗死患者血清或血漿中表達均明顯升高，且miRNA-208和miRNA-499在心絞痛患者中表達更高。這些提示miRNA-499也有作為生物標記物診斷冠心病的潛力。

miRNA-208由α肌球蛋白重鏈(α-MHC)的內含子編碼，特異性地表達于心肌組織[19]，其功能主要在心肌細胞發(fā)育過程中調控肌球蛋白重鏈的生成。Xu等[20]通過靜脈注射異丙腎上腺素建立大鼠心肌缺血的動物模型，再用miRNA微陣列分析得出miRNA-208是心臟特異性miRNA這一結果。Wang等[21]研究發(fā)現，無論是在大鼠還是人體內，正常狀態(tài)下檢測不到miRNA-208a，且只有受損的心臟組織中才能檢測到miRNA-208a；此外，通過建立心肌缺血動物模型，發(fā)現心肌損傷1 h內大鼠血漿miRNA-208a即會明顯升高，如果未損傷心肌而只損傷骨骼肌，則miRNA-208a不升高。進一步研究發(fā)現，miRNA-208a在心肌梗死患者血清或血漿中明顯高于正常人以及其他患心血管疾病的患者，并且通過受試者工作特征曲線分析證實miRNA-208a具有很高的敏感性和特異性。上述結果表明，miRNA-208a具有高度的心肌特異性，提示miRNA-208a可能是一種有意義的早期診斷急性心肌梗死的生物標志物。

本研究仍然存在一些不足。首先，本研究所選的3個miRNAs僅僅來源于國內外相關參考文獻，研究為非探索性研究；其次，同所有病例-對照研究一樣，本研究存在一些不可避免的選擇偏倚；再次，此研究只包括了新診斷的急性冠狀動脈綜合征患者并且只在手術治療前采集了血液樣本，并且未對患者進行隨訪。急性冠狀動脈綜合征患者從發(fā)病到確診的時間難以精確掌握，對于該部分患者的采血時間可能存在偏差；最后，本研究只入選了陜西漢族的冠心病人群。

4小結

本臨床研究以冠心病患者為研究對象，檢測其血漿中miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平。研究發(fā)現冠心病組血漿miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義。將所有研究對象根據Gensini評分按照四分位數間距分為4組，各組之間血漿miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平差異有統(tǒng)計學意義，且表達水平變化與Gensini評分即冠狀動脈狹窄程度呈正相關。但是，冠心病是一種多種基因參與的多因素疾病，由于1種miRNA可能靶向多個基因，1種基因可能受多個miRNA的共同調控，因此miRNA在臨床診療冠心病方面的應用仍需不斷研究、探索、嘗試，才能最終實現其臨床價值。

利益沖突：無

參考文獻

[1] Cullen BR.Transcription and processing of human microRNA precursors[J].Mol Cell，2004，16(6)：861-865.DOI：10.1016/j.molcel.2004.12.002.

[2] Bartel DP.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions[J].CELL，2009，136(2)：215-233.DOI：10.1016/j.cell.2009.01.002.

[3] Zampetaki A，Willeit P，Tilling L，et al.Prospective study on circulating MicroRNAs and risk of myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2012，60(4)：290-299.DOI：10.1016/j.jacc.2012.03.056.

[4] Bentwich I，Avniel A，Karov Y，et al.Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs[J].Nat Genet，2005，37(7)：766-770.DOI：10.1038/ng1590.

[5] Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30)：10513-10518.DOI：10.1073/pnas.0804549105.

[6] Sayed AS，Xia K，Yang TL，et al.Circulating microRNAs：a potential role in diagnosis and prognosis of acute myocardial infarction[J].Dis Markers，2013，35(5)：561-566.DOI：10.1155/2013/217948.

[7] Frost RJ，van Rooij E.MiRNAs as therapeutic targets in ischemic heart disease[J].J Cardiovasc Transl Res，2010，3(3)：280-289.DOI：10.1007/s12265-010-9173-y.

[8] Wang Q.Molecular genetics of coronary artery disease[J].Curr Opin Cardiol，2005，20(3)：182-188.

[9] WHO publishes definitive atlas on global heart disease and stroke epidemic[J].Indian J Med Sci，2004，58(9)：405-406.

[10] Gensini GG.A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary heart disease[J].Am J Cardiol，1983，51(3)：606.

[11] Sayed AS，Xia K，Salma U，et al.Diagnosis，prognosis and therapeutic role of circulating miRNAs in cardiovascular diseases[J].Heart Lung Circ，2014，23(6)：503-510.DOI：10.1016/j.hlc.2014.01.001.

[12] Faruq O，Vecchione A.MicroRNA：diagnostic perspective[J].Front Med (Lausanne)，2015，2：51.DOI：10.3389/fmed.2015.00051.

