去勢(shì)對(duì)淮南豬皮下脂肪PPAR信號(hào)通路基因表達(dá)量的影響

王　璟,白獻(xiàn)曉,張家慶,高彬文,陳俊峰,高　原,任巧玲,馬　強(qiáng),郭紅霞,梁永紅,邢寶松

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州　450002;2.新縣畜牧局,河南 新縣　465550)

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去勢(shì)對(duì)淮南豬皮下脂肪PPAR信號(hào)通路基因表達(dá)量的影響

王璟1,白獻(xiàn)曉1,張家慶1,高彬文1,陳俊峰1,高原2,任巧玲1,馬強(qiáng)1,郭紅霞1,梁永紅1,邢寶松1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州450002;2.新縣畜牧局,河南 新縣465550)

摘要：為了研究PPAR信號(hào)通路在豬去勢(shì)誘導(dǎo)的脂肪沉積中的作用，采集去勢(shì)和非去勢(shì)淮南豬(共6頭,每組各3頭)的皮下脂肪組織,提取總RNA后構(gòu)建文庫(kù),利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PPAR通路相關(guān)基因表達(dá)量,表達(dá)差異基因的篩選閾值為P<0.05且|log2差異倍數(shù)|>1?；趍RNA的差異分析以及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),PPAR信號(hào)通路中17個(gè)基因表達(dá)差異達(dá)到顯著水平,其中14個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)、3個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。腦型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(FABP7)、甘油水孔蛋白基因(AQP7)、視黃素X受體γ基因(RXRγ)等基因上調(diào),而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1基因(PCK1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α基因(PPARGC1α)、膽固醇7α-羥化酶1基因(CYP7A1)參與分解代謝的基因顯著下調(diào)。

關(guān)鍵詞：淮南豬;差異表達(dá)基因;高通量測(cè)序;PPAR信號(hào)通路;脂肪沉積

中國(guó)擁有80多個(gè)地方豬品種,列入中國(guó)豬種品種志的有48個(gè),是世界上豬種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家之一。國(guó)外豬種的肉質(zhì)存在肌內(nèi)脂肪含量低、肉色灰白、系水力低等缺點(diǎn),河南地方豬種如淮南豬、確山黑豬等具有肉色鮮紅、系水力強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高、肌纖維細(xì)等優(yōu)點(diǎn),對(duì)高檔豬肉生產(chǎn)具有重要意義[1]?；茨县i1986年被列入河南省地方優(yōu)良畜禽品種志,主要產(chǎn)區(qū)集中在淮河上游以南,歸屬于黃淮海黑豬、華北型。該豬種耐熱、耐粗飼、產(chǎn)仔數(shù)多、生長(zhǎng)發(fā)育較慢,仔豬出生質(zhì)量約為0.8 kg,成年公豬體質(zhì)量平均為149.7 kg,成年母豬為104.9 kg[2]?；茨县i達(dá)90 kg的時(shí)間大約需要240 d(顯著長(zhǎng)于國(guó)外引進(jìn)品種),此階段淮南豬的背膘厚約為3.35 cm,胴體含脂率約為33.5%,均顯著高于國(guó)外引進(jìn)品種[3]。因此,淮南豬可以作為研究中國(guó)地方豬肉質(zhì)性狀的代表品種。

研究表明,過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號(hào)通路參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、能量代謝、炎癥反應(yīng)、胚胎著床等。PPARs屬于核激素受體超家族,核激素受體是一類轉(zhuǎn)錄因子,能夠結(jié)合在DNA并以配體依賴方式調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[4]。PPARs通過(guò)結(jié)合類視黃醇X受體(RXR)形成異二聚體,結(jié)合在靶基因的過(guò)氧化物酶體增殖反應(yīng)元件(PPRE反應(yīng)元件)上,進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平[5]。PPAR基因家族包含PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3個(gè)成員,在多種生物過(guò)程中起調(diào)控作用,例如能夠增強(qiáng)機(jī)體胰島素的敏感性、調(diào)節(jié)體內(nèi)糖平衡,尤其是通過(guò)調(diào)控各種參與細(xì)胞脂類代謝基因的表達(dá)進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞的分化[6]。PPARα基因促進(jìn)甘油三酯分解為游離脂肪酸,同時(shí)刺激肌肉和肝臟β氧化進(jìn)而降低脂肪酸和甘油三酯的合成[7]。PPARβ能夠上調(diào)前脂肪細(xì)胞中多種成脂相關(guān)基因的表達(dá),與細(xì)胞的基礎(chǔ)脂肪代謝相關(guān),加快能量代謝促進(jìn)脂肪氧化。PPARγ基因是調(diào)控前體脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平影響脂肪酸及其衍生物的功能進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化,其在脂類代謝過(guò)程中也起到重要作用[8]。PPAR信號(hào)通路其他成員在脂質(zhì)代謝過(guò)程中也起到非常重要的作用,例如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α基因(PPARGC1α)、視黃素X受體γ基因(RXRγ)、脂滴包被蛋白(PLIN1)等。

