T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的敗育特點及育性恢復(fù)

段　陽,姚　盟,蒙立穎,石曉藝,齊　智,葉佳麗,閆鵬嬌,劉子涵,宋喜悅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,陜西 楊凌　712100)

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T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的敗育特點及育性恢復(fù)

段陽,姚盟,蒙立穎,石曉藝,齊智,葉佳麗,閆鵬嬌,劉子涵,宋喜悅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,陜西 楊凌712100)

摘要：為了明確T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的形態(tài)特征和細(xì)胞學(xué)特點及對T763A恢復(fù)系的選用提供依據(jù),以不育系T763A,保持系763B,恢復(fù)系Tm3315B、Tm504B和TP731B為供試材料,進(jìn)行外部形態(tài)特征觀察和花粉粒制片(醋酸洋紅、I2-KI和DAPI);并以中國春和黑麥為對照試材,對所有供試材料進(jìn)行核型鑒定。結(jié)果表明:T763A敗育類型為典敗和圓敗,成熟花粉粒皺縮無規(guī)則,內(nèi)含物少,花粉敗育,敗育主要發(fā)生在單核晚期到二核期;所有供試材料均為非1B/1R類型;3個恢復(fù)系(Tm3315B、Tm504B和TP731B)恢復(fù)能力均較強(qiáng),其中以Tm504B對T763A的恢復(fù)能力相對最好,這可能與T763A的胞質(zhì)類型及與恢復(fù)系所含的恢復(fù)基因數(shù)量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：小麥;細(xì)胞質(zhì)雄性不育;敗育特點;核型鑒定;育性恢復(fù)

雜種優(yōu)勢是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象,多種作物的雜交種已表現(xiàn)出顯著的增產(chǎn)效應(yīng)[1]。在雜種優(yōu)勢利用的過程中,雄性不育系因其可以省去人工去雄,降低生產(chǎn)成本,提高制種質(zhì)量而被廣泛利用并已取得了舉世矚目的成就。植物雄性不育指雄蕊不能產(chǎn)生具有正常功能的花粉而雌蕊發(fā)育正常,能夠接受外來花粉而受精結(jié)實[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計,已在多達(dá)43科、162屬、320個種的617個亞種或種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象[3]。而植物的雄性不育多為細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS),其特點是花粉敗育、雌蕊正常和母本遺傳[4],是農(nóng)作物雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ),也是研究細(xì)胞質(zhì)遺傳的重要材料[3]。研究和掌握細(xì)胞質(zhì)雄性不育作物的敗育及育性恢復(fù)特點,對合理利用雄性不育進(jìn)行雜交育種具有重要的意義。自1951年Kihara首次將普通小麥的細(xì)胞核導(dǎo)入尾形山羊草(Aegilopsacudaat)的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以來，世界上開始了小麥雜種優(yōu)勢利用的研究[5],而我國雜交小麥的研究始于20世紀(jì)60年代[6]。Wilson和Ross在1962年首次育成T型(T.timopheevi)細(xì)胞質(zhì)不育系并完成“三系”配套,為雜交小麥在生產(chǎn)上利用奠定了基礎(chǔ)[7]。在眾多的小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)中,小麥T型雄性不育是研究時間最長,研究最深入的一種[8],其不育系易于保持且不育性狀穩(wěn)定,且具有非常大的應(yīng)用潛力[9]。但因其存在不育系恢復(fù)源少、籽粒皺縮、發(fā)芽率低和所需要的恢復(fù)基因數(shù)目較多等問題,使T型雜種小麥的應(yīng)用受到了一定程度的限制[10-11]。

但是近年來關(guān)于T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥的敗育特點和育性恢復(fù)的研究較少,并且對其有較高恢復(fù)度的恢復(fù)系研究很有限。為此,本試驗以T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A為研究對象,通過比較外部形態(tài)特征和常規(guī)制片技術(shù)來觀察其敗育的生物學(xué)特性,利用分子標(biāo)記和酸性凝膠電泳(Acid-polyacrylamide gel electrophoresis,A-PAGE)方法對其進(jìn)行核型鑒定,并通過研究3個恢復(fù)系對其育性恢復(fù)能力來探索不育系T763A的育性恢復(fù)特點,旨在為明確T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系敗育的特點,選配具有較高恢復(fù)度的T型恢復(fù)系,進(jìn)一步利用小麥雜種優(yōu)勢提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