[13] Izarra A，Moscoso I，Levent E，et al.MiR-133a enhances the protective capacity of cardiac progenitors cells after myocardial infarction[J].Stem Cell Reports，2014，3(6)：1029-1042.DOI：10.1016/j.stemcr.2014.10.010.

[14] Samanta S，Balasubramanian S，Rajasingh S，et al.MicroRNA：a new therapeutic strategy for cardiovascular diseases[J].Trends Cardiovasc Med，2016.DOI：10.1016/j.tcm.2016.02.004.

[15] 唐義信，孫權，朱靈萍，等.冠心病患者血漿中microRNA-145表達與冠狀動脈側支循環(huán)形成的相關性研究[J].中國心血管雜志，2015，20(4)：262-266.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2015.04.006.

Tang YX，Sun Q，Zhu LP，et al.Relationship between the plasma expression of microRNA-145 and formation of coronary collateral circulation in patients with coronary artery disease[J].Chin J Cardiovasc Med，2015，20(4)：262-266.DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2015.04.006.

[16] D′Alessandra Y，Devanna P，Limana F，et al.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction[J].Eur Heart J，2010，31(22)：2765-2773.DOI：10.1093/eurheartj/ehq167.

[17] Eitel I，Adams V，Dieterich P，et al.Relation of circulating MicroRNA-133a concentrations with myocardial damage and clinical prognosis in ST-elevation myocardial infarction[J].Am Heart J，2012，164(5)：706-714.DOI：10.1016/j.ahj.2012.08.004.

[18] Li C，Fang Z，Jiang T，et al.Serum microRNAs profile from genome-wide serves as a fingerprint for diagnosis of acute myocardial infarction and angina pectoris[J].BMC Med Genomics，2013，6：16.DOI：10.1186/1755-8794-6-16.

[19] Van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al.Control of stressdepen-dent cardiac growth and gene expression by a microRNA[J].Science，2007，316(5824)：575-579.DOI：10.1126/science.1139089.

[20] Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury[J].Clin Chem，2009，55(11)：1944-1949.DOI：10.1373/clinchem.2009.125310.

[21] Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans[J].Eur Heart J，2010，31(6)：659-666.DOI：10.1093/eurheartj/ehq013.

(本文編輯：譚瀟)

Fund program：National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No.2012AA02A603)

Association between the expression of peripheral plasma microRNAs and the risk of coronary heart disease

NingMing′an，LiuLipeng，ChenShuying，ChengKang，QuFalin，GuoWenyi

DepartmentofCardiovascularMedicine，XijingHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of peripheral plasma miRNA-133a，miRNA-208a and miRNA-499a in patients with coronary heart disease (CHD).Methods The 290 CHD patients and 110 controls subjects were enrolled in this study.Peripheral blood of all subjects and their clinical data were collected.Plasma miRNA-133a，miRNA-208a and miRNA-499a levels were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis and their expressions were furtherly analyzed.Results(1)Compared with control group，the expression of plasma miRNA-133a [0.62(0.32-0.92) vs.0.39(0.21-0.72)，Z=8.80]，miRNA-208a [5.85(2.31-9.78) vs.5.06(2.17-9.13)，Z=2.32] and miRNA-499a [5.07(2.08-9.54) vs.3.12(1.96-5.03)，Z=10.08] were significantly increased in CHD group (all P<0.01).(2)CHD patients were further divided into four groups according to Gensini score.The expression levels of plasma miRNA-133a [0.36(0.21-0.66) vs.0.48(0.36-0.85) vs.0.60(0.42-0.87) vs.0.70(0.56-0.92)，H=64.84]，miRNA-208a [4.99(2.17-6.73) vs.5.16(3.56-8.04) vs.5.85(4.31-8.63) vs.6.18(4.84-9.78)，H=21.54]，and miRNA-499a [2.94(1.96-4.93) vs.3.55(2.02-6.63) vs.4.51(2.38-7.54) vs.6.24(4.08-9.54)，H=89.70] were significantly difference among those groups (all P<0.01)，and positively correlated with severity of coronary artery stenosis (miRNA-133a: r=0.343，miRNA-208a: r=0.395，miRNA-499a: r=0.410，all P<0.01).ConclusionsThere is significant difference between CHD and control groups in the expressions of peripheral plasma miRNA-133a，miRNA-208a and miRNA-499a.In addition，the expression levels and Gensini Score-severity of coronary artery stenosis is positively correlated.

【Key words】MicroRNAs (miRNAs)；Coronary artery disease；Reverse transcription；Real-time quantitative polymerase chain reaction；Gensini score

(收稿日期:2016-03-16)

Corresponding author：Guo Wenyi，Email：guowenyi@tom.com

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA02A603)

DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2016.02.008

通訊作者：郭文怡，電子信箱：guowenyi@tom.com