Zn和EDTA對紫花苜蓿葉片光合特性的響應

代惠萍,趙　樺,賈根良,馮佰利

(1.陜西理工學院,陜西省資源重點實驗室,陜西 漢中　723001;2.陜西理工學院 生物科學與工程學院,陜西 漢中　723001;3.蘭州大學 生命科學學院,甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復重點實驗室,甘肅 蘭州　730000;4.西北農(nóng)林科技大學 理學院,

陜西 楊凌　712100;5.西北農(nóng)林科技大學,旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西 楊凌　712100)

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Zn和EDTA對紫花苜蓿葉片光合特性的響應

代惠萍1,2,3,趙樺2,賈根良4,馮佰利5

(1.陜西理工學院,陜西省資源重點實驗室,陜西 漢中723001;2.陜西理工學院 生物科學與工程學院,陜西 漢中723001;3.蘭州大學 生命科學學院,甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復重點實驗室,甘肅 蘭州730000;4.西北農(nóng)林科技大學 理學院,

陜西 楊凌712100;5.西北農(nóng)林科技大學,旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西 楊凌712100)

摘要：為了探索提高紫花苜蓿的抗鋅能力,以3個紫花苜蓿品種為試材,采用土培法,研究Zn脅迫(250 μg/kg)下,EDTA對不同品種紫花苜蓿葉片鋅富集量、光合色素含量及葉綠素熒光參數(shù)的影響。結(jié)果表明,在50 d時,紫花苜蓿葉片Zn的含量均顯著增高,Zn+EDTA顯著提高了苜蓿葉片對鋅的吸收;大葉苜蓿品種葉片光合色素的含量高于對照,大葉苜蓿葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量顯著高于其他2個品種;EDTA處理可提高大葉苜蓿初始熒光值、可變熒光、最大熒光值、最大光化學效率的水平。結(jié)果顯示,EDTA促進大葉苜蓿葉片的光合色素含量的增加,減少過剩激發(fā)能的耗散,提高光合電子傳遞效率,有效降低鋅脅迫對紫花苜蓿葉片PSⅡ的傷害,提高大葉苜蓿的抗鋅能力。

關(guān)鍵詞：鋅;EDTA;紫花苜蓿;葉綠素;葉綠熒光

隨著工業(yè)發(fā)展進程的加快,采礦、“三廢”等帶來的重金屬對土壤的污染日趨嚴重[1-3]。尤其是土壤鋅污染對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成的危害,備受人們關(guān)注[4]。植物修復是治理土壤重金屬污染常用技術(shù),具有治理成本的低廉性、治理過程的原位性以及治理效果的永久性等特點[5-6]。施加螯合劑可以促進土壤固相中重金屬的釋放,提高重金屬的生物有效性[7-13]。Liu 等[14]研究發(fā)現(xiàn),EDTA 的添加使金盞菊土壤Cd 的修復效率提高了217%。Cui 等[15]研究表明,施加螯合劑EDTA后植物中Pb 的累積濃度增加了2.5倍。張敬鎖等[16]報道,在土壤中添加EDTA,并不能增加水稻和小麥對Cd 的吸收,反而有所降低。關(guān)于EDTA螯合劑對土壤金屬元素溶解和植物吸收是促進還是抑制,目前尚存在爭議。

紫花苜蓿不僅是食品、飼料的重要來源,也在紡織、造紙等工業(yè)方面有著廣泛的用途[4]。Dai等[4]研究證實,紫花苜蓿對Zn具有較高的富集能力,其生物量大,生長周期長,抗干旱和病蟲害能力強,是一種潛在的、應用前景較好的重金屬污染土壤修復植物。隨著紫花苜蓿深加工的發(fā)展,污染的土壤上種植紫花苜蓿,收割后作為工業(yè)用途,避免紫花苜蓿體內(nèi)的重金屬進入食物鏈,對促進苜蓿產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展,保障環(huán)境安全具有重要的現(xiàn)實意義。本試驗通過添加外源EDTA,初步探討EDTA對Zn脅迫下紫花苜蓿葉片Zn積累量和光合色素積累的影響,解析紫花苜蓿在Zn脅迫下的生理響應與耐受機制,為螯合劑誘導植物修復Zn污染土壤提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試材料

供試材料為大葉苜蓿(Medicagosativassp.)、維多利亞(Vitoria Alfalfa)、阿爾岡金(Medicagosativacv.)3個紫花苜蓿品種。

