重組減蛋綜合征病毒KnobS干酪乳桿菌的構(gòu)建與表達(dá)

郭建軍,袁　林,曾　靜,邱小忠,付錦楠

(江西省科學(xué)院 微生物研究所,江西 南昌　330096)

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重組減蛋綜合征病毒KnobS干酪乳桿菌的構(gòu)建與表達(dá)

郭建軍,袁林,曾靜,邱小忠,付錦楠

(江西省科學(xué)院 微生物研究所,江西 南昌330096)

摘要：以干酪乳桿菌為傳遞載體,以開發(fā)食品級安全的減蛋綜合征病毒疫苗為目標(biāo),構(gòu)建了一個溫度敏感型自殺型質(zhì)粒系統(tǒng)pORZP-UKD。將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌L.casei中,經(jīng)過2次升溫處理和5-氟尿嘧啶抗性篩選,挑選陽性克隆,采用 PCR和 SDS-PAGE方法進(jìn)行鑒定。KnobS基因整合到干酪乳酸桿菌基因組內(nèi),并實(shí)現(xiàn)融合蛋白KnobS的分泌表達(dá)。表明得到了一株具有無任何選擇性標(biāo)記、攜帶有KnobS表達(dá)盒元件的基因組整合的重組干酪乳酸桿菌KnobSΔupp L.casei,且整合的外源基因能夠隨著細(xì)菌的復(fù)制而進(jìn)行表達(dá),為減蛋綜合征病毒免疫保護(hù)性抗原KnobS疫苗的進(jìn)一步研制提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：干酪乳桿菌;減蛋綜合征病毒KnobS蛋白;基因組表達(dá)

減蛋綜合征病毒(Eggdropsyndromevirus,EDSV)是禽腺病毒Ⅲ群中唯一的成員[1]。其宿主范圍較廣,毒株毒力差異較大,主要引起以群發(fā)性產(chǎn)蛋下降、產(chǎn)蛋異常、蛋體畸形、蛋質(zhì)低劣等為特征的傳染病[2]。纖維蛋白是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,可以識別細(xì)胞膜上的特異性受體[3],也可以阻斷大分子的合成,抑制病毒的增殖[4],且?guī)в兄饕膶俸蛠唽偬禺愋钥乖瓫Q定簇和次要的種特異性抗原決定簇,即減蛋綜合征病毒主要免疫保護(hù)性抗原纖維蛋白 KnobS就是 EDSV 的主要保護(hù)性抗原成分[5]。病毒通過腸道黏膜吸收或感染引起動物發(fā)病,以增強(qiáng)黏膜免疫為主的免疫方式是預(yù)防該病的有效措施[1-3]。

乳酸菌作為人和動物腸道、呼吸道和泌尿生殖道中的常在益生菌群之一[6],在食品發(fā)酵、飲品和飼料等領(lǐng)域有著悠久的應(yīng)用歷史,早被公認(rèn)為安全級微生物,它能維持動物腸道菌群平衡,促進(jìn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,提高動物機(jī)體的免疫力,特別是在提高人和動物的胃腸道黏膜免疫功能方面[7-9]。乳酸菌作為宿主菌表達(dá)外源蛋白或抗原的研究取得了一定進(jìn)展,并已證明重組乳酸菌可有效提高黏膜免疫系統(tǒng)提呈抗原及誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力,具有成為新型口服疫苗誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的潛力[6,10],這為進(jìn)一步將乳酸菌開發(fā)安全級的新型活載體疫苗誘導(dǎo)黏膜免疫奠定了重要的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)[11]。目前對于乳酸菌作為抗原傳遞系統(tǒng)表達(dá)外源抗原的研究主要集中在質(zhì)粒表達(dá)的研究方面[10,12]。質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)存在篩選的抗生素抗性基因,以此作為疫苗可能會使動物產(chǎn)生抗生素耐藥性問題[6,13],不符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)。而且,質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)存在不穩(wěn)定性,質(zhì)粒容易丟失等缺陷。

