黃土區(qū)金盞菊幼苗對(duì)Pb/Cd次生非生物脅迫響應(yīng)的紅外光譜研究

范春輝， 常 敏， 張穎超， 高雅琳

1. 陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021

2. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 北京 100084

黃土區(qū)金盞菊幼苗對(duì)Pb/Cd次生非生物脅迫響應(yīng)的紅外光譜研究

范春輝1， 常 敏1， 張穎超2， 高雅琳1

1. 陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021

2. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 北京 100084

植物修復(fù)法是重金屬污染場(chǎng)地修復(fù)的重要手段， 這種“綠色修復(fù)技術(shù)”得到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注和期待。 在重金屬脅迫條件下， 植物自身會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的響應(yīng)反映， 進(jìn)而逐漸適應(yīng)并有效減緩重金屬的直接毒害作用。 這種微尺度的調(diào)控行為往往多維度和不可見(jiàn)， 需要借助精密儀器分析技術(shù)加以剖析。 現(xiàn)階段， 相關(guān)方面的研究還略顯欠缺。 以黃土修復(fù)植物金盞菊幼苗為研究對(duì)象， 分析Pb/Cd復(fù)合脅迫對(duì)其表觀形貌的影響， 采用傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)識(shí)別其地下和地上部分樣本的官能團(tuán)性質(zhì)， 初步推斷金盞菊對(duì)Pb/Cd脅迫的響應(yīng)途徑和耐受機(jī)制。 研究表明： 隨著Pb/Cd脅迫程度的加劇， 金盞菊根冠彎曲萎縮， 根毛數(shù)量明顯減少， 而其地上部分形貌差異很小。 Pb/Cd脅迫對(duì)金盞菊幼苗地下和地上部分的FTIR圖譜影響較大： 3 573 cm-1附近的—OH峰強(qiáng)減弱且發(fā)生移動(dòng)， 隨著Pb/Cd脅迫濃度的增加， 峰形更趨復(fù)雜化； 這表明Pb/Cd與—OH間存在配位結(jié)合效應(yīng)， Pb/Cd脅迫干擾了有機(jī)物的合成和分泌。 飽和C—H振動(dòng)峰整體紅移， 可能與細(xì)胞膜的膜脂氧化程度有關(guān)。 1 631和1 574 cm-1處吸收峰強(qiáng)下降， 說(shuō)明與之關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)組分特性可能有異。 1 385 cm-1處峰位有所偏移， 推測(cè)金盞菊通過(guò)改變果膠質(zhì)和油脂的甲基化程度， 完成細(xì)胞組織對(duì)Pb/Cd脅迫的“直接排斥→逐步適應(yīng)→增強(qiáng)抗逆性”的過(guò)程轉(zhuǎn)變。 FTIR對(duì)于識(shí)別土壤重金屬的植物修復(fù)機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。

FTIR； 金盞菊； 黃土； Pb/Cd脅迫

引 言

植物修復(fù)是利用植物來(lái)移除、 容納或分解土壤污染物(重金屬、 有機(jī)物等)， 進(jìn)而恢復(fù)土壤生態(tài)功能的凈化過(guò)程。 自20世紀(jì)90年代以來(lái)， 應(yīng)用植物修復(fù)法處理土壤重金屬污染已成為環(huán)境治理領(lǐng)域的前沿性課題[1]。 理論上來(lái)講， 每種植物或多或少都有吸收重金屬的能力， 但目前全球僅發(fā)現(xiàn)500余種超富集植物(對(duì)重金屬吸收量超過(guò)一般植物100倍以上)， 這些植物對(duì)重金屬都有較強(qiáng)的忍耐和抵抗能力。 Clemens[2]認(rèn)為： 植物對(duì)土壤重金屬的解毒機(jī)制包括可控吸收、 螯合固定、 胞內(nèi)分隔、 生化隱忍和平衡調(diào)控等方面。 但鑒于植物體系新陳代謝的復(fù)雜性以及微觀研究的不確定性， 重金屬解毒的響應(yīng)途徑和調(diào)控機(jī)制尚不十分明晰。 這也成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

