阿爾巴斯絨山羊iPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的優(yōu)化

邰大鵬,乃門塔娜,諾明途,王　瀟,梁　浩,劉東軍

(內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動物生殖生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特　010021)

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阿爾巴斯絨山羊iPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的優(yōu)化

邰大鵬,乃門塔娜,諾明途,王瀟,梁浩,劉東軍

(內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動物生殖生物學(xué)及生物技術(shù)教育部重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特010021)

摘要：阿爾巴斯絨山羊多潛能干細胞(giPSCs)在遺傳育種方面有重要的應(yīng)用價值，然而目前還沒有完善的giPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系。為了獲得穩(wěn)定的giPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系，根據(jù)培養(yǎng)基中添加的血清和小分子化合物的不同,構(gòu)建了5組不同的培養(yǎng)基體系,分別觀察了giPSCs在不同培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)、增殖能力以及重編程效率,并檢測了不同組giPSCs的多潛能性,最后分析了不同小分子化合物的組合對giPSCs重編程效率和干細胞標(biāo)記基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清的添加更適合giPSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng),小分子化合物Vc、VPA和LiCL能有效促進giPSCs的生成和自我更新。這為完善而穩(wěn)定的絨山羊iPSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的建立奠定了基礎(chǔ),并且為阿爾巴斯絨山羊胚胎干細胞的建系提供了試驗平臺。

關(guān)鍵詞：阿爾巴斯絨山羊;iPSCs;誘導(dǎo)及培養(yǎng)基體系;小分子化合物

誘導(dǎo)性多潛能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是指把胚胎干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入成體細胞,使細胞重編程為類似于胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)的多潛能干細胞[1]。iPSCs的誘導(dǎo)效率非常低,極易分化,因此對培養(yǎng)環(huán)境的要求非常高,需要飼養(yǎng)層細胞和細胞因子的輔助[2]。一個完善的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系可有效提高iPSCs的誘導(dǎo)效率,并能維持其自我更新和增殖能力[3-4]。而其中添加的血清以及細胞因子是決定培養(yǎng)基功效的關(guān)鍵因素,極大地影響著培養(yǎng)基的功能,例如,培養(yǎng)基中添加LIF才能維持小鼠iPSCs的自我更新;無bFGF培養(yǎng)基不能維持人iPSCs的多潛能性[5-6]。但這些并不能解決重編程效率低的問題。

隨著iPS技術(shù)的迅猛發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)一些小分子化合物不僅可以提高iPSCs的重編程效率,而且能促進其自我更新和增殖能力[7]。它們有些是通過抑制組蛋白甲基化、促進乙?；韧緩礁淖兗毎谋碛^遺傳狀態(tài)而促進細胞重編程;有些是通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號通路而促進細胞重編程。總之,他們使重編程細胞更接近ESCs,更好地激活內(nèi)源的多能性基因,使得培養(yǎng)條件更加完善[8-10]。

阿爾巴斯絨山羊是我國優(yōu)良家畜品種,建立穩(wěn)定的阿爾巴斯絨山羊iPSCs體系不但可以為相關(guān)學(xué)科的發(fā)展提供理論依據(jù),同時在其遺傳育種方面也具有十分重要的應(yīng)用價值。然而,絨山羊iPSCs(Goat iPSCs,giPSCs)的誘導(dǎo)及建系非常困難,對其培養(yǎng)條件的探究也較少,所獲得的細胞或增殖速度過于緩慢,或很難維持多能性,且還沒有嵌合體的產(chǎn)生[11-13]。目前,人們普遍把人或小鼠ESCs培養(yǎng)體系直接應(yīng)用于山羊ESCs和iPSCs中,但并沒有研究證實過這些培養(yǎng)體系完全適用于giPSCs的生成,更沒有驗證過giPSCs上是否有培養(yǎng)基中添加的細胞因子(例如:LIF、bFGF)的受體。這些因子是否有作用以及起什么作用都沒有被驗證過[14-15]。本試驗參考Vc(Vitamin C)、VPA(Valproic acid)和LiCl (Lithium chloride)等[16-19]小分子促進iPSCs重編程的相關(guān)報道,在培養(yǎng)基中添加不同的血清和小分子化合物,構(gòu)建5組不同的培養(yǎng)基體系,優(yōu)化giPSCs的誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件,為建立完善而穩(wěn)定的giPSCs培養(yǎng)體系提供試驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞(Goat fatal fibroblasts,GFFs)的培養(yǎng)