本研究以干酪乳桿菌為傳遞載體,以開發(fā)食品級安全的減蛋綜合征病毒疫苗為目標(biāo),成功構(gòu)建得到了一株具有無任何選擇性標(biāo)記、攜帶有KnobS表達(dá)盒元件的基因組整合的重組干酪乳酸桿菌,且整合的外源基因能夠隨著細(xì)菌的復(fù)制而進(jìn)行表達(dá),為進(jìn)一步研究 EDSV纖維蛋白KnobS生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ),并對開發(fā)預(yù)防EDSV的基因工程疫苗的研究具有一定參考作用。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和生長條件大腸桿菌DH5α、干酪乳桿菌Lactobacilluscasei393-Δupp[13]、質(zhì)粒 pMG36e-UP/LTB-KnobS和經(jīng)改造質(zhì)粒 pORZP[14]由江西省科學(xué)院微生物研究所生物工程中心保存和提供;克隆用質(zhì)粒 pMD18T-simple 購自大連寶生物公司。

干酪乳桿菌常規(guī)培養(yǎng)在 MRS培養(yǎng)基,30 ℃靜止培養(yǎng);大腸桿菌常規(guī)培養(yǎng)用 LB 培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)。干酪乳桿菌感受態(tài)制備用培養(yǎng)基以及方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.1.2主要試劑和材料限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶、T4DNA連接酶、蛋白質(zhì)Marker、DL2000 Marker、克隆載體pMD18T-simple均購自大連TaKaRa公司;MRS培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司;基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒購自愛思進(jìn)公司;電擊杯為BioRad產(chǎn)品;引物委托上海生工公司合成,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3引物設(shè)計根據(jù)質(zhì)粒 pMG36e-UP/LTB-KnobS上KnobS基因表達(dá)盒的基因序列[4]和 GenBank 中已登陸的干酪乳桿菌slpA基因的全序列[12],設(shè)計3對引物分別用于擴(kuò)增質(zhì)粒 pMG36e-UP/LTB-KnobS上KnobS基因表達(dá)盒片段、含干酪乳桿菌slpA基因的同源重組左右臂slpA-up和slpA-down,在各上下游引物的5′端加入保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)(劃線部分),各限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為構(gòu)建元件定向克隆到構(gòu)建骨架質(zhì)粒載體 pORZP而設(shè)計。各引物序列見表1。

表1　引物序列及酶切位點(diǎn)

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1擴(kuò)增KnobS基因表達(dá)盒KnobS-cassette從質(zhì)粒pMG36e-UP/LTB-KnobS擴(kuò)增含啟動子P32、分泌信號肽基因序列(ssusp)、具有黏膜免疫佐劑的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)及編碼減蛋綜合征病毒主要免疫保護(hù)性抗原纖維蛋白KnobS基因序列的基因表達(dá)盒基因片段,并設(shè)計引物K1/K2,以含有KnobS基因表達(dá)盒全序列的 pMG36e-UP/LTB-KnobS為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。目的片段KnobS-cassette與克隆載體pMD18T-simple連接,轉(zhuǎn)化后,涂布于含有氨芐抗性的 LB培養(yǎng)基,挑選陽性結(jié)果,提取質(zhì)粒用SalⅠ/XmaⅠ酶切初步鑒定,進(jìn)行測序,所獲得質(zhì)粒命名為pMD18-KnobS。

1.2.2同源重組臂的擴(kuò)增根據(jù) GenBank(Accession:M60178.1)公布的LactobacilluscaseiATCC 334基因序列和GenBank(Accession:X76884)公布的slpA基因序列設(shè)計引物P1/P2和D1/D2,并分別以Lactobacilluscasei393基因組為模板擴(kuò)增同源重組左右臂slpA-up和slpA-down,引物設(shè)計見表1。然后連接到TaKaRa的pMD-18T simple 載體。轉(zhuǎn)入DH5α,藍(lán)白斑篩選,提取質(zhì)粒PCR擴(kuò)增鑒定和測序驗(yàn)證,獲得質(zhì)粒分別命名為pMD18-slpA-up和pMD18-slpA-down。