植物在受到土壤重金屬脅迫和毒害時(shí)， 往往會(huì)伴隨一系列的應(yīng)激響應(yīng)， 比如葉片萎蔫、 組織壞死、 局部畸形或無(wú)花無(wú)果等。 這些表觀病態(tài)較易發(fā)現(xiàn)， 但植株內(nèi)部的生理生態(tài)變化過(guò)程較難察覺(jué)， 需要借助先進(jìn)的微尺度分析手段精準(zhǔn)識(shí)別。 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)就是其中的一類重要工具[3]。 FTIR的分析對(duì)象側(cè)重于物質(zhì)分子的化學(xué)鍵和官能團(tuán)信息， 能從量子化學(xué)層面提供重要的檢測(cè)證據(jù)。 近幾年， 諸多學(xué)者開(kāi)始研究重金屬脅迫對(duì)植物體FTIR的影響， 證實(shí)了FTIR應(yīng)用的可行性和優(yōu)越性[4-5]； 這也從較新角度闡釋了植物體對(duì)重金屬脅迫的抗性機(jī)制， 為同類研究提供了很有價(jià)值的第一手?jǐn)?shù)據(jù)。

金盞菊(Calendulaofficinalis)是常見(jiàn)的觀賞花卉， 對(duì)土壤重金屬表現(xiàn)出較強(qiáng)的富集潛力[6]； 其直接進(jìn)入食物鏈的概率較低， 這與土壤修復(fù)原則(效果好， 風(fēng)險(xiǎn)低)具有很好的契合度。 前期筆者研究了金盞菊幼苗對(duì)黃土區(qū)Pb/Cd復(fù)合污染的修復(fù)效果， 建立了金盞菊體內(nèi)Pb/Cd定量分析的濕法消解-火焰原子光譜法。 本文重點(diǎn)分析Pb/Cd次生非生物脅迫對(duì)金盞菊幼苗FTIR性質(zhì)的影響， 推斷可能存在的響應(yīng)途徑和規(guī)避機(jī)制， 力圖為后續(xù)研究提供參考和借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

電熱鼓風(fēng)干燥箱(WGL-125B, TAISITE)， 臺(tái)式掃描電子顯微鏡(TM-1000, HITACHI)， 傅里葉變換紅外光譜儀(VECTOR-22, BRUKER)。 實(shí)驗(yàn)用水為桶裝純凈水， KBr為光譜純， Pb(NO3)2和CdCl2等其余化學(xué)試劑均為優(yōu)級(jí)純。

1.2 方法

1.2.1 污染黃土制備

所用黃土取自陜西科技大學(xué)教學(xué)區(qū)南側(cè)樹(shù)林-草坪植被帶[7]。 向黃土樣品中噴灑Pb(NO3)2和CdCl2溶液， 充分?jǐn)嚢枋裹S土潤(rùn)濕并混合均勻， 配制模擬Pb/Cd復(fù)合污染黃土， 黃土老化時(shí)間為15 d。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)黃土Pb濃度為0， 500， 1 000， 2 000 mg·kg-1， Cd濃度為0， 10， 30， 50 mg·kg-1； 選取其中代表性的三組濃度梯度組合作為黃土基質(zhì)， 具體方案見(jiàn)表1。

表1 模擬污染黃土Pb/Cd添加量/(mg·kg-1)

1.2.2 金盞菊幼苗培養(yǎng)