本試驗選用具有T型細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系小麥T763A及其同型保持系763B,恢復(fù)系Tm3315B、Tm504B、TP731B以及T763A與3個恢復(fù)系的F1。同時,以中國春(Chinese spring,CS)和黑麥(SecalecerealeL.,Rye)作為輔助鑒定材料。所有材料均由西北農(nóng)林科技大學(xué)二系雜交小麥課題組提供。

試驗于2013-2015年在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗農(nóng)場進(jìn)行。

1.2試驗方法

1.2.1T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的形態(tài)特征觀察根據(jù)T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥三系植株的外部形態(tài)選取不同花藥發(fā)育時期的穗子,用鑷子和解剖針小心取出小花,剝出花藥。觀察小花和花藥的形態(tài)特征差異,并在顯微鏡(Nikon SMZ1500)下照相。

1.2.2T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的細(xì)胞學(xué)觀察采用I2-KI染色法在顯微鏡下觀察三核期花粉育性并照相[12]。選取不育系、保持系和恢復(fù)系的不同發(fā)育時期的花藥,用醋酸洋紅壓片,通過鏡檢確定花藥發(fā)育的準(zhǔn)確時期,并將不同時期花藥分開置于FAA(Formalin-acetic acid-alcohol)固定液中,在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將固定好的花藥置于載玻片上,滴30 μL的DAPI(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)染色液,蓋上蓋玻片,遮光處理約10 min后在熒光顯微鏡下觀察照相。

1.2.31BL/1RS易位系的分子鑒定參考李榮華等[13]的方法,用CTAB提取小麥幼嫩葉片的DNA。選用2對特異性引物AF1/AF4(F:5′-GGAGACAT CATGAAACATTG-3′,R:5′-CTGTTGTTGGGCAGAAA G-3′)、Gli-B1(F:5′-GCAGACCTGTGTCATTGGTC-3′,R:5′-GATATAGTGGCAGCAGGATACG-3′)作為1BL-1RS的篩選標(biāo)記。其中,AF1/AF4位于黑麥1RS上,Gli-B1位于普通小麥1BS上,以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系為15 μL,其中含0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、1.6 μL 10×Buffer(含Mg2+)、1.2 μL dNTPs(2.5 μmol/mL)、2 μL引物(20 μmol/mL)和2 μL模板DNA。AF1/AF4的擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性5 min;然后34個循環(huán),每循環(huán)為94 ℃變性40 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸50 s;72 ℃終延伸10 min。Gli-B1引物的PCR退火溫度為56 ℃,其余擴(kuò)增程序同引物AF1/AF4。擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μL 1×Loading Buffer,0.8%～2.0%瓊脂糖凝膠中加入適量核酸染料(10μL/100mL),在1×TAE緩沖液中電泳檢測,膠片用GPS-8000凝膠成像儀掃描并照相。

1.2.41BL/1RS易位系的醇溶蛋白鑒定采用酸性凝膠電泳(Acid-polyacrylamide gel electrophoresis,A-PAGE)對小麥的醇溶蛋白進(jìn)行電泳分析并照相,記錄結(jié)果[14]。

1.2.5T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的恢復(fù)系和F1育性調(diào)查和數(shù)據(jù)分析試驗材料的恢復(fù)系和F1抽穗后,且在試材開花前,每個試材隨機(jī)選取10個主莖穗子,套上自交袋。待小麥成熟后,調(diào)查單株有效穗數(shù)、有效小穗數(shù)、穗粒數(shù),計算套袋穗的自交結(jié)實率。

自交結(jié)實率=套袋穗有效小穗基部2朵小花的結(jié)粒數(shù)/(套袋穗有效小穗數(shù)×2)×100%[15]。

數(shù)據(jù)通過Excel 2007軟件進(jìn)行整理和計算,用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的生物學(xué)特性