去勢(shì)能夠促進(jìn)機(jī)體脂肪沉積,在動(dòng)物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。仔公豬去勢(shì)后失去雄性激素分泌的基礎(chǔ),機(jī)體出現(xiàn)缺乏雄性激素導(dǎo)致的“肥胖”[9]。開(kāi)展去勢(shì)公豬的相關(guān)研究有助于闡釋動(dòng)物脂肪沉積的分子機(jī)制。目前關(guān)于去勢(shì)增加脂肪沉積有一些研究,但其分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚,因此本研究使用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)淮南豬皮下脂肪進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析,以期找到PPAR信號(hào)通路基因在去勢(shì)豬和非去勢(shì)豬皮下脂肪中的表達(dá)差異,有助于進(jìn)一步理解去勢(shì)促進(jìn)豬脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制。

1材料和方法

1.1供試動(dòng)物

選取3對(duì)淮南豬仔豬,每對(duì)仔豬同窩且出生體重相似。3對(duì)仔豬每對(duì)中隨機(jī)選擇1頭在5周齡時(shí)進(jìn)行手術(shù)閹割,另1頭在腹部劃相同大小切口作為偽處理,從而產(chǎn)生相同的應(yīng)激反應(yīng)。所有豬按照商品豬的飼養(yǎng)流程進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2組織樣品

于210日齡時(shí)對(duì)6頭試驗(yàn)豬進(jìn)行屠宰,屠宰后30 min內(nèi)采集皮下脂肪樣品,樣品剪成黃豆大小,放在凍存管中立即投入液氮中,運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

使用柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取6頭豬皮下脂肪的總RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量,使用紫外分光光度計(jì)(IMPLEN,NanoPhotometer)分析所提RNA的濃度。RNA用干冰包裝后,送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)序。

1.4上機(jī)文庫(kù)制備及質(zhì)檢

檢測(cè)合格的總RNA構(gòu)建文庫(kù):使用Epicentre Ribo-ZeroTM試劑盒去除核糖體RNA;加入Fragmentation Buffer把mRNA片段化,形成150～200 bp的短片段;以短片段為模板,使用六堿基的隨機(jī)引物進(jìn)行第一鏈cDNA合成,然后加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行第二鏈cDNA的合成;利用AMPure XP beads純化后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、3′-腺苷酸化為cDNA末端加A、連接Illumina接頭,然后使用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。之后用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈,最后進(jìn)行PCR富集得到鏈特異性cDNA文庫(kù)。

文庫(kù)構(gòu)建完成后,先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量,稀釋文庫(kù)至1 ng/μL,隨后使用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)的插入片段大小(Insert size),符合預(yù)期后使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L),以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.5高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析

檢測(cè)合格的文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行HiSeq測(cè)序。所得原始測(cè)序序列,將帶接頭的、低質(zhì)量的序列進(jìn)行過(guò)濾,從而得到Clean reads。使用Tophat2對(duì)過(guò)濾后的序列與豬的參考基因組(Scrofa10.2)進(jìn)行比對(duì)分析,得到Mapped Data。基因表達(dá)水平用FPKM值表示,是每百萬(wàn)片段中來(lái)自某一個(gè)基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目。通過(guò)Mapped Data分析基因的表達(dá)差異,篩選閾值為P值<0.05且|log2差異倍數(shù)|>1。PPAR信號(hào)通路主要成員信息見(jiàn)表1。