金盞菊種子購(gòu)自西安三色園藝有限責(zé)任公司； 為了獲得合適的金盞菊幼苗， 采用盆栽土培實(shí)驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)。 其中盆栽容器為45 cm×20 cm×15 cm的矩形塑料盆， 每盆裝有模擬污染黃土(6.0±0.1)kg； 依次向黃土中均勻施加尿素、 磷酸二氫鈉和氯化鉀， 三種底肥添加量分別為0.4， 0.2和0.3 g·kg-1黃土。 金盞菊播種時(shí)間為2014年10月1日， 每盆均勻播種20粒， 置于室外天然光照條件下培養(yǎng)， 定期以純凈水(水中未檢出重金屬)澆灌， 維持黃土含水量為田間持水量的70%。 從播種之日起， 經(jīng)過(guò)45 d的培養(yǎng)收獲金盞菊幼苗。

1.3 分析方法和質(zhì)量控制

金盞菊幼苗生長(zhǎng)周期較短(45 d)， 故沒(méi)有將金盞菊的根、 莖和葉三部分做精細(xì)區(qū)分研究， 而以地下和地上部分為檢測(cè)對(duì)象。 收獲后的金盞菊幼苗以純凈水漂洗3次， 用刀片將其截成地下和地上兩部分； 再將得到的地下和地上部分分別縱向剖切， 使其斷面組織形態(tài)暴露； 直接將所得鮮樣粘附于導(dǎo)電膠帶上進(jìn)行形貌觀察， 以盡量降低脫水定形、 冷凍干燥、 噴金鍍膜等操作對(duì)樣品形貌的干擾。 為了保證SEM觀察的針對(duì)性和高效性， 金盞菊幼苗地下和地上部分的放大倍數(shù)分別為×500和×1 000倍。

另取一份純凈水洗凈后的金盞菊幼苗于105 ℃干燥箱中殺青(30 min)、 烘干(70 ℃)至恒重， 所得樣品于瑪瑙研缽中磨成粉末備用。 FTIR測(cè)試采用KBr壓片法， 掃描范圍4 000～400 cm-1， 分辨率2 cm-1， 掃描累加次數(shù)為32次， 樣品與KBr的質(zhì)量比約為1∶100。 玻璃器皿使用前均經(jīng)10% HNO3浸泡24 h， 純凈水洗凈后備用。 所得數(shù)據(jù)采用Origin 6.0軟件處理和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM

Pb/Cd復(fù)合脅迫對(duì)金盞菊幼苗地下和地上部分表觀形貌的影響如圖1所示。 總體上看， 地下部分樣本的根毛濃密圓潤(rùn)、 數(shù)量較多， 地上部分沒(méi)有發(fā)現(xiàn)絨毛或類似附屬物存在； 除此之外， 地下和地上部分基本沒(méi)有明顯的、 穩(wěn)定的區(qū)別特征。 對(duì)金盞菊地下部分樣本橫向比較， 發(fā)現(xiàn)Pb/Cd脅迫的干擾效應(yīng)較大。 隨著脅迫程度的加劇(T0→T1→T2)， 地下部分根冠彎曲、 嚴(yán)重萎縮， 根毛皺折、 粗細(xì)不均， 根毛數(shù)量明顯減少； 而地上部分的表觀形態(tài)差異不大， 截面紋路清晰， 偶現(xiàn)腺毛類附屬物， 可初步識(shí)別出維管束和纖維束， 纖維壁較薄。 造成這種形貌差異的原因可能與金盞菊生長(zhǎng)周期較短有關(guān)， 也可能是Pb/Cd脅迫對(duì)金盞菊幼苗(尤其是地下部分)毒害作用的直接反映。

圖1 黃土Pb/Cd脅迫對(duì)金盞菊幼苗地下和地上部分表觀形貌的影響

2.2 FTIR

2.2.1 地下部分

圖2 黃土Pb/Cd脅迫對(duì)金盞菊幼苗地下部分FTIR的影響

Fig.2 FTIR spectra of underground parts ofCalendulaofficinalisseedlings under lead and cadmium stress in loess

