小麥Ta-SKP2A克隆及其酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建

許　媛,李鈴仙,魏春茹,魏新燕,于秀梅,劉大群

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定　071001;2.河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北 保定　071001;3.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定　071001;4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北 保定　071001)

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小麥Ta-SKP2A克隆及其酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建

許媛1,3,李鈴仙1,3,魏春茹1,3,魏新燕4,于秀梅1,2,3,劉大群2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定071001;2.河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北 保定071001;3.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001;4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北 保定071001)

摘要：SKP2A是調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子降解的F-box蛋白。為研究該蛋白在小麥-葉銹菌互作過(guò)程的作用,首先克隆獲得中國(guó)春小麥Ta-SKP2A全長(zhǎng)序列,然后將其與pGBKT7載體連接,轉(zhuǎn)入酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體,并檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞有無(wú)毒性和自激活效應(yīng)。結(jié)果表明,Ta-SKP2A編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 146 bp,其ORF區(qū)編碼一條由382個(gè)氨基酸組成的多肽。在ORF區(qū)兩側(cè)連接酶切位點(diǎn)(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ),并將其與載體pGBKT7連接,成功構(gòu)建了包含目的基因的誘餌載體pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重組誘餌質(zhì)粒的酵母菌株在 SD/-Trp 營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上生長(zhǎng)良好,其過(guò)夜培養(yǎng)物OD600>0.8,表明重組誘餌質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性。含重組誘餌質(zhì)粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上不能生長(zhǎng),表明誘餌質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物不能自激活報(bào)告基因。成功構(gòu)建了一個(gè)包含Ta-SKP2A的重組誘餌質(zhì)粒,為深入篩選與其互作的靶蛋白,研究其在小麥-葉銹菌互作體系中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥;F-box基因SKP2A;誘餌載體構(gòu)建;毒性檢測(cè);自激活效應(yīng)

F-box蛋白是SCF(Skp/Cullin/F-box)復(fù)合體中泛素連接酶E3的關(guān)鍵組分,最初因發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞周期蛋白Cyclin F 而得名[1]。據(jù)報(bào)道,植物中存在較多的F-box蛋白,使其成為植物中最大的蛋白質(zhì)家族之一。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)1 000多個(gè)F-box蛋白[2];水稻(Oryzasativa)中鑒定了687個(gè)F-box蛋白[3];耐旱耐瘠薄的作物谷子中發(fā)現(xiàn)了525個(gè)[4];鷹嘴豆中發(fā)現(xiàn)了285個(gè)F-box基因[5]。但目前作為重要糧食作物之一的小麥,其中F-box家族基因存在數(shù)量尚不明確,因此,急需深入挖掘小麥中的F-box家族基因成員,為研究其功能奠定基礎(chǔ)。

F-box蛋白在植物中具有重要的生理功能,廣泛參與到植物生長(zhǎng)發(fā)育[6]、激素信號(hào)傳導(dǎo)[7-8]、花器官發(fā)育[9]、自交不親和[10]及抵抗生物和非生物逆境的脅迫反應(yīng)中[11-12]。關(guān)于F-box家族基因功能的報(bào)道多見(jiàn)于水稻和擬南芥,而在小麥中的功能研究較少。在擬南芥中,F-box蛋白MORE AXILLARY GROWTHY2(MAX2)有助于植物抵抗病原菌的侵染,max2突變體能夠增加葉片的氣孔導(dǎo)度,從而促進(jìn)病原菌進(jìn)入植物的質(zhì)外體中[13]。 Zhou等[14]在小麥中鑒定出一個(gè)耐干旱基因TaFBA1,在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)表達(dá)TaFBA1,與野生型相比,植株表現(xiàn)出耐干旱的表型,抗氧化酶的活性增強(qiáng),表明超表達(dá)TaFBA1有助于一些抗氧化基因的上調(diào)表達(dá),從而調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱的耐性。秘彩莉等[15]對(duì)小麥中的耐鹽相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和分析,獲得了一條參與小麥鹽耐受性的F-box基因TaUBA。在小麥的根中,該基因的表達(dá)受鹽脅迫的抑制,而在小麥葉片中,TaUBA的表達(dá)只在脅迫早期受鹽的抑制,在脅迫晚期(24 h后)其表達(dá)又逐漸增強(qiáng)。由此可見(jiàn),F-box基因參與了小麥逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程。然而,與F-box基因互作的上游和下游因子以及具體的生理生化過(guò)程還有待于深入研究。