待阿爾巴斯絨山羊自然受孕40 d后,經(jīng)手術(shù)從子宮中取出完整的羊胎兒(帶羊水),將胎兒在75%的乙醇中短暫浸洗消毒后剝除羊膜,用D-PBS(Hyclone)溶液清洗2～3遍。在超凈工作臺中,從初具雛形的胎兒背部剪下部分組織,在60 mm 培養(yǎng)皿中,用無菌眼科手術(shù)剪剪碎,加入0.05% Trypsin-EDTA(Gibco)消化5～7 min,加入含有10% FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)培養(yǎng)液終止消化。將懸液移入細胞培養(yǎng)皿中,置于恒溫細胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2飽和濕度)中培養(yǎng)24 h后換液。后期培養(yǎng)中隔天換液,培養(yǎng)過程中經(jīng)常觀察成纖維細胞生長狀態(tài),待細胞長至皿底85%的匯合度時對細胞做傳代培養(yǎng)。

1.2飼養(yǎng)層的制備

鋪于100 mm培養(yǎng)皿的2～5代的絨山羊胎兒成纖維細胞待覆蓋皿底85%時,用終濃度為10 μg/mL的含有絲裂霉素C(MMC)的培養(yǎng)液處理細胞2～5 h。去除培養(yǎng)液,D-PBS清洗細胞5次,再用0.05% Trypsin-EDTA消化1 min,加入完全培養(yǎng)液終止消化,收集細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入完全培養(yǎng)基,制成細胞懸液。對細胞懸液進行計數(shù),調(diào)整細胞濃度,將細胞懸液以1.5×104～2.0×104個/cm2的密度接種于鋪有0.1%明膠(Sigma)的培養(yǎng)皿中,置于37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,即可接種干細胞。

1.3慢病毒載體的包裝及感染胎兒成纖維細胞

包被病毒的載體系統(tǒng)包括VS3G、gag及主載體(鼠源性的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)。100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細胞,皿中85%的細胞匯合時做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。36 h后收集上清液,置于4 ℃冰箱,培養(yǎng)皿中再次加入10 mL 培養(yǎng)基,24 h后第2次收集上清。將2次上清毒液混合后,以1 000 r/min離心5 min,收集上清,用0.45 μm的濾器過濾,以1 mL/管凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞

絨山羊胎兒成纖維細胞以5×104/孔的密度接種于24孔板中,加入1 mL 混合病毒培養(yǎng)液(病毒上清液Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc各150 μL,加400 μL培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h,重復(fù)感染3次。去除病毒混合液,D-PBS清洗細胞3次,0.05% trypsin-EDTA消化細胞后加入完全培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心5 min,做細胞計數(shù),按每孔5×104的細胞數(shù)接種于鋪有飼養(yǎng)層的6孔板中,加入不同ESCs培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色鑒定

阿爾巴斯絨山羊iPSCs傳代培養(yǎng)后的第8天,將待檢測的iPSCs 用PBS漂洗3次,加入4%多聚甲醛固定2～5 min,用PBS沖洗2次后加入預(yù)先混合調(diào)配好的AP染色工作液,常溫避光染色30 min后移去染色工作液,加入一定量的PBS后即可上鏡觀察。