1.2.3同源整合載體 pORZP-UKD 的構(gòu)建質(zhì)粒 pORZP 和質(zhì)粒 pMD18-KnobS分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XmaⅠ進(jìn)行雙酶切,回收酶切過的目的片段,用 T4DNA連接酶將兩基因片段連接得到質(zhì)粒pORZP-K。將質(zhì)粒pORZP-K和質(zhì)粒pMD18-slpA-up分別用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切,純化目的片段,將同源左臂slpA-up基因片段連接到pORZP-K 雙酶切得到的較大片段上,獲得重組質(zhì)粒 pORZP-UK。質(zhì)粒pORZP-UK和質(zhì)粒pMD18-slpA-down分別用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XmaⅠ進(jìn)行雙酶切,回收兩目的酶切片段。將同源右臂基因片段slpA-down連接到 pORZP-UK雙酶切得到的較大片段上,得到最終目的同源整合載體pORZP-UKD。

將以上構(gòu)建得到的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒 pORZP-UKD,采用酶切和 PCR 方法鑒定陽性克隆并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4同源整合載體轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌將同源整合載體質(zhì)粒pORZP-UKD電轉(zhuǎn)化入攜帶有輔助質(zhì)粒pTRK669的干酪乳桿菌Lactobacilluscasei393-Δupp的感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化后的干酪乳桿菌涂布于同時含有氯霉素(5 mg/L)和紅霉素(5 mg/L)的MRS培養(yǎng)基平板上;挑選出長勢較好的菌落,在高溫(42 ℃)和含抗性(5 mg/L紅霉素) 雙重選擇壓力下連續(xù)傳代培養(yǎng)3次,使之進(jìn)行同源重組;然后通過重組菌在含100 μg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)的MRS培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng),反復(fù)傳代多次,以篩選整合突變體。

1.2.5重組干酪乳桿菌的篩選與鑒定經(jīng)篩選得到的整合突變體提取基因組DNA,通過 PCR 驗(yàn)證確定基因KnobS是否已經(jīng)整合到干酪乳桿菌的染色體上。通過 PCR 擴(kuò)增質(zhì)粒載體上存在的基因KnobS,以驗(yàn)證載體是否已整合。將選擇得到的整合轉(zhuǎn)化子接種至含5-氟尿嘧啶的MRS液體試管中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,提取其基因組 DNA,用引物K1/K2進(jìn)行PCR檢測,并回收目的片段送上海生工測序。同時將培養(yǎng)后的菌液先離心去除菌體后,取 30%和 80%(NH4)2SO4之間的沉淀物用少量去離子水溶解,進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳。

2結(jié)果與分析

2.1KnobS基因表達(dá)盒KnobS-cassette的擴(kuò)增

以pMG36e-UP/LTB-KnobS質(zhì)粒DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,可清晰見到約970 bp的特異性擴(kuò)增帶,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1-A)。用凝膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至 pMD18T-simple,用SalⅠ/XmaⅠ消化后可產(chǎn)生一條約1 000 bp的片段(圖1-B),與預(yù)計相同。測序結(jié)果表明PCR 產(chǎn)物與KnobS-cassette基因序列完全一致。

A：1.PCR擴(kuò)增KnobS-cassette;M.DL2000 DNA Marker。

2.2同源整合載體的構(gòu)建

以Lactobacilluscasei393基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,用 P1/P2 PCR 擴(kuò)增得到615 bp的slpA-up;引物 D1/D2 PCR擴(kuò)增得到567 bp的slpA-down;PCR 結(jié)果見圖2,由圖可知,成功獲得同源重組臂slpA-up和slpA-down,分別連接到pMD18T-simple載體,用相應(yīng)的酶進(jìn)行鑒定,可切出約610 bp 的slpA-up和560 bp 的slpA-down,測序正確,分別命名為 pMD18-slpA-up和pMD18-slpA-down,表明構(gòu)建成功。

1.同源重組左臂slpA-up;2.同源重組右

依次將克隆得到的KnobS基因表達(dá)盒KnobS-cassette(969 bp )、同源重組左臂slpA-up基因(615 bp)和同源重組右臂slpA-down片段(567 bp )構(gòu)建至質(zhì)粒pORZP上。 成功構(gòu)建得到整合表達(dá)載體pORZP-UKD,其片段大小為 5 246 bp,整個構(gòu)建過程見圖3。