2.1.1T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的外部形態(tài)特征不育系T763A、保持系763B以及恢復(fù)系Tm3315B的植株外部形態(tài)相似,各時期長勢也基本相同。旗葉未完全抽出,倒二葉與倒三葉間距<10 cm,小麥穗長約5 cm,為減數(shù)分裂時期(圖1-A、F、K);當(dāng)旗葉剛剛完全抽出,穗長>5 cm時,小麥進(jìn)入單核早期(圖1-B、G、L);旗葉與倒二葉間距>3 cm,穗長>10 cm,但麥穗未完全抽出,為單核晚期(圖1-C、H、M);小麥麥穗抽出大于一半,至完全抽出<2 cm,穗長>10 cm,為二核期(圖1-D、I、N);當(dāng)麥穗完全抽出>2 cm時,小麥進(jìn)入三核期,隨著小麥繼續(xù)生長,不育系小麥T763A不開花,敗育(圖1-E),保持系小麥763B和恢復(fù)系小麥Tm3315B開花并散粉(圖1-J、O)。

從花和花藥上來看,不育系T763A雌蕊正常,花藥顏色淺淡,大小不一,彎曲干癟,上端尖細(xì),基部略有分叉,花藥不能正常開裂,不散粉(圖2-A、D);保持系763B和恢復(fù)系Tm3315B的花藥顏色鮮黃,大小略一致,直而飽滿,上端和基部均有分叉,花藥可正常開裂,散粉(圖2-B、C、E、F)。

A～E.T763A;F～J.763B;K～L.Tm3315B;A、F、K.減數(shù)分裂期;B、G、L.單核早期;C、H、M.單核晚期;D、I、N.二核期;E、J、O.三核期。

2.1.2T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的細(xì)胞學(xué)特點I2-KI染色結(jié)果表明,不育系T763A花粉粒敗育,不育類型為典敗和圓敗,花粉粒大多皺縮無規(guī)則,少量為圓形,無內(nèi)含物,對碘化鉀無染色反應(yīng)(圖3-F);保持系763B和恢復(fù)系Tm3315B花粉粒經(jīng)染色后,絕大多數(shù)花粉粒為圓形,染色充分而呈棕黑色,只有少數(shù)染敗(圖3-L、R)。

經(jīng)醋酸洋紅壓片后觀察發(fā)現(xiàn),T763A、763B和Tm3315B的造孢細(xì)胞均能正常分裂形成小孢子母細(xì)胞,進(jìn)而進(jìn)行減數(shù)分裂并最終形成四分體(圖3-A、G、M)。單核早期,3種材料的小孢子均能正常發(fā)育,無明顯差異(圖3-B、H、N)。T763A有將近一半的花粉粒在單核晚期和二核期皺縮無規(guī)則,沒有形成核(圖3-C、D);而763B和Tm3315B的花粉粒規(guī)則,能正常發(fā)育形成核,僅有極少數(shù)出現(xiàn)不正常形態(tài)(圖3-I、J、O、P)。三核期,T763A花粉粒大部分不規(guī)則,內(nèi)含物少,2個精核不能正常呈梭形而呈圓形,花粉粒敗育(圖3-E);763B和Tm3315B的絕大部分花粉粒呈規(guī)則的圓形,內(nèi)含物豐富,能正常形成梭形精核(圖3-K、Q)。

A、D.T763A;B、E.763B;C、F.Tm3315B。

A～F.T763A;G～L.763B;M～R.Tm3315B;A、G、M.四分體時期;B、H、N.單核早期;C、I、O.單核晚期;D、J、P.二核期;E、F、K、L、Q、R.三核期。

經(jīng)熒光染料(DAPI)染色制片后觀察發(fā)現(xiàn),四分體時期和單核早期,3種試材均正常發(fā)育,差異不明顯(圖4-A、B、F、G、K、L)。T761A在單核晚期和二核期,有一部分花粉粒形狀不規(guī)則,不能正?？尚纬珊?圖4-C、D);763B和Tm3315B絕大多數(shù)花粉粒呈規(guī)則的圓形,可正常發(fā)育(圖4-H、I、M、N)。三核期,763B和Tm3315B的小孢子能正常發(fā)育形成可育花粉,只有極少數(shù)不規(guī)則(圖4-J、O);而T763A的花粉粒大部分皺縮無規(guī)則,2個精核呈圓形,不能正常形成梭形精核(圖4-E)。

2.2T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系T763A,保持系763B,恢復(fù)系Tm3315B的核型鑒定