1.6五組不同giPSCs培養(yǎng)基體系的設(shè)計

配置5組不同giPSCs培養(yǎng)基體系,培養(yǎng)基Ⅰ:20% KSR(Gibco)+Knock-out DMEM(Gibco)+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol(Millipore)+1% NEAA(Nonessential amino acid,Gibco)+2 mmol/L glutaMAX(Gibco)+1 ng/mL mLIF;培養(yǎng)基Ⅱ:20% FBS(Gibco)+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF;培養(yǎng)基Ⅲ:20% FBS+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF+5 ng/mL Vc(Sigma);培養(yǎng)基Ⅳ:20% FBS+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF+5 ng/mL VPA(Sigma),病毒感染后的第5～12天用5 mmol/L的LiCL(Sigma)處理細胞;培養(yǎng)基Ⅴ:FBS+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF+5 ng/mL Vc+5 ng/mL VPA,第5～12天用LiCl處理細胞。28 d后統(tǒng)計酶5×104個細胞中AP陽性克隆數(shù),用第5代的細胞做實時定量PCR檢測。

1.7干細胞標(biāo)志基因的RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)和qPCR(Quantitative polymerase chain reaction)檢測

待新傳代的iPSCs生長至第7天,收取阿爾巴斯絨山羊iPSCs于無酶管中,依照“RNeasy Plus Micro Ki”(Qiagen)試劑盒說明書提取總RNA,用“Thermo Scientific”反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄,獲得樣品的總cDNA。PCR反應(yīng)體系:取總cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL(2 μmol/L);應(yīng)體系:94 ℃預(yù)變性5 min；之后94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min共計30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物(表1)。qPCR反應(yīng)時取反轉(zhuǎn)錄物2 μL,正反向引物各,0.5 μL(2 μmol/L),SYBR Premix Ex Taq 10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,之后95 ℃ 5 s;60 ℃ 31 s,共計40個循環(huán),加溶解曲線(表2)。

表1　RT-PCR基因引物序列表

表2　qPCR基因引物序列表

1.8干細胞標(biāo)記抗原的免疫熒光檢測

將iPSCs傳代接種于有蓋玻片的鋪好滋養(yǎng)層的24孔培養(yǎng)板中,待iPSCs生長至第7 天,可見iPSCs貼附于載玻片上生長,用D-PBS洗細胞3遍,4%多聚甲醛固定細胞30 min,再用0.1% Triton-X 100/PBS室溫通透10～15 min,然后用0.4% BSA/PBS 漂洗3次,每次6～8 min。每孔加入500 mL山羊封閉血清,30 min后去除封閉上清液,加入已配置好的一抗稀釋液(OCT4、SOX2、NANOG、 abcom)于4 ℃孵育過夜,次日去除剩余一抗液體,用0.4% BSA/PBS清洗3次,每次6～8 min。對應(yīng)一抗分別加入相應(yīng)的已配置好的二抗稀釋液(abcom)于室溫孵育1 h,棄去二抗上清,加入0.4% BSA/PBS清洗3次,每次5 min。最后加入DAPI(Sigma)染色劑稀釋液染色3 min,棄去剩余稀釋液,PBS清洗3次,小心取出蓋玻片后扣封蓋玻片于載玻片上,共聚焦顯微鏡下拍片觀察。

1.9類胚體形成(Embryoid bodies,EBs)的檢測

取生長狀態(tài)良好的iPSCs,用D-PBS漂洗2～3次,加入Accutase(Stem cell)消化液3～4 min,加入knoc kout DMEM+20% FBS的培養(yǎng)液終止消化,離心再加入培養(yǎng)基懸浮細胞使其形成單細胞懸液。60 mm培養(yǎng)皿蓋上滴細胞懸液后扣回皿蓋制作成懸滴。皿中添入適當(dāng)?shù)腜BS緩沖液,懸滴培養(yǎng) 8～10 d后,收集懸滴觀察是否形成類胚體,并做RT-PCR檢測[20]。