表1　PPAR信號(hào)通路部分成員介紹

2結(jié)果與分析

2.1差異表達(dá)基因分析

圖1所示為去勢(shì)與非去勢(shì)豬的皮下脂肪組織差異表達(dá)mRNA KEGG富集表達(dá)聚類,其中代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量較高用深顏色表示,表達(dá)量較低用淺顏色表示。所列出的20個(gè)通路中,有與機(jī)體糖脂代謝調(diào)控相關(guān)的如Ⅱ型糖尿病通路(14個(gè)差異基因)、胰島素信號(hào)通路(28個(gè)差異基因)、AMPK信號(hào)通路(29個(gè)差異基因)、甘油酯代謝通路(16個(gè)差異基因)等。已知PPAR信號(hào)通路相關(guān)基因調(diào)控機(jī)體能量代謝,尤其與胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病、肥胖等糖脂代謝紊亂疾病相關(guān)[6]。本研究中PPAR信號(hào)通路在去勢(shì)組顏色較深而非去勢(shì)組顏色較淺,說(shuō)明其表達(dá)量在去勢(shì)組較高而非去勢(shì)組較低。與其他通路相關(guān)基因表達(dá)量相比,去勢(shì)組PPAR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量非常高,提示該通路在去勢(shì)豬脂肪沉積過(guò)程中起重要作用,值得進(jìn)一步深入研究。

圖1　差異表達(dá)mRNA KEGG富集表達(dá)聚類

2.2PPAR通路相關(guān)基因差異表達(dá)情況

由表2可知,與非去勢(shì)組相比,去勢(shì)組PPAR信號(hào)通路共有17個(gè)基因表達(dá)量變化達(dá)到篩選閾值。其中上調(diào)基因14個(gè),下調(diào)基因3個(gè)。去勢(shì)組FPKM值變化為0.069～547.697,而非去勢(shì)組為0.292～152.724。差異表達(dá)基因log2差異倍數(shù)的范圍從-4.568到4.123，平均值為2.012。

表2　去勢(shì)組與非去勢(shì)組PPAR通路相關(guān)基因表達(dá)量

3討論與結(jié)論

FABP7基因上調(diào)倍數(shù)最高,其|log2差異倍數(shù)|為4.123,該基因最早是從腦組織中分離出來(lái)的,在肝臟中表達(dá)量也較高,其主要作用是調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。吳丹[26]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)FABP7基因與北京油雞體重及屠體性狀相關(guān)。方心靈等[27]研究發(fā)現(xiàn),FABP7基因在嶺南黃羽肉公雞禁食48 h顯著下調(diào)。何侃等[28]研究發(fā)現(xiàn),FABP7基因與SREBP-1C顯著相關(guān),而后者作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在膽固醇和脂肪酸的合成代謝中發(fā)揮了重要作用,對(duì)動(dòng)物脂肪代謝過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。這些均提示該基因能夠促進(jìn)機(jī)體合成代謝,而在本研究中,FABP7基因在去勢(shì)組顯著升高,提示去勢(shì)豬合成代謝明顯增強(qiáng),這與去勢(shì)豬脂肪沉積增加的現(xiàn)象是一致的。

AQP7基因?qū)儆诟视退椎鞍讈嗩?位于脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜上,當(dāng)機(jī)體需要能量的時(shí)候,其主要將甘油從脂肪細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至血液,其在脂肪代謝中具有關(guān)鍵的媒介作用[29]。本研究中,AQP7基因在2個(gè)組差異倍數(shù)僅次于FABP7,提示豬去勢(shì)后其雄性激素分泌減少能夠調(diào)控AQP7基因的表達(dá)水平。但雄性激素是直接調(diào)控FABP7還是通過(guò)轉(zhuǎn)化為雌激素間接調(diào)控，其具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步開(kāi)展研究證明。

CYP7A1是PPAR信號(hào)通路下調(diào)倍數(shù)最高的基因,其是肝細(xì)胞膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶,對(duì)調(diào)節(jié)膽固醇的分解代謝具有重要作用。此外,作為L(zhǎng)XRα的靶基因,CYP7A1也參與糖脂代謝、能量平衡調(diào)控。遲靜等[30]發(fā)現(xiàn)CYP7A1基因多態(tài)性與中老年脂代謝紊亂相關(guān),攜帶該基因突變型的個(gè)體發(fā)生脂代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)更高。李萬(wàn)貴等[31]揭示CYP7A1基因多態(tài)性與鴨肉質(zhì)和脂肪性狀相關(guān)。張依裕等[32]研究證明CYP7A1基因c.759.T>A突變可以作為降低番鴨膽固醇的標(biāo)記性輔助選擇位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)CYP7A1 mRNA在鵝肥肝中表達(dá)量低于普通肝臟,提示脂肪沉積越多的組織該基因表達(dá)越低[33]。這與本研究結(jié)果一致,去勢(shì)組與非去勢(shì)組相比,CYP7A1基因的|log2差異倍數(shù)|為-4.568,說(shuō)明豬去勢(shì)后伴隨著脂肪沉積增加,CYP7A1表達(dá)量顯著下調(diào)。