2.2.11BL/1RS核型的PCR分子鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,除黑麥(Rye)外,中國春(CS)和其他供試材料均可由Gli-B1引物擴(kuò)增出片段為220 bp的目的條帶(圖5-A),而只有黑麥可由AF1/AF4引物擴(kuò)增出片段為1.5 kb大小的條帶(圖5-B)。AF1/AF4位于黑麥1RS上,Gli-B1位于小麥1BS上,由此初步說明,T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系T763A,保持系763B,恢復(fù)系Tm3315B、Tm504B和TP731B均為非1B/1R類型。

A～E.T763A;F～J.763B;K～L.Tm3315B;A、F、K.四分體時期;B、G、L.單核早期;C、H、M.單核晚期;D、I、N.二核期;E、J、O.三核期。

A.Gli-B1;B.AF1/AF4;M.DL2000;Rye.黑麥;CS.中國春。

2.2.21BL/1RS核型的醇溶蛋白鑒定與普通小麥相比,黑麥(Rye)在高分子量區(qū)(ω區(qū))含有較多的譜帶,而中國春(CS)的譜帶較少,因此與黑麥ω區(qū)譜帶相同的為1BL/1RS,其余為非1BL/1RS。 通過酸性凝膠電泳(A-PAGE)方法對所有供試材料以及中國春(CS)和黑麥(Rye)醇溶蛋白進(jìn)行電泳分析后發(fā)現(xiàn),在ω區(qū)的醇溶蛋白,所有供試材料與中國春(CS)相似,而和黑麥(Rye)差異較大,這一結(jié)果和1BL/1RS核型的PCR分子鑒定結(jié)果相吻合,進(jìn)一步說明所有供試材料均為非1B/1R類型(圖6)。

2.3T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的育性恢復(fù)

T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的3個恢復(fù)系育性均沒有達(dá)到100%,但自交結(jié)實率均>90%,其中Tm504B和TP731B的自交結(jié)實率>95%,以Tm504B的自交結(jié)實率最高,平均值達(dá)到97.94%。從方差上來看,Tm504B和TP731B的育性波動較小,而Tm3315B的自交結(jié)實率波動最大,說明Tm3315B自身育性相對不太穩(wěn)定(表1-A)。相比之下,3個恢復(fù)系與T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系T763A的異交結(jié)實率卻較低,均沒有達(dá)到80%。其中,Tm504B對T763A的恢復(fù)能力較高,平均異交結(jié)實率為70.78%,而其他2個均接近60%。3個恢復(fù)系的異交結(jié)實率的變異幅度整體上比自交結(jié)實率高,其中以TP731B的變異幅度最大。雖然各恢復(fù)系與T763A的異交結(jié)實率相對較低,但由于T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥不育性穩(wěn)定,不易被恢復(fù),因此,這3個恢復(fù)系對T763A的恢復(fù)能力還是較高的(表1-B)。

由表2的顯著性差異分析可以看出,3個恢復(fù)系間自身的育性沒有表現(xiàn)出明顯差異(表2-A),而異交結(jié)實率間存在顯著性差異(表2-B)。其中,Tm504B與其他2個恢復(fù)系均存在0.05顯著水平的差異,而這2個恢復(fù)系間不存在顯著性差異。結(jié)合表1-B,說明3個恢復(fù)系對T763A的恢復(fù)能力均較好,其中以Tm504B對T763A的恢復(fù)能力最好,且恢復(fù)力穩(wěn)定。

1.黑麥;2.中國春;3.T763A;4.763B;5.Tm504B;

表1　三個恢復(fù)系的自交、異交結(jié)實率和方差

表2　三個恢復(fù)系間恢復(fù)力差異顯著性比較

注:*.差異達(dá)0.05顯著水平;表中數(shù)值為成對數(shù)據(jù)平均值的差數(shù)。

Note:*.Significant difference at the 0.05 level;The figures in the table are the differences between the averages of paired data.