2結(jié)果與分析

2.1giPSCs的產(chǎn)生及AP染色鑒定

GFFs經(jīng)病毒3次感染后(即重編程第4 天),接入鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中,加入5種不同的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。在培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中,約感染后的第12天,可觀察到細胞形態(tài)產(chǎn)生改變,增殖速度增快,把細胞消化成單個細胞接種至新的飼養(yǎng)層上,約第18 天可見到山羊ESCs樣的克隆,即山羊誘導(dǎo)性多潛能干細胞(giPSCs、giPSCsⅠ、giPSCsⅡ、giPSCsⅢ)。giPSCs克隆呈橢圓,邊緣明顯,與小鼠ESCs相似。

重編程第23天,可見giPSCs克隆明顯增大,挑選部分克隆,Accutase酶消化成單個細胞后傳代擴增培養(yǎng),約9 d傳代一次。giPSCsⅠ傳代極易分化,只能傳至4～5代;giPSCsⅡ傳代易分化,可傳至7～8代;giPSCsⅢ可以穩(wěn)定傳至15代。對第23 天的giPSCs克隆AP染色后發(fā)現(xiàn),giPSCsⅠ、giPSCsⅡ不易被染色,染色較淺,AP陽性克隆較少;giPSCsⅢ染色較深,AP陽性克隆較多(圖1-A、B、C,表3)。

在培養(yǎng)基Ⅳ、Ⅴ中,約重編程第15天,可見細胞形態(tài)改變,增殖速度加快,傳代換飼養(yǎng)層后,第23 天才可初次見到giPSCs克隆(giPSCsⅣ、giPSCsⅤ)。重編程第28 天,可見細胞克隆明顯增大,可挑選克隆并傳代擴增培養(yǎng),約10 d傳代一次。對第25 天的giPSCs做堿性磷酸酶染色后發(fā)現(xiàn),giPSCsⅣ、giPSCsⅤ易被染色,染色較深,AP陽性克隆多。giPSCsⅣ和giPSCsⅤ均可傳至15代以上,克隆形態(tài)清晰,邊緣整齊不易分化(圖1-D、E、表3)。

A1.重編程后第18 天的giPSCsⅠ克隆;A2.重編程后第23天的giPSCsⅠ克隆;A3.第5代已分化的giPSCsⅠ克隆;A4.重編程后第23 天的AP陽性giPSCsⅠ克??；B1.重編程后第18天的giPSCsⅡ克隆;B2.重編程后第23天的giPSCsⅡ克隆;B3.第7代已分化的giPSCsⅡ克隆;B4.重編程后第23天的AP陽性giPSCsⅡ克??；C1.重編程后第18天的giPSCsⅢ克隆;C2.重編程后第23天的giPSCsⅢ克隆;C3.第15代的giPSCsⅢ克隆;C4.重編程后第23 天的AP陽性giPSCsⅢ克?。籇1.重編程后第23天的giPSCsⅣ克隆;D2.重編程后第28 天的giPSCsⅣ克隆;D3.第15代的giPSCsⅣ克隆;D4.重編程后第28天的AP陽性giPSCsⅣ克?。籈1.重編程后第23天的giPSCsⅤ克隆;E2.重編程后第28天的giPSCsⅤ克隆;E3.第15代的giPSCsⅤ克隆;E4.重編程后第28天的AP陽性giPSCsⅤ克隆。標(biāo)尺,200 μm。

A1.The reprogrammed giPSCsⅠon day 18;A2.The reprogrammed giPSCsⅠon day 23;A3.The differentiated giPSCsⅠon passage of 5;A4.The AP positive giPSCsⅠon day 23.B1.The reprogrammed giPSCsⅡon day 18;B2.The reprogrammed giPSCsⅡon day 23;B3.The differentiated giPSCsⅡon passage of 7;B4.The AP positive giPSCsⅡon day 23.C1.The reprogrammed giPSCsⅢon day 18;C2.The reprogrammed giPSCsⅢon day 23;C3.The giPSCsⅢon passage of 15;C4.The AP positive giPSCsⅢon day 23.D1.The reprogrammed giPSCsⅣon day 23;D2.The reprogrammed giPSCsⅣon day 28;D3.The giPSCsⅣon passage of 15;D4.The AP positive giPSCsⅣon day 28.E1.The reprogrammed giPSCsⅤon day 23;E2.The reprogrammed giPSCsⅤon day 28;E3.The giPSCsⅤon passage of 15;E4.The AP positive giPSCsⅤon day 28.Scale bars,200 μm.

