PEDV亞單位疫苗免疫增強劑的篩選

陳　瑾,黃春娟,于曉明,侯立婷,喬緒穩(wěn),鄭其升,侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院,國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京　210014;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州　225009)

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PEDV亞單位疫苗免疫增強劑的篩選

陳瑾1,2,黃春娟1,2,于曉明1,2,侯立婷1,2,喬緒穩(wěn)1,2,鄭其升1,2,侯繼波1,2

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院,國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京210014;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州225009)

摘要：為了研究PEDV的新型亞單位疫苗,提高PEDV亞單位疫苗的免疫原性,選取免疫增強劑CVC1302、CVC1303與國家獸用生物制品工程技術研究中心構(gòu)建的可溶性表達PEDV S蛋白核心表位COE的重組蛋白(pQZ-COE-LTB)混合乳化制成疫苗,免疫4周齡的ICR小鼠,首免14 d后加免1次,隨后采集首免14(加強免疫前),21,28,55 d的小鼠血清,分別用瓊擴試驗的方法定性檢測血清IgG抗體以及用ELISA試劑盒定量檢測小鼠血清IgG抗體滴度動態(tài)變化,腸組織sIgA抗體滴度。結(jié)果表明,重組蛋白與 CVC1303配合使用免疫小鼠能產(chǎn)生顯著高于滅活苗(CV777)陽性對照組的IgG和sIgA抗體水平,說明CVC1303免疫增強劑能有效增強該重組蛋白的免疫原性,提高亞單位疫苗免疫效果。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;核心抗原表位;免疫增強劑;免疫效力

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的以嘔吐、腹瀉脫水和對哺乳仔豬致死率高為特征的一種高度接觸性豬腸道傳染病,PEDV在全球很多地區(qū)普遍流行[1-3]。由于PEDV 具有難以適應細胞的培養(yǎng)特性,目前市場上針對該病的疫苗均為CV777毒株生產(chǎn)的滅活苗和弱毒苗。2011年該病再次在我國大規(guī)模流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[4]。毒株的變異,特別是S基因的變異[5-6],現(xiàn)有疫苗不能提供足夠的免疫保護是引起此次流行的主要原因。S蛋白是PEDV編碼蛋白中的一種結(jié)構(gòu)蛋白,它能把病毒粒子吸附在宿主細胞受體上,通過膜融合滲進細胞中,刺激宿主誘導產(chǎn)生中和抗體,具有PEDV抗原的作用。PEDV的核心表位(COE)存在于S蛋白的編碼基因中,被認為是PEDV的亞單位疫苗的重要靶標抗原[7-10]。所以本試驗針對PEDV的變異毒株,選取含有中和表位的S蛋白的COE區(qū)域,進行亞單位疫苗的設計,并選用實驗室可溶性表達載體進行蛋白的可溶性表達,重組蛋白的可溶性表達方便后期蛋白的純化,為快速研制高效、實用的PEDV新型疫苗奠定基礎。

大腸桿菌不耐熱性腸毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)是一種由大腸桿菌分泌的熱不穩(wěn)定腸毒素,LT的B型亞單位(LTB)是其結(jié)合部位。LTB具有與LT相似的黏膜免疫原性和黏膜免疫佐劑活性[11-13],可在多種表達系統(tǒng)中表達[14],而且無致瀉毒性,是黏膜疫苗研究的一個重要目標蛋白。綜上所述,利用COE的核心表位和LTB的黏膜免疫佐劑,開發(fā)一種高效、安全、價廉的PEDV亞單位疫苗具有十分重要的現(xiàn)實意義。

免疫增強劑CVC1302(ZL201310042983.0)與CVC1303(2014105765620)是由國家獸用生物制品工程與技術研究中心豬用新型疫苗課題組自行研制,已經(jīng)證明與多種豬用疫苗聯(lián)用可以提高疫苗的免疫效果和抗體持續(xù)期,如豬圓環(huán)病毒、豬口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒等。已在南京、丹陽、浙江等多家豬場進行推廣試驗,取得很好的效果。

本試驗選取實驗室原核表達的pQZ-COE-LTB/BL21蛋白,將PEDV的主要保護性抗原S基因中保守的中和表位區(qū)(COE基因)以Linker與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位相連,克隆入原核表達載體pQZ,獲得可溶性的重組蛋白。重組蛋白制苗后皮下免疫小鼠表現(xiàn)良好的免疫原性[15],首免14 d時就能高于滅活苗對照組的抵抗PEDV的免疫水平,但免疫持續(xù)期較短。本試驗進一步篩選出能有效增強重組蛋白免疫原性的免疫增強劑,為PEDV新型疫苗的開發(fā)提供更好的選擇和思路。