3討論與結(jié)論

3.1T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A敗育的生物學(xué)特性討論

多項試驗表明,植物的雄性不育材料大多會出現(xiàn)不正常形態(tài)的花藥和花粉粒。雄性不育的燈盞花管狀花長、花絲長及花藥長度均小于正常燈盞花,且其開花后花粉量少并均黏附于藥壁上,不易被風(fēng)吹散或昆蟲帶走;花藥外形瘦弱,顏色偏白,無散出花粉[16]。欒兆水等[17]研究的雄性不育大蔥(AlliumfistulosumL.)7504A的花粉粒比可育大蔥7504B的扁,遠(yuǎn)極單溝形狀不穩(wěn)定,外壁網(wǎng)狀紋飾較細(xì)。甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)光溫敏雄性不育系Huiyou50S的花粉粒少并且畸形，比可育株Huiyou50F的花粉粒明顯小，干癟、形態(tài)不規(guī)則，花粉壁在萌發(fā)溝處內(nèi)陷，而可育株的花粉粒花粉壁表面呈網(wǎng)狀，網(wǎng)眼不規(guī)則，具有3條萌發(fā)溝[18]。小麥光溫敏雄性不育系337S花絲短,開花時花藥不外露,有二次開穎現(xiàn)象;花藥偏小且成熟后難以破裂,花粉粒少而小,大小不均勻,碘染色反應(yīng)為不染色或不同程度的淺染色[19]。本試驗發(fā)現(xiàn),T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A不開花,不散粉,花藥開花期大小不一,空癟畸形,顏色淺淡,不開裂;保持系763B和恢復(fù)系Tm3315B正常開花并可散出大量花粉,成熟花藥大小均勻,飽滿,顏色鮮黃,上下兩端均略有分叉。這與錢煥煥等[20]對YS型小麥溫敏不育系A(chǔ)731在雄性不育狀態(tài)下的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果相同。

不同的雄性不育材料有不同的花粉敗育時期和敗育原因[21],高等植物雄性器官從小孢子母細(xì)胞發(fā)育到二核花粉粒期間都有可能發(fā)生敗育[22]。Laser等[23]曾指出,雙子葉植物花粉敗育多在四分體小孢子時期或小孢子早期發(fā)育階段,而單子葉植物花粉敗育則多數(shù)達(dá)到或接近二核期。陳雪平等[24]對3個茄子(SolanummelongenaL.)雄性不育系655A、679A和704A及其相應(yīng)保持系655B、679B和704B觀察發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂時期的前期Ⅰ，3個不育系的絨氈層細(xì)胞液泡化，核被擠向一側(cè)，最終解體壞死，絨氈層以外的藥壁細(xì)胞增生且排列不整齊，藥室縊縮為條帶狀，孢母細(xì)胞被擠壓變形而敗育，從而推測前期Ⅰ為3種不育材料發(fā)生敗育的關(guān)鍵時期。和茄子一樣，辣椒(CapsicumannuumL.)也是雙子葉植物。王蘭蘭等[25]研究表明，辣椒雄性不育系8A小孢子進(jìn)入四分體時期之后，絨氈層細(xì)胞徑向異常膨大高度液泡化進(jìn)入侵藥室，擠壓形成不規(guī)則的四分體，皺縮凹陷，不能產(chǎn)生正常的小孢子。單子葉植物洋蔥(AlliumcepaL.)雄性不育材料8A的絨氈層在花粉母細(xì)胞時期就與中層分離，并且不斷膨大，最后逐漸解體。到四分體時期已經(jīng)解體成染色很深的物質(zhì)，不能供給小孢子發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致小孢子萎縮變形，最后敗育[26]。姚雅琴等[27]提出,T型雄性不育系T-77(2)在單核早期,小孢子發(fā)育基本正常,細(xì)胞質(zhì)中有相當(dāng)于保持系同時期發(fā)育的內(nèi)容物;其敗育發(fā)生在單核花粉粒后期,敗育后的花粉粒細(xì)胞器和細(xì)胞核均解體,僅剩下花藥壁和極少具有ATP酶活性的細(xì)胞質(zhì)。本研究中,T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系T763A在小孢子四分體時期和單核早期與可育的保持系763B和恢復(fù)系Tm3315B沒有差異,均能正常發(fā)育。在單核晚期和二核期,T763A有將近50%的小孢子形狀不規(guī)則,細(xì)胞質(zhì)被降解變成空殼;763B和Tm3315B能正常發(fā)育,只有一小部分小孢子出現(xiàn)不正常現(xiàn)象。T763A僅有一小部分小孢子能發(fā)育到三核期,但都不能形成2個正常的呈梭形的精核,花粉粒敗育,敗育類型為典敗和圓敗;在三核期,763B和Tm3315B絕大多數(shù)的小孢子可正常發(fā)育形成含有1個營養(yǎng)核和2個呈梭形精核的花粉粒,只有少數(shù)不正常。由此表明,T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的敗育時期在單核晚期到二核期。