圖1giPSCs的生成

Fig.1The generation of giPSCs

2.2giPSCs克隆形成率的統(tǒng)計

病毒感染后的細胞分別培養(yǎng)于培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中,28 d后統(tǒng)計每5×104個細胞中AP陽性克隆數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基Ⅰ中培養(yǎng)的細胞可平均形成(4.6±1.2)個陽性克隆。培養(yǎng)基Ⅱ中培養(yǎng)的細胞可平均形成(10.3±2.1)個陽性克隆。培養(yǎng)基Ⅲ中培養(yǎng)的細胞可平均形成(17.5±1.3)個陽性克隆。培養(yǎng)基Ⅳ的培養(yǎng)的細胞可平均形成(24.8±2.1)個陽性克隆。培養(yǎng)基Ⅴ中培養(yǎng)的細胞可形成平均(28.9±0.8)個陽性克隆(表3、圖2)。綜合上述結(jié)果,培養(yǎng)基Ⅴ比較適合誘導(dǎo)培養(yǎng)giPSCs。

表3　giPSCs生成統(tǒng)計表

圖2　不同培養(yǎng)基中AP陽性giPSCs克隆的統(tǒng)計

2.3giPSCs的多潛能性標(biāo)記基因的RT-PCR及實時定量PCR檢測

收集第3代的不同培養(yǎng)基中生成的giPSCs,提取總RNA做RT-PCR檢測。結(jié)果顯示,giPSCsⅠ、giPSCsⅡ、giPSCsⅢ、giPSCsⅣ、giPSCsⅤ中均有外源性基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和內(nèi)源基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表達。電泳結(jié)果揭示,5組giPSCs中外源基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc均高表達,每組間的表達差異不大。內(nèi)源基因的表達上,giPSCsⅠ、giPSCsⅡ中的內(nèi)源基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表達明顯低于其他3組(圖3)。

對第3代不同組的giPSCs分別做實時定量PCR,檢測干細胞標(biāo)記基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表達水平,以GFFs為陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),giPSCsⅠ中4種基因的表達量非常低,其中OCT4和NANOG的表達水平特別低,這與其易分化相應(yīng)。giPSCsⅡ中各基因的表達量雖有提高,但還是處于低表達水平,giPSCsⅡ仍不能長期傳代培養(yǎng)。giPSCsⅢ中4種基因的表達量均高于前2組。giPSCsⅣ中各基因的表達量均顯著高于iPSCsⅡ中的,并高于giPSCsⅢ中的表達,其中OCT4和SOX2基因的表達水平提高得非常顯著。giPSCsⅤ中基因OCT4、SOX2、NANOG的表達量均高于其他4組(圖4)。由此認為,培養(yǎng)基Ⅴ適合giPSCs的誘導(dǎo)及培養(yǎng)。

圖3　giPSCs的多能性標(biāo)記基因的RT-PCR檢測

2.4giPSCs的免疫熒光檢測

采用細胞免疫熒光檢測第5代的giPSCsⅡ、giPSCsⅢ、giPSCsⅣ、giPSCsⅤ克隆的胚胎干細胞特性標(biāo)記蛋白。結(jié)果顯示,4組giPSCs中,胚胎干細胞特性標(biāo)記蛋白OCT4、SOX2、NANOG均呈陽性。這表明giPSCsⅡ～Ⅴ均已有ESCs的多能性標(biāo)記蛋白的表達,具有多潛能性(圖5)。

圖4　giPSCs的OCT4、SOX2、NANOG和 KLF4等基因的qPCR檢測

標(biāo)尺,100 μm。圖6同。Scale bars,100 μm.The same as Tab.6.