1材料和方法

1.1抗原、佐劑

PEDV滅活毒株CV777由國家獸用生物制品工程技術研究中心提供;佐劑為實驗室自購的白油司本、吐溫;免疫增強劑為CVC1302和CVC1303。

1.2主要試劑及儀器

PEDV ELISA抗體檢測試劑盒購于哈爾濱動物生物制品國家工程技術研究中心有限公司;小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于Axy GEN公司;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑、PMD-19-T vector、DH5α感受態(tài)細胞、DL Marker、10×Loading Buffer、6×SDS protein Loading Buffer及相關試劑購于TaKaRa公司;PVDF膜購于MILLIPORE公司;HRP標記羊抗豬二抗購于KPL公司;DAB顯色液,HRP羊抗鼠二抗購于生興公司;其他試劑均為分析純。HZ-9210k型臺式冷凍搖床為華利達公司產(chǎn)品;VCX800型超聲破碎儀來自美國SONICS公司。

1.3抗原準備

1.3.1pQZ-COE-LTB/BL21質(zhì)粒的構(gòu)建選取PEDV TX株S蛋白COE (S基因的 499～638aa 區(qū)域)目標抗原,同時以Linker與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位相連,克隆入原核表達載體pQZ,獲得重組表達載體pQZ-COE-LTB。1.3.2pQZ-COE-LTB/BL21重組蛋白的表達誘導表達一批重組菌pQZ-COE-LTB/BL21,超聲破碎,離心12 000 r/min 10 min,取上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。在制備疫苗前對上清液進行SDS-PAGE分析和Western Blot鑒定,確保上清液中存在精確的重組蛋白。

1.4疫苗制備

超聲破碎后鑒定好的重組菌pQZ-COE-LTB/BL21上清液2份(前2份分別添加每頭份量為0.5 μL的CVC1302和CVC1303)、PEDV滅活毒株CV777和空載體菌株pQZ/BL21為抗原,與白油佐劑1∶2混合乳化制苗(表1)。

表1　疫苗的制備

1.5動物分組、免疫

從南京醫(yī)科大學實驗動物中心購入4 周齡ICR小鼠40 只。隨機分為5 組,每組8 只,分別標記為B1、B2、B3、B4、B5組。B1組為重組蛋白與免疫增強劑CVC1302配合使用組;B2組為重組蛋白與免疫增強劑CVC1303配合使用組;B3組為單獨用重組蛋白組;B4組為不含重組蛋白的空載體對照組;B5為CV777滅活苗陽性對照組。按0.2 mL/只的免疫劑量免疫4周齡的ICR小鼠,14 d后加免1次(表2)。

表2　試驗動物分組及免疫

1.6血清IgG抗體定性檢測

取首免后第21,28,55 天的小鼠血樣,離心分離到的血清,保存于-20 ℃?zhèn)溆?。取毒價為7.5的PEDV CV777病毒液作為抗原加入中央孔,試驗動物組B1～B5組第21,28,55 天的血清混樣作為待檢樣,PBS作為空白對照。將20 μL抗原加入中心孔,20 μL未經(jīng)稀釋的待檢血清混樣加入周圍孔;待孔內(nèi)液體滲入凝膠后置于濕盒中,再將濕盒置于37 ℃溫箱中保溫5～6 h,觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。

1.7血清IgG抗體動態(tài)變化檢測

取首免后21,28,55 d的小鼠血樣,離心分離到的血清,取每組的血清混樣作為待檢血清。用PEDV ELISA抗體檢測試劑盒檢測。

1.8腸組織sIgA抗體變化

捕殺首免55 d后小鼠,每只小鼠取0.2 g小腸組織于研缽中,向研缽中倒入液氮,冷凍研磨腸組織至粉末狀后再次天平稱重,按1∶10比例加入PBS混勻后離心,取同組上清液等比例混合做混樣,作為待檢樣品用小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測腸組織sIgA抗體滴度。具體操作步驟如下:使用前將試劑盒恢復至常溫,對標準品按說明書要求稀釋;根據(jù)待檢樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需板條數(shù),每個標準品和空白孔做復孔;空白孔只加顯色劑A&B和終止液,標準品孔加入50 μL標準品和50 μL鏈霉素-HRP,待檢樣品孔加入40 μL樣品、10 μL抗-sIgA抗體和50 μL鏈酶親和素-HRP,蓋上封板膜,輕輕振蕩混勻,37 ℃溫育1 h;將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用;小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復5 次,拍干;每孔先加入50 μL顯色劑A,再加入50 μL顯色劑B,輕輕振蕩混勻,37 ℃避光顯色10 min;每孔加50 μL終止液終止反應;以空白孔調(diào)零,450 nm波長依序測量各孔的OD值。測定應在加終止液后10 min內(nèi)進行;根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