SKP2A是一個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白,包含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域和LRR結(jié)構(gòu)域。該蛋白至少控制著兩類(lèi)細(xì)胞分裂轉(zhuǎn)錄因子E2FC和DPB的穩(wěn)定性[16-17]。為研究該蛋白在小麥-葉銹菌互作過(guò)程中的作用,本研究利用受葉銹菌侵染的小麥幼葉為試材,首先克隆獲得包含完整ORF區(qū)的F-box蛋白基因Ta-SKP2A,然后構(gòu)建包含該基因的誘餌載體,并進(jìn)行毒性及自激活活性檢測(cè),旨在為進(jìn)一步從小麥酵母雙雜交文庫(kù)中篩選到與其互作的靶蛋白,進(jìn)而揭示其在小麥-葉銹菌互作過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用供試小麥品種為中國(guó)春(簡(jiǎn)稱CS)。于小麥一葉一心期接種葉銹菌05-19-43②。接種12 h后剪取葉片,液氮速冷后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2主要試劑

酵母菌株Y187及pGBKT7克隆載體均購(gòu)自Clontech公司;E.coliDH5α購(gòu)自TianGen公司;pGEM-T easy載體購(gòu)自Promega 公司;Biozol RNA提取試劑購(gòu)自BioFlus公司;SD/-Trp DO Supplement、SD/-Leu/-Trp DO Supplement、SD/-Leu/-Trp/-His DO Supplement、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade DO Supplement、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4Ligase均購(gòu)自 Promega 公司;BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit均購(gòu)自 TaKaRa 公司;質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自博邁德生物公司;Taq聚合酶購(gòu)自北京澤星生物科技有限公司;胰蛋白胨(Tryptone)購(gòu)自O(shè)XOID公司;酵母無(wú)氨基酸氮源、酵母提取物(Yeast extract)均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成采用Biozol法提取小麥葉片總RNA,cDNA第一鏈的合成按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物,北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物名稱及序列見(jiàn)表1。

表1　PCR引物序列及參數(shù)

1.3.3小麥Ta-SKP2A基因的克隆以Ta-SKP2A-S和Ta-SKP2A-AS為引物,以上述cDNA為模板擴(kuò)增Ta-SKP2A基因,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;然后95 ℃,30 s,66 ℃,30 s,72 ℃,90 s,9個(gè)循環(huán);95 ℃,30 s,61 ℃,30 s,72 ℃,90 s,24個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,預(yù)期目的條帶經(jīng)膠回收純化后,與pGEM-T easy載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑及抗生素抗性篩選后,隨機(jī)挑取10個(gè)白色克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,選取3個(gè)陽(yáng)性克隆委托北京中科希林測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4pGEM-Ta-SKP2A的構(gòu)建與鑒定以上述獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,以Ta-SKP2A-EcoRⅠ-S和Ta-SKP2A-BamHⅠ-AS 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性 95 ℃ 5 min;95 ℃ 50 s,61.2 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增后獲得的目的片段經(jīng)純化后與pGEM-T easy載體4 ℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆,經(jīng)菌落PCR初步鑒定后送北京中科希林測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。1.3.5pGBKT7-Ta-SKP2A的構(gòu)建與鑒定EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-Ta-SKP2A和pGBKT7空載體,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,回收目的基因片段和載體片段,以目的基因片段和載體片段3∶1的比例連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素(Kana,50 μg/mL)抗性篩選陽(yáng)性克隆。從平板中挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中(Kana,50 μg/mL),37 ℃ 240 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

醋酸鋰法制備酵母菌感受態(tài)細(xì)胞Y187,按照Clontech公司酵母轉(zhuǎn)化手冊(cè)進(jìn)行操作,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布SD/-Trp平板,倒置培養(yǎng)3 d至單菌落長(zhǎng)出。按照酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取酵母質(zhì)粒,以酵母質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.6誘餌重組質(zhì)粒對(duì)Y187的毒性檢測(cè)將構(gòu)建成功的誘餌載體轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中,將其涂布SD/-Trp平板上,30 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜,觀察菌落形態(tài)和大小。從SD/-Trp平板中挑取一個(gè)較大的單克隆菌落,接種于SD/-Trp/Kan(50 μg/mL)的液體培養(yǎng)基中,30 ℃條件下250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(16～24 h),紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)菌液OD600值。