3.2T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系T763A及保持系和恢復(fù)系的核型鑒定分析

普通小麥的1B染色體短臂被黑麥1R染色體短臂取代而形成小麥-黑麥1BL/1RS易位系。其1RS染色體上攜帶有抗條銹病(Yr9)、葉銹病(Lr26)、稈銹病(Sr31)和白粉病(Pm8)基因[28],因而具有較好的廣譜抗病性、適應(yīng)性和豐產(chǎn)性。非1B/1R類型小麥雄性不育系Tsp3314A、Tsp427-3A和保持系Tsp3314B、Tsp427-3B無單倍體產(chǎn)生,而1B/1R類型小麥雄性不育系K3314A產(chǎn)生大量單倍體植株;非1B/1R類型的Tsp3314A和Tsp427-3A的光合速率也高于1B/1R類型的K43314A[29]。宋喜悅等[30]研究表明,非1B/1R類型的K型不育系KTSP3314A與10個普通小麥品種(系)(259、3665、TB902、F107、J18、R205、L783、503、3380和78115)所組成的組合比1B/1R類型的K型不育系K3314A所組成的組合更具易恢復(fù)性。因而快速而準(zhǔn)確地對小麥進(jìn)行核型鑒定,對品質(zhì)改良和選配小麥雜交育種的強(qiáng)優(yōu)勢組合具有重要意義。目前,鑒定1BL/1RS易位的方法有很多,主要包括細(xì)胞學(xué)鑒定、凝膠電泳法、分子標(biāo)記、酶聯(lián)免疫法、單克隆抗體、高效液相色譜[31]。馬小樂等[32]選取小麥甘春20號、甘春22號、甘春23號、甘春24號、武春4號、武春121、永良4號和和尚頭8個品種的DNA為模板,采用黑麥堿(ω-secalin)基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,甘春20號、甘春22號、甘春23號、甘春24號、武春4號、武春121均擴(kuò)增出了1 076 bp的目的條帶,初步鑒定它們?yōu)?B/1R類型。傅賓孝等[33]在研究中證實醇溶蛋白的A-PAGE具有方便快捷,重現(xiàn)性好,成本低廉,不受鑒定周期和環(huán)境影響等優(yōu)點。

本試驗采用PCR的分子鑒定和改良的醇溶蛋白A-PAGE鑒定相結(jié)合的辦法,以黑麥(Rye)和中國春(CS)作對照。其中PCR分子鑒定選取2對引物AF1/AF4和Gli-B1,分別在黑麥1RS和普通小麥1BS上,雙向進(jìn)行供試材料的核型鑒定;試驗結(jié)果表明,所有的供試材料均為非1B/1R類型。醇溶蛋白的A-PAGE鑒定結(jié)果表明,在ω區(qū),所有供試材料與黑麥的條帶均不相同,而與中國春的相似,進(jìn)一步驗證了PCR分子鑒定的結(jié)果。