2結(jié)果與分析

2.1抗原準備

2.1.1pMD-COE-LTB克隆載體酶切鑒定分別用NdeⅠ和BamHⅠ對構(gòu)建的pMD-COE-LTB質(zhì)粒進行雙酶切,經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到大小約為834 bp的片段,與預期結(jié)果一致。測序結(jié)果也表明插入序列與設計的序列100%相同,閱讀框正確(圖1)。

1.重組質(zhì)粒對照;2～6.經(jīng) NdeⅠ和 BamHⅠ雙

2.1.2pQZ-COE-LTB表達載體酶切鑒定構(gòu)建的pQZ-COE-LTB質(zhì)粒用NdeⅠ和BamHⅠ酶切,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到大小約為834 bp的片段,與預期結(jié)果相符(圖2)。

2.1.3重組蛋白表達及可溶性分析重組質(zhì)粒pQZ-COE-LTB轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中,通過誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析,重組菌比對照菌pQZ/BL21明顯多出1條條帶,大小約為30 kDa,與預期設計相符合(圖3)。

1.對照質(zhì)粒pQZ-COE-LTB;2～5.經(jīng) NdeⅠand BamHⅠ

1.IPTG誘導的空菌 pQZ/BL21;2～3.IPTG

對經(jīng)誘導表達的重組菌反復凍融后超聲破碎,取pQZ/BL21菌,誘導前重組菌,誘導后全菌,破碎后上清和破碎后沉淀進行SDS-PAGE分析,結(jié)果誘導后全菌和破碎后上清中明顯存在目的條帶30 kDa,而沉淀中未出現(xiàn)目的條帶(圖4)。說明誘導表達到的pQZ-COE-LTB蛋白為可溶性蛋白。

2.1.4重組蛋白Western Blot鑒定取對照菌pQZ1/BL21和重組菌破碎后上清進行SDS-PAGE電泳后進行Western Blot鑒定。發(fā)現(xiàn)加含重組菌的上清樣出現(xiàn)單一的特異性很強的條帶,大小約為30kDa,而對照菌pQZ1/BL21未產(chǎn)生任何條帶,與預期相符(圖5)。說明重組蛋白獲得表達,且該蛋白能被PEDV抗體特異性識別,具有較好的抗原性。

1.IPTG誘導的空菌 pQZ/BL21;2.未經(jīng)IPTG誘導的

1.超聲破碎后的pQZ-COE-LTB/BL21 上清;2.IPTG 誘導的

2.2瓊擴試驗定性檢測血清IgG抗體

首免后第21 天,加有血清樣品的孔均未產(chǎn)生白色免疫沉淀線(圖6-A);28 d時,重組蛋白與CVC1303混合組和滅活苗(CV777)陽性對照組產(chǎn)生白色免疫沉淀線,且前者白色沉淀線更明顯(圖6-B);55 d時,同28 d時觀察到的結(jié)果類似(圖6-C)。

A,B,C.瓊擴試驗檢測免疫后21,28,55 d血清。

2.3血清IgG抗體效價的變化

首次免疫后第14 天，重組蛋白+CVC1303組的血清IgG濃度(0.119±0.012 μg/mL)顯著高于其他組(P<0.05)，重組蛋白+CVC1302組(0.093±0.008 μg/mL)與重組蛋白組之間差異不明顯，但這兩者均顯著高于CV777陽性對照組(0.059±0.003 μg/mL)；首免后第21，28，55 天，重組蛋白+CVC1303組的血清IgG濃度均顯著高于其他組(P<0.05)(圖7)。

不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖8同。

2.4腸組織sIgA抗體的變化

首次免疫后第55 天撲殺小鼠,重組蛋白+CVC1303組的腸組織sIgA(387±11.032a)顯著高于其他組(P<0.05);CV777陽性對照組(307.4±7.987b)顯著高于重組蛋白+CVC1302組、重組蛋白組和陰性對照組(P<0.05);重組蛋白組(215.6±4.332c)與重組蛋白+CVC1302組差異不顯著;重組蛋白+CVC1302(208.5±6.435c)組顯著高于陰性對照組(130.5±8.003d)(P<0.05)(圖8)。