2.5giPSCs的類胚體形成

用無mLif、Vc、VPA的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)第5代的giPSCsⅡ、giPSCsⅢ、giPSCsⅣ、giPSCsⅤ,8 d后可見類胚體細胞團(圖6)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示EBs中分別有內(nèi)胚層標(biāo)記基因SOX17,外胚層標(biāo)記基因MEF2C和中胚層標(biāo)記基因PAX6的表達。這顯示所形成的類胚體具有三胚層分化,即giPSCsⅡ～Ⅴ體外均有多向分化潛能(圖7)。

3討論

體外維持多潛能干細胞的多潛能性和自我更新的分子機制一直是研究熱點,也正是對其機制的不了解成為誘導(dǎo)和培養(yǎng)iPSCs的阻礙[21-23]。而且,與其ESCs相似,iPSCs的形態(tài)、增殖能力和相應(yīng)的分子機制也有種屬差異[24]。比如人和小鼠的iPSCs的形態(tài)和自我更新的分子機制都有明顯的差異。相比于人和小鼠,giPSCs比較難獲得,其相關(guān)分子機制的研究更是甚少。目前還未建立針對絨山羊ESCs和iPSCs的培養(yǎng)基體系。

A.giPSCsⅡ自分化形成的EBs;B.giPSCsⅢ自分化形成的EBs;C.giPSCsⅣ自分化形成的EBs;D.giPSCsⅤ自分化形成的EBs。

A.The giPSCs Ⅱ differentiated into Embryoid bodies;B.The giPSCs Ⅲ differentiated into Embryoid bodies;C.The giPSCs Ⅳ differentiated into Embryoid bodies;D.The giPSCs Ⅴ differentiated into Embryoid bodies.

圖6giPSCs分化形成三胚層分化的類胚體形成圖

Fig.6The giPSCs differentiated into Embryoid

bodies of all three germ layersinvitro

圖7　EBs的三胚層標(biāo)記基因的RT-PCR檢測

對于常規(guī)細胞的體外培養(yǎng),血清是不可或缺的培養(yǎng)基成分之一。然而,血清的成分不明確,容易引起多潛能干細胞的分化。這影響著血清在干細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。目前,人和小鼠的iPSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)中大多使用成分明確的無血清培養(yǎng)基。由于對絨山羊ESCs和iPSCs的研究較少,其分子機制不清楚,giPSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)基還不能缺少血清。本試驗中也發(fā)現(xiàn),血清替代物或無血清培養(yǎng)基還不能滿足giPSCs的體外培養(yǎng)條件,這可能是因為血清中存在不知名成分對iPSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)起到關(guān)鍵作用[12,20]。本研究中所獲得的giPSCs形態(tài)上與小鼠ESCs相似,同時發(fā)現(xiàn),與小鼠ESCs培養(yǎng)條件相似的培養(yǎng)基體系更適合誘導(dǎo)培養(yǎng)giPSCs。研究發(fā)現(xiàn),giPSCs的培養(yǎng)基體系中必須要添加LIF因子。LIF能有效抑制giPSCs的分化,并維持其自我更新,而bFGF并沒有明顯的作用。

近年來,越來越多的研究報道一些小分子化合物,如抗氧化劑、甲基化抑制劑及信號通路抑制劑顯著提高重編程效率,有效維持iPSCs的多能性[7,25-26]?，F(xiàn)有報道只用小分子化合物能夠誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞重編程形成iPSCs[27]。本研究選擇了Vc、VPA和LiCL 3種小分子,對giPSCs的重編程條件進行優(yōu)化。其中,Vitamin C是有機小分子,可以抗細胞衰老,降低細胞中活性氧的水平[16],從而提高重編程效率;VPA是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑,它可以提高某些基因的乙?；?從而提高基因的表達水平[18];LiCL鹽中的Li+是一種治療神經(jīng)紊亂疾病的藥物,可以調(diào)節(jié)一些胞內(nèi)信號通路來提高重編程效率[19]。