1.3.7誘餌重組質(zhì)粒自激活活性檢測(cè)將含有重組誘餌質(zhì)粒的Y187酵母菌株分別涂布在 SD/-Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade的平板上,30 ℃倒置培養(yǎng)7 d,觀察菌落生長(zhǎng)情況。如果所構(gòu)建的誘餌載體有自激活作用,則含誘餌質(zhì)粒的Y187菌可在SD/-Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Leu/-Trp/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長(zhǎng),否則只能在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1Ta-SKP2A基因的克隆

Biozol法提取的受葉銹菌侵染的小麥葉片總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果如圖1-A,所提取RNA包含25S rRNA、18S rRNA、16S rRNA、9S rRNA和5.8S rRNA 5條帶,表明總RNA完整性較好。進(jìn)一步通過(guò)分光光度法測(cè)定,OD260/280比值為1.9～2.0,OD260/230比值為1.85～2.00,表明RNA質(zhì)量較好,蛋白質(zhì)和其他有機(jī)物以及無(wú)機(jī)離子的污染很少。

A.小麥總RNA電泳圖。B.小麥Ta-SKP2A基因擴(kuò)增；

以受葉銹菌05-19-43②侵染的中國(guó)春小麥葉片cDNA第一鏈為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,1 000 bp以上可見(jiàn)單一條帶,與目的條帶大小相近(圖1-B)。所獲序列經(jīng)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該序列ORF區(qū)長(zhǎng)度為1 146 bp,編碼一條由382個(gè)氨基酸組成的多肽,將該多肽與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記的同源性較高的蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)編碼的蛋白與烏拉爾圖小麥、二穗短柄草、短花藥野生稻、粟、荷花、海棗、芝麻、雷蒙德式棉同源性分別為98%,89%,84%,79%,73%,72%,68%,66%(NJ法)。禾谷類(lèi)作物的F-box蛋白同源性較高(圖2),表明F-box蛋白在進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化比較慢。

2.2目的基因Ta-SKP2A編碼區(qū)的擴(kuò)增

利用添加酶切位點(diǎn)的特異引物對(duì)包含Ta-SKP2A基因的pGEM T-easy質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增后,獲得一條大小為1 280 bp的片段(圖3),經(jīng)測(cè)序比對(duì),所擴(kuò)增片段編碼區(qū)與Ta-SKP2A編碼區(qū)序列完全一致,在編碼區(qū)兩側(cè)成功添加了EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ 2個(gè)酶切位點(diǎn),且插入方向正確。

Ta-SKP2A.小麥-SKP2A；Tu-SKP2A.烏拉爾圖小麥-SKP2A；Bd-SKP2A.二穗短柄草-SKP2A；Si-SKP2A.粟-SKP2A；Ob-SKP2A.短花藥野生稻-SKP2A；Pd-SKP2A.海棗-SKP2A；Nn-SKP2A.蓮-SKP2A；Si-SKP2A.芝麻-SKP2A；Gr-SKP2A.雷蒙德氏棉-SKP2A。

Ta-SKP2A.Triticumaestivum-SKP2A；Tu-SKP2A.Triticumurartu-SKP2A；Bd-SKP2A.Brachypodiumdistachyon-SKP2A；Si-SKP2A.Setariaitalica-SKP2A；Ob-SKP2A.Oryzabrachyantha-SKP2A；Pd-SKP2A.Phoenixdactylifera-SKP2A；Nn-SKP2A.Nelumbonucifera-SKP2A；Si-SKP2A.Sesamumindicum-SKP2A；Gr-SKP2A.Gossypiumraimondii-SKP2A.