圖8　五組小鼠腸組織sIgA效價的變化

3討論

亞單位疫苗以重組或純化蛋白和合成肽為基礎,與含有許多免疫成分的完整生物疫苗相比,反應原性低且免疫原性也很低,通常需要佐劑輔助來增強和引導亞單位疫苗特異性免疫。本試驗利用大腸桿菌原核表達的蛋白,以可溶性存在,省去了對包涵體的處理要先變性溶解后再進行復性,才能得到溶解的具有活性的蛋白,且復性后蛋白活性容易降低[16],由于單獨構(gòu)建表達到的重組蛋白抗原免疫小鼠產(chǎn)生的免疫原性持續(xù)時間較短,選擇合適的佐劑與重組蛋白合用就變得十分有意義。本試驗成功篩選出免疫增強劑CVC1303,與重組蛋白配合免疫產(chǎn)生了非常有效的小鼠血清IgG抗體和小鼠黏膜sIgA抗體,能有效地增強抗原的全身局部黏膜反應,有效地增強了重組蛋白的免疫原性,為該亞單位疫苗進一步進行的豬體試驗奠定了良好的基礎。

近年來PEDV在我國流行趨勢不減反增[17],目前預防PEDV感染主要采用的疫苗為滅活苗或弱毒疫苗。傳統(tǒng)疫苗在防治PED時遇到的問題越來越多,現(xiàn)有滅活疫苗接種劑量大、成本高、免疫期短、細胞免疫作用弱、產(chǎn)生完全免疫力需2周,不能用于緊急預防,而弱毒疫苗存在成本高、易返祖、有潛在感染危險等缺陷,且隨著2008年以后毒株的變異導致毒力增強,對仔豬致病力增強[18],現(xiàn)有常規(guī)疫苗不能對其產(chǎn)生足夠的免疫保護。且PEDV病毒的細胞適應能力差,研究針對流行毒株的傳統(tǒng)疫苗周期長。因此，研制新型的安全、有效果、成本低及保存使用方便的基因工程疫苗迫在眉睫。其中亞單位疫苗[19]不含病毒核酸等感染性組分,具有無需滅活、無致病性、安全性極高等優(yōu)點,是PED 基因工程疫苗中最有前景的疫苗。本試驗針對PEDV S蛋白的COE并進行密碼子優(yōu)化后用Linker連接[20-21]LTB構(gòu)建的亞單位疫苗,在免疫增強劑的協(xié)同作用下,產(chǎn)生了比現(xiàn)有滅活疫苗更好的免疫效果,并篩選出能有效增強重組蛋白免疫原性的免疫增強劑CVC1303,可將重組蛋白與CVC1303有效結(jié)合開發(fā)出一種新型PEDV疫苗。

參考文獻：

[1]朱迪國,宋建德,袁麗萍,等.2013-2014年全球豬流行性腹瀉重大疫情分析[J].中國動物檢疫,2014,31(10):42-46.

[2]Chen Q,Li G,Stasko J,et al.Isolation and characterization ofPorcineepidemicdiarrheavirusesassociated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States[J].Journal of Clinical Microbiology,2014,52(1):234-243.

[3]Temeeyasen G,Srijangwad A,Tripipat T,et al.Genetic diversity of ORF3 and spike genes ofPorcineepidemicdiarrheavirusin Thailand[J].Infection,Genetics and Evolution:Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases,2014,21:205-213.

[4]李龍.2011年冬哺乳仔豬病毒性腹瀉最新流行情況[J].養(yǎng)豬,2012,21(2):96-96.

[5]張志,董雅琴,劉爽,等.我國部分省份豬流行性腹瀉的流行病學監(jiān)測[J].中國動物檢疫,2014,31(10):47-51.

[6]鄭逢梅,霍金耀,趙軍,等.2010-2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進化分析[J].病毒學報,2013,29(2):197-205.

[7]Nguyen-Xuan Huy,Sae-Hae Kim,Moon-Sik Yang,et al.Immunogenicity of a neutralizing epitope fromPorcineepidemicdiarrheavirus:M cell targeting ligand fusion protein expressedin transgenic rice calli[J].Plant Cell Rep,2012,31(10):1933-1942.

[8]楊榕,顧超逸,李郁,魏建忠等.豬流行性腹瀉病毒COE基因的原核表達和免疫原性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2013,40(6):955-958.