PPARGC1α是PPARγ的核轉(zhuǎn)錄輔激活因子,其主要在線粒體含量豐富的組織中表達(dá),例如棕色脂肪組織和肌肉組織,而在白色脂肪組織中表達(dá)量降低[34],所以本研究結(jié)果中PPARGC1α的FPKM值較低,尤其在去勢(shì)組其FPKM值僅為0.069,為PPAR信號(hào)通路中最低值。PPARGC1α通過(guò)與不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體的生物合成、肌纖維轉(zhuǎn)換、脂肪酸氧化等消耗能量的生物過(guò)程,本研究中與非去勢(shì)豬相比,去勢(shì)豬脂肪組織的分解代謝降低而合成代謝增高,所以該基因在非去勢(shì)組表達(dá)量更高。而PCK1(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)基因,其編碼的PEPCK酶不僅是糖異生過(guò)程的限速酶,還與甘油異生密切相關(guān)[35]。有研究發(fā)現(xiàn),PCK1基因表達(dá)量增加導(dǎo)致肝臟葡萄糖合成增加,出現(xiàn)胰島素抵抗等Ⅱ型糖尿病癥狀,說(shuō)明該基因在葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)具有重要作用[36]。小鼠的肝臟特異性敲除PCK1基因后出現(xiàn)脂肪肝[37],說(shuō)明該基因與脂肪沉積呈負(fù)相關(guān),這與本研究結(jié)果一致,脂肪沉積增多的去勢(shì)豬PCK1基因表達(dá)量顯著低于非去勢(shì)組。

綜上所述,豬去勢(shì)后出現(xiàn)雄性激素缺乏導(dǎo)致的脂肪沉積增多,即脂肪的合成代謝大于分解代謝。在這個(gè)過(guò)程中,PPAR信號(hào)通路共有17個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化,其中14個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào),差異基因|log2差異倍數(shù)|最大值為4.568,平均值為2.012,提示該信號(hào)通路在豬去勢(shì)肥育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。下一步研究需要明確雄性激素如何影響這些基因的表達(dá)。

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[33]邵丹,王來(lái)娣,張蕊,等.鵝肥肝形成相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,39(9):42-46.

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Effect of Castration on PPAR Signal Pathway Expression in Huainan Pig Subcutaneous Fat Tissue

WANG Jing1,BAI Xianxiao1,ZHANG Jiaqing1,GAO Binwen1,CHEN Junfeng1,GAO Yuan2,REN Qiaoling1,MA Qiang1,GUO Hongxia1,LIANG Yonghong1,XING Baosong1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou450002,China;2.Xinxian Bureau of Animal Husbandry,Xinxian465550,China)

Abstract：To detect the role of PPAR signal pathway on the castration-induced fat deposition,RNA was isolated from the subcutaneous fat tissues of three castrated Huainan pigs and three intact Huainan pigs.The high-throughput sequencing approach was used to identify mRNA expression difference in castrated and intact pigs.The screening threshold for these genes was P value<0.05 and |log2FoldChange|>1.Based on the difference of the mRNA and the KEGG enrichment analysis,the expression of PPAR signal pathway was the highest in the castrated pigs,of which fourteen genes were upregulated and three genes were downregulated.Lipogenic genes like fatty acid binding protein 7 gene(FABP7),aquaporin 7 gene(AQP7),retinoid X receptor,gamma gene(RXRγ)were upregulated significantly in castrated pigs,and lipolysis genes were downregulated like phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 gene(PCK1),peroxisome proliferator-activated receptor gamma,coactivator 1 alpha gene(PPARGC1α)and cytochrome P450,family 7,subfamily A,polypeptide 1 gene(CYP7A1).

Key words:Huainan pig;Differential expression gene;High throughput sequencing;PPAR signal pathway;Fat deposition

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.016

中圖分類號(hào)：S828;Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0092-06

作者簡(jiǎn)介：王璟(1985-),女,陜西潼關(guān)人,助理研究員,博士,主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。通訊作者：邢寶松(1969-),男,河南新密人,副研究員,博士,主要從事豬的育種與管理研究。

基金項(xiàng)目：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2015ZZ34)

收稿日期：2016-02-26