圖3　同源整合載體pORZP-UKD的構(gòu)建

2.3同源重組及鑒定

同源整合載體pORZP-UKD電轉(zhuǎn)化Lactobacilluscasei393-Δupp感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含紅霉素和氯霉素抗性的平板,挑取單菌在含紅霉素的MRS平板,42 ℃培養(yǎng),傳代培養(yǎng)3次,使之進(jìn)行同源重組;然后通過在含5-氟尿嘧啶的MRS培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng),反復(fù)傳代多次,篩選整合轉(zhuǎn)化子,選取在含100 μg/L 5-氟尿嘧啶的平板上長勢較好的單菌落作為突變體,以此作為重組菌株,KnobS基因的整合過程見圖4。

圖4　同源整合模式

將篩選得到突變體提取基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增同源整合載體上存在的KnobS基因表達(dá)盒KnobS-cassette序列,以確定KnobS基因是否已經(jīng)整合到干酪乳桿菌的染色體上,并以初始菌株Lactobacilluscasei393-Δupp作為陰性對照。 結(jié)果見圖 5。凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)篩選到的 5 個突變體的基因組均擴(kuò)增出KnobS基因特異性條帶,且大小與預(yù)計相符,而出發(fā)菌株Lactobacilluscasei393-Δupp無此條帶,這證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體pORZP-UKD中的KnobS基因已整合到干酪乳桿菌基因組中。

M.DNA Marker DL2000;1.初始菌株;2～6.重組菌株轉(zhuǎn)化子。

2.4同源整合載體的功能驗(yàn)證

收集重組菌培養(yǎng)的菌液,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250染色和甲醇/冰乙酸脫色后,放入凝膠成像系統(tǒng)中分析目的蛋白,結(jié)果表明(圖6-A),重組蛋白 KnobS以分泌型表達(dá)的形式表達(dá),符合預(yù)期大小約 33 kDa。利用KnobS抗體對目的蛋白進(jìn)行免疫印跡分析可見目的條帶且無雜帶,表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白KnobS能被陽性血清所識別,也驗(yàn)證了表達(dá)產(chǎn)物為蛋白KnobS(圖6-B),說明實(shí)現(xiàn)KnobS基因同源整合到干酪乳桿菌中,并能夠分泌表達(dá)具有免疫學(xué)活性的重組融合蛋白KnobS。

A:1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);2～3.Δupp L. casei細(xì)胞及培養(yǎng)液上清;

3討論

由于乳酸菌是人和動物腸道常在的益生菌[6],所以它的安全是毋庸置疑的,目前已經(jīng)有些病原體抗原保護(hù)性抗原在乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)[10,12],通過免疫分析該表達(dá)系統(tǒng)不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫還能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫[8,15],這對于抵抗病原微生物的感染是非常重要的[7]。但是上述表達(dá)形式均是以質(zhì)粒形式進(jìn)行的,雖然質(zhì)粒的多拷貝性使得外源基因能夠得到高效表達(dá),并產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫效果[13],但是,質(zhì)粒的不穩(wěn)定性會導(dǎo)致外源基因尤其是抗生素抗性基因的遷移[16],將外源基因構(gòu)建于質(zhì)粒載體而獲得基因工程菌在疫苗領(lǐng)域中應(yīng)用受到極大限制,因此,構(gòu)建生態(tài)安全型的基因工程菌株就是將外源基因整合到受體菌基因組上且不帶入外源抗性基因。為了構(gòu)建一株無任何選擇性標(biāo)記的食品級疫苗候選株,筆者選擇了溫度敏感型載體,當(dāng)溫度升高到42 ℃以上時,該質(zhì)粒不發(fā)生復(fù)制,同時還可以通過載體上設(shè)計的同源臂序列和宿主染色體DNA發(fā)生位點(diǎn)特異性重組,從而獲得一株無任何選擇性抗性的基因組整合重組菌株。