[9]滿坤,楊兵,覃湘婕,等.豬流行性腹瀉病毒中和抗原表位基因的原核表達、純化及免疫原性鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013,11:26-29.

[10]向敏,張潔,高其雙,等.豬流行性腹瀉病毒COE核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J].中國獸醫(yī)學報,2013,33(11):1627-1630.

[11]李鵬,王家鄉(xiāng),陳碧軍.仔豬大腸桿菌病 K88-K99-987P-F41 四價亞單位疫苗的研制Ⅳ[J].疫苗生產(chǎn)與免疫效力試驗,2006,27(9):55-58.

[12]Rosales-Mendoza S,Soria-Guerra R E,De Jesús Olivera-Flores M T,et al.Expression ofEscherichiacoliheat-labile enterotoxin b subunit(LTB)in carrot(DaucuscarotaL.)[J].Plant Cell Reports,2007,26(7):969-976.

[13]郭鷹,鄒全明,朱永紅,等.Balb/c小鼠口服幽門螺桿菌疫苗rLTB-HspA的免疫應答[J].免疫學雜志,2004,20(3):201-203,207.

[14]陳明,李超,王瑞,等.大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位在畢赤酵母中的表達及鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學報2010,23(6):2093-2097.

[15]Ricci S,Medaglini D,Rush C M,et al.Immunogenicity of the B monomer ofEscherichiacoliheat-labile toxin expressed on the surface ofStreptococcusgordonii[J].Infect Immun 2000;68(2):760-766.

[16]霍軍,宋予震,董青.豬流行性腹瀉病毒流行毒株COE基因的原核表達及免疫原性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(9):34-36.

[17]李龍.2011年冬哺乳仔豬病毒性腹瀉最新流行情況[J].養(yǎng)豬,2012,21(2):96.

[18]Park S,Kim H,Song D,et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis ofPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)field isolates in Korea[J].Archives of Virology,2011,156(4):577-585.

[19]焦茂興,吳鋒,劉德輝,等.豬流行性腹瀉病毒重組腺病毒疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫試驗[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(2):11-16.

[20]Tae-Jin Kang,So-Chon Han,Moon-Sik Yang,et al.Expression of synthetic neutralizing epitope ofPorcineepidemicdiarrheavirusfused with synthetic B subunit ofEscherichiacoliheat-labile enterotoxin in tobacco plants[J].Protein Expression and Purification,2006,46(1):16-22.

[21]Tae-Jin Kang,Young-Sook Kim,Yong-Suk Jang,et al.Expression of the synthetic neutralizing epitope gene ofPorcineepidemicdiarrheavirusin tobacco plants without nicotine[J].Vaccine,2005,23(17-18):2294-2297.

Screening the Immune Enhancer ofPorcineepidemic

diarrheavirusSubunit Vaccine

CHEN Jin1,2,HUANG Chunjuan1,2,YU Xiaoming1,2,HOU Liting1,2,QIAO Xuwen1,2,ZHENG Qisheng1,2,HOU Jibo1,2

(1.Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,National Research Center of and Technology Veterinary Biologicals Engineering,Nanjing210014,China;2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,Yangzhou225009,China)

Abstract：This study successfully constructed pQZ-COE-LTB expression vector and expressed the soluble recombinant protein,which was chosen for PEDV subunit vaccine candidate.In order to enhance the immunogenicity of the PEDV subunit vaccine,we selected CVC1302 and CVC1303 as immune enhancer,combined with PEDV subunit vaccine.Immunize 4-week-old ICR mice,second immunize conducted after 14 d,then collected the 14,21,28,55 d mouse serum after first immune.Agar diffusion test and ELISA kits of detection of serum IgG antibody levels,intestinal tissue sIgA levels were conducted.The results showed that PEDV subunit vaccine combined with CVC1303 immune enhancer group produced significantly higher levels of IgG and sIgA antibodies than CV777 inactivated vaccine positive control group,indicating CVC1303 immune enhancer can effectively enhance the immunogenicity of the PEDV subunit vaccine.

Key words:PEDV;COE;Immune enhancer;Immunogenicity

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.033

中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0205-06

作者簡介：陳瑾(1983-),女,黑龍江齊齊哈爾人,助理研究員,碩士,主要從事豬用型疫苗研究。通訊作者：鄭其升(1979-),男,山東濰坊人,副研究員,博士,主要從事豬用新型疫苗研究。侯繼波(1960-),男,山東德州人,研究員,博士,主要從事獸用生物制品研究。

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(15)1062);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303046)

收稿日期：2016-02-18