3.3T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的育性恢復(fù)特點

不育系植株表現(xiàn)為花粉敗育,將含有恢復(fù)基因(Rf)的 恢復(fù)系與其雜交后,產(chǎn)生的雜交種育性恢復(fù)為可育,使雜種優(yōu)勢得以成功利用。關(guān)于植物雄性不育系的育性恢復(fù)問題,眾多學(xué)者已展開了一系列研究,并取得了一定的研究成果。水稻、油菜、高粱、向日葵等作物均已大規(guī)模應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)產(chǎn)生雜交種,并取得巨大成功。雜種優(yōu)勢的利用,除了培育出不育系外,還應(yīng)找到與之相對應(yīng)的恢復(fù)系。石瑜敏等[34]曾指出，恢復(fù)系的選育與雜交水稻在產(chǎn)量、米質(zhì)、抗性及適應(yīng)性方面的改進(jìn)和發(fā)展密切相關(guān)，而強(qiáng)恢復(fù)系的選育是進(jìn)一步提高雜交水稻產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性的主要途徑之一。曾俊莉等[35]提出,要想雜交組合具有較高的恢復(fù)度,應(yīng)選育不育系中有顯性易恢復(fù)基因,或恢復(fù)系中有顯性恢復(fù)基因的親本?；謴?fù)系并非只簡單地由主效恢復(fù)基因控制,還受微效恢復(fù)基因和抑制基因的影響。張改生等[36]認(rèn)為,異質(zhì)不育系核內(nèi)存在2種形式,即單對主效基因(或是1RS片段)和單對主效基因+控制基因;恢復(fù)系核內(nèi)有4種形式,即主效恢復(fù)基因、主效恢復(fù)基因+微效可育基因、主效恢復(fù)基因+抑制基因、僅含微效可育基因。其中,以前者第2個和后者第2個的組配方式具有較高的恢復(fù)度。T型細(xì)胞質(zhì)不育系的高恢復(fù)系很少,而穩(wěn)定的恢復(fù)系則更少[37]。因而選育恢復(fù)力強(qiáng)及農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系仍是T型雜種小麥強(qiáng)優(yōu)勢組合的關(guān)鍵。

本試驗中,恢復(fù)系Tm3315B、Tm504B和TP731B的自交結(jié)實率均較高且穩(wěn)定,三者間不存在顯著性差異。3個恢復(fù)系與T763A雜交的F1結(jié)實率比恢復(fù)系自交結(jié)實率低,這可能與T763A的胞質(zhì)類型和3個恢復(fù)系所含的恢復(fù)基因數(shù)量有關(guān)。但對T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥來說,3個恢復(fù)系的恢復(fù)能力還是較高的,其中,Tm504B對T763A的恢復(fù)性最好,與其他2個恢復(fù)系存在顯著性差異,可用來進(jìn)行恢復(fù)基因的精細(xì)定位和進(jìn)一步選育具有更強(qiáng)恢復(fù)能力的T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系。

T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育小麥T763A的敗育類型為典敗和圓敗;敗育發(fā)生在小孢子單核晚期;T763A和保持系763B、恢復(fù)系Tm3315B及其他恢復(fù)系均為非1B/1R類型;T763A的不育性穩(wěn)定,較難恢復(fù),其中對其恢復(fù)性較好的恢復(fù)系為Tm504B,可用于后期T型細(xì)胞質(zhì)不育系恢復(fù)基因的精細(xì)定位。

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Abortion Characters and Fertility Restoration of T763A,a Male Sterile Line withT.timopheeviCytoplasm

DUAN Yang,YAO Meng,MENG Liying,SHI Xiaoyi,QI Zhi,YE Jiali,YAN Pengjiao,LIU Zihan,SONG Xiyue

(College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling712100,China)

Abstract：T type male sterile wheat line is a valuable material for heterosis study and utilization.In order to make the morphological and cytological characteristics of T763A clear,as well as provide reliable basis for the selection of restorer lines,we used male sterile line T763A,maintainer line 763B and restorer lines(Tm3315B,Tm504B and TP731B)as materials.The external morphology and pollen grain production(Acetic Acid Magenta,I2-KI and DAPI)were observed;the karyotype of all the materials was identified by molecular marker technology and A-PAGE,with Chinese spring and Secale cereale L. as control materials.The results showed that the pollen sterility type of male sterile line T763A was stained as spherical abortive;the mature pollen grains were shrunk out of shape and had little inclusion,mean while,the pollen grains were infertile;the sterility of T763A occurred between late uninucleate and binucleate stage;all the materials were non 1B/1R;the restoring capability of the three restorer lines was high,and among them,Tm504B was the best restorer line of T763A,the reasons for this might in connection with the type of cytoplasm of T763A and the gene counts of the restorer lines.

Key words:Wheat;Cytoplasmic male sterility;Abortion characters;Karyotyping;Restoration of fertility

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.017

中圖分類號：S512.03

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0098-08

作者簡介：段陽(1991-),女,河南新鄉(xiāng)人,在讀碩士,主要從事小麥雄性不育和分子生物學(xué)研究。通訊作者：宋喜悅(1968-),男,內(nèi)蒙古赤峰人,副教授,博士，主要從事小麥雄性不育和雜種優(yōu)勢利用研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31271792);陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2014K02-04-01);西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項目

收稿日期：2016-02-04