圖2Ta-SKP2A系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig.2Phylogenetic tree of Ta-SKP2A amino acid

M.DNA Marker 2000；1～5.Ta-SKP2A的ORF區(qū)擴(kuò)增。

2.3酵母穿梭載體pGBKT7-Ta-SKP2A的構(gòu)建

將EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切后的pGBKT7和目的基因Ta-SKP2A經(jīng)過(guò)T4DNA連接酶連接,然后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng),卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆,隨機(jī)挑取單克隆搖菌培養(yǎng)16 h,提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切后獲得約7.3 kb和1 160 bp的2條帶,與預(yù)期載體片段和目的片段大小一致,測(cè)序結(jié)果表明插入的核苷酸序列正確,表明誘餌載體構(gòu)建成功,命名為pGBKT7-Ta-SKP2A(圖4)。提取該重組質(zhì)粒后再將其轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187,利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定,獲得與預(yù)期大小一致的目的條帶,測(cè)序結(jié)果與以前完全一致,表明誘餌載體pGBKT7-Ta-SKP2A已成功轉(zhuǎn)入Y187酵母菌中。

M.DNA Marker DL10000;1.誘餌載體

2.4誘餌載體pGBKT7-Ta-SKP2A毒性檢測(cè)

pGBKT7-Ta-SKP2A酵母誘餌載體在SD/-Trp平皿中經(jīng)7 d的培養(yǎng)后,菌落布滿平皿,長(zhǎng)勢(shì)良好。單菌落經(jīng)過(guò)夜振蕩培養(yǎng)20 h后,OD600吸光度值為2.088,數(shù)值遠(yuǎn)大于0.8,表明誘餌重組質(zhì)粒對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性,證明載體構(gòu)建成功,為下一步酵母雙雜交篩選靶蛋白奠定了基礎(chǔ)。

2.5酵母穿梭載體自激活活性檢測(cè)

含有pGBKT7-Ta-SKP2A誘餌載體的Y187酵母菌株在 SD/-Trp平板中可以正常生長(zhǎng),而在SD/-Trp/-Leu平板、SD/-Leu/-Trp/-His平板以及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板中不能生長(zhǎng),證明pGBKT7-Ta-SKP2A酵母穿梭載體自身不能夠激活報(bào)告基因的表達(dá),無(wú)自激活活性(圖5)。

A.SD/-Trp一缺培養(yǎng)基；B.SD/-Leu/-Trp二缺培養(yǎng)基；C.SD/-Leu/

3討論與結(jié)論

F-box蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其通過(guò)參與SCF復(fù)合體的形成,特異性識(shí)別泛素化底物蛋白[18-19],從而實(shí)現(xiàn)對(duì)泛素化蛋白的降解。據(jù)報(bào)道,該家族蛋白參與了小麥抵抗白粉病菌的侵染[20],但F-box蛋白是否參與小麥抵抗葉銹菌侵染過(guò)程,以及通過(guò)何種途徑參與,目前尚未可知。為此,本研究對(duì)受葉銹菌侵染的小麥中F-box基因進(jìn)行克隆,并構(gòu)建其酵母雙雜交誘餌載體,為篩選與其互作的靶蛋白,研究其參與的抗病代謝網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

本研究在受葉銹菌侵染的小麥中成功獲得了一條F-box基因Ta-SKP2A,其序列長(zhǎng)度為1 280 bp,編碼382個(gè)氨基酸,該基因與中國(guó)春小麥的近緣種屬烏拉爾圖小麥、二穗短柄草、短花藥野生稻等的同源性均很高。該基因的獲得一方面豐富了人們對(duì)小麥中F-box基因的認(rèn)識(shí),同時(shí)也為下一步明確該基因的組織表達(dá)特性、與葉銹菌侵染的相關(guān)性及其參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)等奠定了基礎(chǔ),對(duì)揭示該基因所編碼的蛋白在小麥生長(zhǎng)發(fā)育及抗葉銹菌侵染中的作用機(jī)理具有重要的意義。