本試驗中發(fā)現(xiàn),Vc和VPA能有效提高giPSCs的重編程效率,提高內(nèi)源的干細胞標(biāo)記基因的表達水平。另外,與Vc相比,VPA能顯著提高內(nèi)源基因OCT4和SOX2的表達水平,而對基因KLF4和c-MYC并沒有特別明顯的作用。LiCl的作用與VPA相似,對基因OCT4和SOX2的作用明顯。因此,將二者協(xié)同應(yīng)用在同一種培養(yǎng)基中,其重編程效果優(yōu)于只添加Vc的培養(yǎng)基。然而,培養(yǎng)基中添加VPA和LiCL,雖然增強了giPSCs的自我更新能力,卻延長了細胞的重編程時間,所幸沒有影響到giPSCs的增殖能力。本試驗未能解釋清楚此類現(xiàn)象的原因。另外,對giPSCs的傳代培養(yǎng)過程中,并未撤去培養(yǎng)基中的VPA,這未影響giPSCs的狀態(tài)及多潛能性。此舉有別于Huangfu等[18]的報道。由于LiCL對細胞具有毒性,不能長期添加于培養(yǎng)基中。因此,在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中需要階段性的添加LiCl,而傳代培養(yǎng)過程中并不需要添加。在giPSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基中同時添加 Vc、VPA和LiCL,并未發(fā)現(xiàn)3種小分子之間相互抑制現(xiàn)象,三者之間具有較好的協(xié)同效果,能有效提高giPSCs的重編程效率。本試驗中,我們雖然未能得到Esteben、Huangfu和Wang等[17-19]報道那樣如此高的重編程效率,這也許與giPSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)基體系遠未達到完善的程度有關(guān)系,還是明顯優(yōu)化了giPSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境,為以后的相關(guān)研究提供了有益數(shù)據(jù)。

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Optimization of Induced and Cultivation System of Arbas Cashmere Goat iPSCs TAI Dapeng,Naimentana,NUO Mingtu,WANG Xiao,LIANG Hao,LIU Dongjun

(Key Laboratory of Education Ministry of China for Research of Mammal Reproductive

Biology and Biotechnology,Inner Mongolia University,Huhhot010021,China)

Abstract：The induced pluripotent stem cells of Arbas cashmere goats (giPSCs) have significant values in genetic breeding,however,nowadays there are no compatible induced and cultivation medium systems of giPSCs.In order to establish a stable and complete induced and cultivation medium system,In this study,we showed that five different cultivation medium systems with different combination of serum and small molecules were able to generate the giPSCs.The growth status,subculture ability and reprogramming efficiency of giPSCs which derived from five different cultivation medium systems were observed,and pluripotency of these giPSCs was detected.At last,the influence of different combinations of small moleculars on the reprogramming efficiency and expression of pluripotent genes of giPSCs were analyzed.We found that serum promoted the generation of giPSCs and Vc,VPA and LiCL could accelerate the generation and self renewal of giPSCs.The research provided foundation for further study on stable and complete induced cultivation medium system of Arbas cashmere goat iPSCs,and experimental platform for embryonic stem cell line of Arbas cashmere goats.

Key words:Arbas cashmere goat;iPSCs;Induced and cultivation medium system;Small molecules

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.018

中圖分類號：S826

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0106-08

作者簡介：邰大鵬(1984-),男,內(nèi)蒙古興安盟人,博士,主要從事哺乳動物生殖生物學(xué)與生物技術(shù)研究。通訊作者：劉東軍(1963-),男,內(nèi)蒙古烏蘭察布人,教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事哺乳動物生殖生物學(xué)與生物技術(shù)研究。

基金項目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2011ZX08008-002)

收稿日期：2016-02-16