pORI系統(tǒng)利用了溫度敏感型雙質(zhì)粒的復(fù)制互補(bǔ)功能,該系統(tǒng)由輔助質(zhì)粒和主質(zhì)粒組成,其中輔助質(zhì)粒攜帶完整野生型pORI復(fù)制子,基因打靶的主質(zhì)粒即雙交換重組的轉(zhuǎn)移載體,攜帶缺失repA基因的pORI溫度敏感型穿梭型缺陷型復(fù)制子系統(tǒng),主質(zhì)粒只需要轉(zhuǎn)化一次,通過2次同源重組后可獲得無痕操作的突變體[13,16],篩選簡易方便,不產(chǎn)生假陽性突變體。Douglas等[12]利用pORI系統(tǒng)將gusA3報告基因分別插入到嗜酸乳桿菌NCFM中3個高表達(dá)區(qū)域和一個低表達(dá)區(qū)域,每個位點(diǎn)的gusA3表達(dá)用ELISA方法測定gusA3的活性。Goh等[17]應(yīng)用已經(jīng)構(gòu)建的pORI-based敲除系統(tǒng),通過雙重組將slpX基因的S層蛋白敲除。Kristich等[18]在糞腸球菌研究中利用5-FU作為陽性/陰性選擇性標(biāo),構(gòu)建了srtA突變體。在L.caseATCC 393中,upp基因也是非必需基因[19],如果將該基因缺失該菌株就能獲得5-FU抗性,因此,可以將upp基因作為反選擇標(biāo)記基因[20]。

在本研究中,利用upp基因可缺失的特性構(gòu)建了反選擇標(biāo)記替換系統(tǒng)[20],并構(gòu)建KnobS表達(dá)盒代替upp基因。重組菌通過2次升溫之后,涂含5-FU抗性的MRS抗性平板進(jìn)行篩選。篩選出的單菌落用PCR的方法進(jìn)行初步鑒定,用Western Blot的方法驗(yàn)證得到目的條帶,可以斷定其所構(gòu)建的基因組整合菌株確實(shí)能夠有效地表達(dá)外源蛋白,得到了安全無毒的重組產(chǎn)減蛋綜合征病毒主要免疫保護(hù)性抗原纖維蛋白KnobS口服活菌疫苗,為減蛋綜合征病毒免疫保護(hù)性抗原KnobS疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。本研究也為構(gòu)建攜帶其他病原體抗原的基因組整合重組干酪乳桿菌的研制提供了可靠的技術(shù)保障和理論基礎(chǔ)。

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The Construct and Expression ofKnobSGene ofEggdropsyndromevirusinL.caseiGenome

GUO Jianjun,YUAN Lin,ZENG Jing,QIU Xiaozhong,FU Jinnan

(Institute of Microbiology,Jiangxi Academy of Sciences,Nanchang330096,China)

Abstract：To develop an EDSV(Egg drop syndrome virus) vaccine that live up to the standard of food safety,a temperature-sensitive suicide plasmid pORZP-UKD was constructed using L.casei as a transmitted vector.After transforming it into L.casei using electric shock,two temperature-elevating treatments and a 5-FU screening were performed to get positive clone.Upon the identification of putative clone by PCR and SDS-PAGE,we successfully obtained a recombinant strain,KnobSΔupp L.casei,which has no selective-marker but harbors a KnobS expression box.Any exogenous gene can be integrated into this recombinant strain and express its products as bacteria replicate itself,thus providing the experimental basis for the further development of protective Knobs antigen vaccine against Egg drop syndrome virus.

Key words:Lactobacillus casei;KnobS protein of Egg drop syndrome virus;Genome expression

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.014

中圖分類號：Q78;S432.4+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0081-06

通訊作者：袁林(1980-),男,江西德安人,助理研究員,博士,主要從事基因工程與分子生物學(xué)研究。

作者簡介：郭建軍(1984-),男,江西崇仁人,助理研究員,碩士,主要從事有益微生物分子遺傳及資源利用研究。

基金項(xiàng)目：江西省科技支撐計劃項(xiàng)目(20142BBF60036);江西省自然(青年)科學(xué)基金項(xiàng)目(2013BAB214014)

收稿日期：2016-02-15