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及功能的有效手段[21-22]。在植物F-box家族蛋白的互作靶蛋白篩選中發(fā)揮重要作用。Qiao等[23-24]利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到金魚(yú)草的S位點(diǎn)編碼的F-box蛋白AhSLF-S(2)與S-RNases有直接相互作用,AhSLF-S(2)還與金魚(yú)草的ASK1(Arabidopsis Skp1-like 1)以及Cullin 1 類(lèi)蛋白相互作用,推測(cè)它們可能形成復(fù)合體SCFAhSLF-S(2)。此外,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與擬南芥F-box 蛋白At5g22700和At3g16740互作的靶蛋白,其N(xiāo)端F-box結(jié)構(gòu)域都與擬南芥ASK 家族成員有相互作用,因而推測(cè)At5g22700蛋白和At3g16740蛋白都是SCF復(fù)合物的家族成員[25-26]。COI1是植物中第一個(gè)被證實(shí)具有抗病功能的F-box蛋白,Chini等[27]利用酵母雙雜交技術(shù)篩選到JA阻遏蛋白(Jasmonate ZIM domain protein,JAZ)是SCFCOI1E3泛素連接酶的直接靶蛋白,并且與 COI1 互作。SCFCOI1通過(guò)識(shí)別JA的活性形式Jasmonoyl-isoleucine(JA-Ile)來(lái)促進(jìn) JAZ 的降解,從而激活 JA 防御途徑[28]。

酵母雙雜交系統(tǒng)中,誘餌蛋白若有自激活作用則會(huì)激活報(bào)告基因的表達(dá)造成假陽(yáng)性的結(jié)果[29-30]。誘餌載體的表達(dá)產(chǎn)物若對(duì)酵母菌產(chǎn)生毒性,則導(dǎo)致酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)。本研究中將含有誘餌載體的Y187酵母菌進(jìn)行劃線以及搖菌培養(yǎng),在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)良好,且在搖菌20 h以內(nèi),OD600值超過(guò)0.8,表明pGBKT7-Ta-SKP2A誘餌載體對(duì)Y187酵母菌無(wú)毒性;另外,自激活活性檢測(cè)結(jié)果表明所構(gòu)建的誘餌表達(dá)載體不能激活酵母的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。本試驗(yàn)獲得了一條1 280 bp包含完整ORF區(qū)的小麥Ta-SKP2A基因,并成功構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-Ta-SKP2A,為篩選小麥中與之互作的靶蛋白,明確其參與的抗/感病性途徑奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Construction of Yeast Two-hybrid Bait Vector of WheatTa-SKP2AGene

XU Yuan1,3,LI Lingxian1,3,WEI Chunru1,3,WEI Xinyan4,YU Xiumei1,2,3,LIU Daqun2

(1.College of Life Sciences,Agricultural University of Hebei,Baoding071001,China;2.Biological Control Centre of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province,Baoding071001,China;3.Key Laboratory of Hebei Province for Molecular Plant-Microbe Interaction,Baoding071001,China;4.National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas,Agricultural University of Hebei,Baoding071001,China)

Abstract：SKP2A is an F-box protein that regulates the proteolysis of cell cycle transcription factors.In order to understand the role of SKP2A in the interaction between wheat and leaf rust pathogen,a full-length sequence of Ta-SKP2A was firstly obtained from wheat cv.China Spring,and ligated with pGBKT7 vector.Recombinant vector was transformed into yeast Y187 competent cell,further detected its self-activated activity and toxicity effect for yeast cells.Results showed that Ta-SKP2A was 1 146 bp and encoded a polypeptide of 382 amino acids.The ORF with restriction enzyme sites of BamH I and EcoR I was inserted into expression vector pGBKT7.The results showed that the bait vector pGBKT7-Ta-SKP2A was successfully constructed by sequencing.The recombinant bait plasmid grew well on SD/-Trp plate,which showed that the bait plasmid was not toxic to yeast cell.The yeast strains containing bait plasmid couldn′t grow on SD/-Leu/-Trp,SD/-Leu/-Trp/-His and SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade plate,so the bait plasmid didn′t have transcriptional activation.A recombinant bait plasmid with Ta-SKP2A was successfully constructed,which would lay foundation for screening for targeted protein interacted with Ta-SKP2A,and would help to understand its function in the interaction of wheat and leaf rust pathogen.

Key words:Wheat;F-box gene Ta-SKP2A;Construction of bait vector;Toxicity detection;Transcriptional activation

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.004

中圖分類(lèi)號(hào)：Q784

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0017-06

作者簡(jiǎn)介：許媛(1987-),女,河北滄州人,在讀碩士,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。通訊作者：劉大群(1958-)，男，河北靈壽人，教授，博士，主要從事植物病害生物防治和分子植物病理學(xué)研究。于秀梅(1976-)，女，黑龍江肇源人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301649);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20121302120010)

收稿日期：2016-02-11