供試土壤為陜西理工學院生物工程學院試驗地的園田土,采用園田土、草炭、蛭石,按照(3∶1∶1)的體積比充分混勻,自然風干,過2 mm 篩。然后取若干土樣做本底值測試,并將其余土分裝于塑料盆中。

1.2試驗設計

采用盆栽法,用25 cm×16 cm塑料盆,每盆土壤質(zhì)量約 2 kg,設置3個處理,6個重復,共 108盆。于2014年3月播種,選飽滿、無病蟲害苜蓿種子,用0.1%的HgCl2消毒10 min,每盆播種20粒,在自然光照條件下培養(yǎng),出芽15 d后間苗,每盆留15株長勢均勻的幼苗。植株生長期間用Hoagland營養(yǎng)液澆灌,苜蓿幼苗生長3個月后,向盆內(nèi)加入ZnSO4·7H2O和乙二胺四乙酸(EDTA)與去離子水配成母液,兩者母液均用去離子水配制，然后稀釋成所需的處理濃度,試驗共設置3個濃度的鋅處理,即0(CK)、250 μg Zn、250 μg Zn+10 μg/kg EDTA,溶液pH值用NaOH或HCl調(diào)至6.5。并一次性施入相應的盆栽土壤中。培養(yǎng)期間,采用稱重法,補充消耗的水分。分別在脅迫25,50 d時進行收獲,選擇生長基本一致的植株,每個處理收獲12株,將每株葉片分開,迅速用液氮速凍,保存于-80 ℃冰箱中,進行相關(guān)指標測定。

1.3測定項目與方法

1.3.1苜蓿鋅含量的測定分別在鋅脅迫25,50 d時進行收獲,每個處理取12株,將每株的葉片分開。葉片在80 ℃干燥48 h,粉碎成粉末,65% (m/V)HNO3消解,用原子吸收分光度計測定Zn含量[4]。

1.3.2葉綠素熒光參數(shù)的測定采用美國OPTI-sciences公司脈沖調(diào)制式葉綠素熒光儀(OS-30p,USA)測定,選擇成熟功能葉進行熒光參數(shù)測定。測量前,于7:00和12:00黑布遮光暗適應20 min,記錄紫花苜蓿葉片暗適應下的初始熒光值(Fo)和最大熒光值(Fm),并據(jù)此計算可變熒光和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學效率(Fv/Fm)[16]。

1.3.3光合色素含量的測定將葉片剪碎混勻,80%(m/V)丙酮浸提法[17]。葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量參照Dai等[18]方法計算。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 12進行統(tǒng)計分析。One-Way ANOVA方差分析比較不同處理間各項指標的差異,通過LSD法進行差異顯著性(P<0.05)分析。

2結(jié)果與分析

2.1EDTA對鋅脅迫下紫花苜蓿葉片鋅含量的影響

圖1可見,單一Zn脅迫條件下,隨著脅迫時間延長,參試紫花苜蓿葉片Zn含量呈增加趨勢,且Zn+EDTA復合處理下苜蓿葉片鋅含量有不同程度增加。在25 d時,Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫組分別增加了24.8%,14.1%,35.6%(P<0.05),在第50天時,Zn+EDTA復合處理紫花苜蓿葉片Zn的含量分別比單一Zn脅迫提高了7.0%,26.9%(P<0.05),2.5%(P>0.05)。

數(shù)據(jù)顯示為平均值±SE(n=6)。同一品種和同一處理不同時間的不同字母表示差異達0.05顯著水平(新復極差法)。圖2同。

2.2EDTA對鋅脅迫下紫花苜蓿葉片光合色素含量的影響

圖2-A、B顯示,單一Zn脅迫條件下,隨著脅迫時間延長,參試紫花苜蓿葉片Chl a和Chl b含量總體呈增加趨勢,且Zn+EDTA復合處理下苜蓿葉片Chl a和Chl b含量大部分增加。在25 d時,Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫Chl a和Chl b含量增加了7.2%和18.1%(大葉苜蓿)、6.5%和15.3%(阿爾岡金苜蓿)、1.5%(維多利亞苜蓿),而維多利亞苜蓿葉片Chl b含量降低了15.7%(P<0.05)。在50 d時,復合處理紫花苜蓿葉片Chl a和Chl b含量分別比單一Zn脅迫顯著提高了12.7%和11.8%(大葉苜蓿)，阿爾岡金苜蓿Chl a含量增加了4.6%，維多利亞Chl b含量增加了11.9%，而維多利亞苜蓿葉片Chl a含量降低了13.1%,阿爾岡金苜蓿葉片Chl b含量降低了8.9%(P<0.05)。表明EDTA顯著提高了大葉苜蓿葉片Chl a和Chl b積累的量。