圖3 黃土Pb/Cd脅迫對(duì)金盞菊幼苗地上部分FTIR的影響

相比之下， Pb/Cd復(fù)合脅迫對(duì)金盞菊幼苗地下部分FTIR圖譜的影響較大。 其中位于3 573 cm-1附近的—OH峰強(qiáng)減弱， 此處原有的寬大吸收峰變?yōu)槿舾扇醴澹?峰形變窄； 隨著Pb/Cd脅迫濃度的增加， 該吸收區(qū)間的峰形趨于復(fù)雜化； 這說(shuō)明地下部分相關(guān)組分的微觀行為較為活躍， 推測(cè)可能是Pb/Cd脅迫促進(jìn)了金盞菊根系分泌物(多糖、 蛋白質(zhì)、 脂類等)的生成， 進(jìn)而有效抵抗和適應(yīng)不良?jí)木常?同時(shí)也不排除Pb/Cd與—OH間的配位結(jié)合效應(yīng)導(dǎo)致吸收峰的性質(zhì)差異[8]。 2 976和2 870 cm-1處的吸收峰發(fā)生整體紅移， 但峰形變化不大， 這可能與細(xì)胞膜的膜脂過(guò)氧化程度有關(guān)， 也可能存在有機(jī)酸類分泌物與Pb/Cd結(jié)合能力周期性變化的貢獻(xiàn)[9]。 1 631和1 574 cm-1處的吸收峰略有變化， 表明Pb/Cd脅迫導(dǎo)致金盞菊幼苗細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到破壞， 與之相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)組分特性可能有異。 1 324 cm-1處的峰強(qiáng)減弱暗示了油脂化合物甲基化程度的改變， 這種變化有助于增強(qiáng)金盞菊幼苗根際圈對(duì)Pb/Cd脅迫的抗逆性和適應(yīng)性， 是植物自解毒效應(yīng)的體現(xiàn)[10]。

2.2.2 地上部分

金盞菊幼苗地上部分的FTIR圖譜如圖3所示。 3 500 cm-1附近的吸收峰值變化較大， 表明Pb/Cd脅迫與—OH發(fā)生吸附結(jié)合， 導(dǎo)致樣品氫鍵含量減少； T1實(shí)驗(yàn)組的自由羥基(O—H， 3 558 cm-1)和分子間氫鍵(O—H， 3 232 cm-1)的伸縮振動(dòng)效應(yīng)更易識(shí)別， 可能源于Pb/Cd干擾下的羥基耦合效應(yīng)[11]。 隨著Pb/Cd脅迫濃度的增加， 該區(qū)域吸光度先降低(T1)后升高(T2)。 這說(shuō)明較低濃度的Pb/Cd脅迫可能抑制了有機(jī)物的合成和分泌， 而Pb/Cd的高度脅迫則促進(jìn)了有機(jī)物的分泌和運(yùn)輸[12]； 有機(jī)物的大量分泌能夠形成“緩沖屏障”， 有效緩解Pb/Cd對(duì)植物細(xì)胞的界面毒害效應(yīng)， 這種有機(jī)物分泌及滲透作用的規(guī)律性變化有助于增強(qiáng)植物對(duì)Pb/Cd脅迫的適應(yīng)性和抗逆性[13]。 2 925 cm-1附近(T0)的飽和C—H吸收峰定位于2 923 cm-1處(T1和T2)， 峰形變化較小， 說(shuō)明Pb/Cd脅迫對(duì)地上部分的運(yùn)輸功能和細(xì)胞過(guò)氧化程度干擾很小。 1 637 cm-1處的特征峰值有所下降， 表明Pb/Cd脅迫導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鍵間氫鍵結(jié)合力減弱， 促進(jìn)了相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)合成， 這可能與金盞菊適應(yīng)Pb/Cd脅迫的自我調(diào)控過(guò)程有關(guān)[14]。 1 385 cm-1處(T0)的吸收峰分別移動(dòng)到1 383 cm-1(T1)和1 387 cm-1處(T2)， 推測(cè)細(xì)胞組織通過(guò)改變果膠質(zhì)和油脂的甲基化程度， 影響金盞菊幼苗對(duì)Pb/Cd的富集行為， 可以認(rèn)為是金盞菊對(duì)Pb/Cd脅迫的“直接排斥→逐步適應(yīng)→增強(qiáng)抗逆性”的動(dòng)態(tài)適應(yīng)過(guò)程。 此外， 在1 060和892 cm-1等處的波峰差異同樣暗示了糖類組分的調(diào)控貢獻(xiàn)[15]。