圖2-C、D中所示,單一Zn脅迫條件下,隨著脅迫時間延長,參試紫花苜蓿葉片總?cè)~綠素(Chl a+b)和類胡蘿卜素(Car)含量總體呈增加趨勢,且Zn+EDTA復合處理下苜蓿葉片Chl a+b和Car含量有不同程度增加。在25 d時,Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫Chl a+b和Car含量增加了9.2%和11.8%(大葉苜蓿)、4.9%和10.7%(阿爾岡金苜蓿)、維多利亞苜蓿Car 增加了10.7%，而Chla+b降低了3.5%(P<0.05)。50 d時,復合處理紫花苜蓿葉片Chl a+b和Car含量分別比單一Zn脅迫顯著提高了12.5%和14.8%(大葉苜蓿)、1.2%和2.6%(阿爾岡金苜蓿),而維多利亞紫花苜蓿葉片Chla+b增加了0.4%，而Car含量降低了15.9%(P<0.05)。隨著脅迫時間延長,表明EDTA顯著提高了大葉苜蓿葉片Chl a+b和Car積累的量,進而有效地促進了Zn脅迫對光合色素合成。

2.3EDTA對鋅脅迫下葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表1可知，不同處理對紫花苜蓿葉片F(xiàn)o、Fv、Fm和Fv/Fm值的影響，在25 d時，單一Zn脅迫條件下，參試品種阿爾岡金與大葉苜蓿葉片F(xiàn)o、Fv和Fm均呈上升趨勢，維多利葉片F(xiàn)o呈逐漸增加趨勢，而Fv和Fm呈下降趨勢。Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫Fo、Fm和Fv值增加了6.0%3.6%和2.8%(大葉苜蓿)，阿爾岡金Fm和Fv值增加了3.5%和16.2%，而Fo值降低了2.1%，且維多利亞Fo、Fm和Fv值降低了35.3%，38.3%，39.2%，Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫Fv/Fm值降低了1.3%和1.3%(大葉苜蓿和維多利亞)，而阿爾岡金葉片F(xiàn)v/Fm增加了4.1%。在50 d時，Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫Fo、Fm、Fv和Fv/Fm值增加了5.4%，14.9%，18.1%，4.0%(大葉苜蓿)，阿爾岡金和維多利亞葉片F(xiàn)o、Fm、Fv和Fv/Fm值分別降低了37.9%，37.7%，37.6%，0和31.6%，41.8%，44.8%，5.2%。

圖2　EDTA對鋅脅迫下紫花苜蓿葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量的影響

時間/dTime品種Cultivars濃度ConcentrationFoFmFvFv/Fm25阿爾岡金CK303±3.5d1182±8.9e879±7.5gh0.74±0.08cZn335±7.1a1238±16.0de898±8.2g0.73±0.01cZn+EDTA328±6.7b1372±12.6b1044±7.3b0.76±0.03ab大葉苜蓿CK278±11.2f1277±11.1d999±8.9ef0.78±0.03aZn296±5.2e1279±13.5d983±8.1f0.77±0.04abZn+EDTA314±4.6c1325±13.6c1011±8.3e0.76±0.05ab維多利亞CK299±5.2de1410±9.1a1111±7.6a0.79±0.02aZn309±2.9d1396±11.2ab1087±5.8a0.78±0.05a

表1(續(xù))

注:數(shù)據(jù)顯示為平均值±SE(n=6)。同一品種不同字母表示在0.05水平有顯著差異;*.P≤0.05;**.P≤0.01;ns.不顯著。

Note:Data indicate means±SE(n=6).Different letters in same cultivars mean significant differences at 0.05 levels;*.P≤0.05;**.P≤0.01;ns.Not significant.

3討論

EDTA能增加土壤中重金屬的生物有效性,促進植物對重金屬的吸收,降低重金屬對土壤和植物的毒性[17,19]。添加EDTA能夠使Cu、Cd、Pb和Zn在燈心草和龍須草體內(nèi)的積累量顯著增加[17]。本試驗進一步證實,隨著脅迫時間延長,在50 d時,與單一鋅脅迫比較,EDTA提高了苜蓿葉片對鋅的吸收,表明EDTA可以促進植物對Zn的吸收,這與王紅新和邱莉萍[12,20]的研究結(jié)果相似。這可能是向土壤中施加螯合劑EDTA,活化了土壤中的重金屬,提高重金屬的生物有效性,促進植物吸收。