植物修復(fù)法是最有前途的重金屬污染場(chǎng)地修復(fù)技術(shù)之一， 在超富集植物篩選、 植物抗性馴化、 修復(fù)分子機(jī)制等方面有很大的發(fā)掘潛力[16]。 本研究初步揭示了Pb/Cd復(fù)合脅迫對(duì)金盞菊幼苗地下和地上部分FTIR光譜的影響； 但對(duì)于脅迫過(guò)程的應(yīng)答途徑和自我調(diào)控策略， 本文的說(shuō)服力還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。 因此， 下一步要對(duì)脅迫響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行深入解析， 擬將XAFS， MS， INNA等技術(shù)和金屬組學(xué)、 蛋白質(zhì)組學(xué)、 基因組學(xué)等方法學(xué)研究相結(jié)合， 全面識(shí)別Pb/Cd在金盞菊不同組織器官的微分布、 分子形態(tài)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 同時(shí)， 鑒于細(xì)胞壁是植物抵抗重金屬脅迫的首要屏障， 有必要深入研究植物細(xì)胞壁與重金屬富集的代謝通路和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制， 為超富集植物的基因改造和基因修飾提供微尺度證據(jù)。

3 結(jié) 論

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FTIR Analysis of Secondary Abiotic Stress Response of

CalendulaOfficinalisSeedlings to Lead and Cadmium in Multi-Contaminated Loess

FAN Chun-hui1, CHANG Min1, ZHANG Ying-chao2, GAO Ya-lin1

1. School of Environmental Science & Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi’an 710021, China

2. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China

As an environmentally-friendly technology attracting great attention from current researchers, phytoremediation is significant for site remediation contaminated by heavy metals. The plant will appear related physiological response to reduce direct harm caused by the stress of heavy metals. The microscale behavior is always multi-dimensional and difficult to detect. The advanced instruments are effective to resolve the scientific issues, while the related researches are seldom investigated. Takingcalendulaofficinalisseedlings as experimental samples, scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) were applied to compare the surface characteristics and functional groups variation, respectively. The response process and tolerance mechanism ofcalendulaofficinalisseedlings to lead and cadmium stress were further analyzed. The results showed: with the increasing concentration of lead and cadmium in loess, the calyptra ofcalendulaofficinalisseedlings become bending and wilting; the amount of root hairs decreases greatly while no significant variations of aerial parts are found on surface characteristics. The stress of lead and cadmium are responsible for the difference of FTIR spectra of Calendula officinalis seedlings. The peak absorbance at 3 573 cm-1decreases and the peak becomes more complex with the increasing contents of lead and cadmium. It might be the coordination effect between lead/cadmium and hydroxyl, which affects the synthesis and secretion of organic matters. The movement of C—H vibration peak is associated with the lipid oxidationwhile the changes at 1 631 and 1 574 cm-1suggest the protein component differences. The shifting peak at 1 385 cm-1might be associated with the methylation of pectin and lipid, and the behavior is positive for the adaption process ofcalendulaofficinalisseedlings to lead and cadmium stress. The FTIR spectra are effective to reveal the phytoremediation mechanism on heavy metals contamination in pedosphere.

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR);Calendulaofficinalis; Loess; Lead/cadmium stress

Jan. 20, 2015; accepted May 10, 2015)

2015-01-20，

2015-05-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21407103), 中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目 (2012M511968) 和陜西科技大學(xué)科研基金項(xiàng)目(2014xhbz-06)資助

范春輝, 1982年生, 陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院講師 e-mail: frank_van391@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)08-2442-05