葉綠素是植物進行光合作用的重要物質(zhì),其含量的多少是衡量葉片生長狀況的重要指標[17]。王學鋒等[21]研究表明,EDTA的添加促進了茼蒿的生長,使茼蒿中的葉綠素含量增加。在本試驗中也驗證了這一點。在50 d后,Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫組苜蓿葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量呈不同程度增加趨勢。與不同品種相比較,大葉苜蓿葉片綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量顯著高于維多利亞和阿爾岡金。說明EDTA的添加對苜蓿未產(chǎn)生毒害且使土壤中Zn受EDTA絡合,更易被苜蓿吸收,而Zn對葉綠素合成有重要的影響。

葉綠素熒光動力學技術(shù)在探測逆境對光合作用影響方面具有獨特的作用,能夠反映光合系統(tǒng)“內(nèi)在性”特點[18,22]。其Fv/Fm值作為葉綠素熒光重要指標之一,通常在脅迫條件下此指標降低程度表明PSⅡ遭受到破壞程度。單一Zn脅迫條件下,與不同品種相比較,大葉苜蓿葉片F(xiàn)o、Fv和Fm均呈逐漸上升趨勢,Zn+EDTA復合處理比單一Zn脅迫組苜蓿初始熒光值、可變熒光、最大熒光值、最大光化學效率均呈不同程度增加。本研究表明,EDTA促進大葉苜蓿葉片的光合色素含量的增加,減少過剩激發(fā)能的耗散,提高光合電子傳遞效率,有效降低鋅脅迫對紫花苜蓿葉片PSⅡ的傷害,提高大葉苜蓿的抗鋅能力。

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Responses to Zn and EDTA Chelating Agents on Photosynthesis Characteristics of Alfalfa Leaves

DAI Huiping1,2,3,ZHAO Hua2,JIA Genliang4,FENG Baili5

(1.Shaanxi University of Technology,Shaanxi Province Key Laboratory of Bio-resources,Hanzhong723001,China;2.College of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong723001,China;3.College of Life Sciences,Lanzhou University,Gansu Key Laboratory of Biomonitoring and Bioremediation for Environmental Pollution,Lanzhou730000,China;4.College of Science,Northwest A&F University,Yangling712100,China;5.Northwest A & F University,State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling712100,China)

Abstract：In order to explore the effective avenue on improving alfalfa(Medicage sativa L.)resistant ability under zinc stress,pot experiments were used to study the effect of EDTA on zinc accumulation,photosynthetic pigment content and chlorophyll fluorescence under zinc stress in different alfalfa leaves of three cultivars Medicago sativa ssp.,Vitoria Alfalfa and Medicago sativa cv..The results of this study indicated that the zinc contents in three cultivar leaves were significantly higher than that in control group.Compared with zinc stress alone,the addition of EDTA strikingly enhanced the zinc absorption in leaves.In comparison with different cultivars,photosynthetic pigment content in Medicago sativa ssp.was higher than that in control group.After EDTA treatment,the contents of chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoids were 12.7%,11.8%,12.5%,14.8% of Medicago sativa ssp.respectively,which were remarkably higher than that in the other two cultivars.Fo,Fv,Fm and Fv/Fm levels were increased by 5.4%,14.9%,18.1%,4.0% of Medicago sativa ssp.with the treatment of EDTA.Our research indicated that EDTA was able to promote the accumulation of photosynthetic pigment,reduce the dissipation of excessive excitation energy,improve the transmission efficiency of photosynthetic electron,and minimize the damages to alfalfa leaves PSⅡ caused by zinc stress effectively,all of which coherently boosted resistance capability to zinc in Medicago sativa ssp.cultivar.As the results suggested,EDTA with the appropriate concentration at 10 μg could coefficient alleviate the damage of Zinc stress to Medicago sativa ssp.,reduce dissipation of excess excitation and improve photochemical electron transport efficiency and efficiently protect from PSⅡ damage,EDTA obviously promoted the Zinc resistance of Medicago sativa ssp.under Zinc stress.

Key words:Zinc;Ethylene diamine tetraacetic acid;Medicage sativa L.;Chlorophyll;Chlorophyll fluorescence

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.019

中圖分類號：S551.01

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0114-06

作者簡介：代惠萍(1972-),女,陜西武功人,副教授,博士,主要從事植物逆境生理學、植被恢復理論與技術(shù)研究。

基金項目：陜西省教育廳重點項目(15JS019);陜西省自然基金項目(2015JM3086);甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復重點實驗室開放基金項目(GBBL2015006)；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510720570)；陜西省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(1970)；陜西理工學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(UIRP15034)；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510720570)

收稿日期：2016-02-14