甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因的克隆與表達(dá)分析

葛風(fēng)偉,江　一,趙惠新

(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊　830054)

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甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因的克隆與表達(dá)分析

葛風(fēng)偉,江一,趙惠新

(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊830054)

摘要：水孔蛋白是位于質(zhì)膜和液泡膜等生物膜上主要負(fù)責(zé)水分跨膜運(yùn)輸?shù)耐ǖ赖鞍?。為了分析甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)過程水分調(diào)控的分子機(jī)制,采用RT-PCR法從甘藍(lán)型油菜種子中克隆了液泡膜內(nèi)在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并對(duì)甘藍(lán)型油菜種子TIP4;1基因在種子萌發(fā)過程及干旱、低溫和鹽脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。結(jié)果表明,TIP4;1基因在干種子中表達(dá)水平很低,但是在種子萌發(fā)過程中表達(dá)量增加。此外,在干旱、低溫及鹽的脅迫處理下,TIP4;1基因的表達(dá)上調(diào),結(jié)果暗示著該基因可能參與了甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)和逆境響應(yīng)過程。隨著研究的深入,水孔蛋白的水分調(diào)控機(jī)制將進(jìn)一步被揭示,這對(duì)于解決干旱脅迫和鹽脅迫等實(shí)際問題具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜;水孔蛋白;TIPs;萌發(fā);qRT-PCR

植物很多生長(zhǎng)發(fā)育過程都依賴水分在細(xì)胞間的流動(dòng),水分對(duì)于作物的產(chǎn)量也至關(guān)重要[1]。水孔蛋白(Aquaporin,AQP)屬于通道蛋白MIP超家族成員,AQPs可以實(shí)現(xiàn)水分等其他小分子溶質(zhì)的跨膜運(yùn)輸[2-3]。高等植物的AQPs主要位于質(zhì)膜和液泡膜上,分別稱之為質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasmaintrinsicprotein,PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(Tonoplastintrinsicproteins,TIPs)[4-7]。AQPs普遍存在于植物中,在種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、受精、逆境應(yīng)答等植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-12]。特別是在種子吸水和早期胚胎發(fā)育階段,AQPs是水分跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕緩絒13]。另外,植物AQPs的表達(dá)受到環(huán)境條件和植物激素的調(diào)節(jié),已知干旱、高溫、低溫、高鹽和營(yíng)養(yǎng)虧缺等環(huán)境脅迫均可調(diào)控AQPs的表達(dá)[12,14-16]。

迄今有關(guān)植物AQPs的研究主要集中在PIPs上。但有研究表明,TIPs的導(dǎo)水性能是PIPs的上千倍,更利于水分的快速轉(zhuǎn)移,因而其在細(xì)胞滲透壓及植物水分代謝的快速調(diào)節(jié)中可能起著更為重要的作用[17-19]。Sade等[19]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因番茄(Solanum lycopersicum)株系SlTIP2;2的過量表達(dá)可使其液泡膜在鹽脅迫和干旱脅迫下依然具有很高的水通透性,并得以維持液泡對(duì)細(xì)胞質(zhì)滲透壓的緩沖作用和提高抗逆性。植物AQPs的發(fā)現(xiàn)及其表達(dá)與調(diào)控研究無疑為人們從分子水平深入探討和闡明植物水分代謝及其調(diào)控機(jī)制提供了很好的契機(jī)。

甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)屬于十字花科蕓薹屬雙子葉植物,是世界上主要的油料作物。迄今對(duì)于植物中水孔蛋白AQPs的研究大都集中在擬南芥、水稻、煙草、玉米等模式植物上,但有關(guān)甘藍(lán)型油菜水孔蛋白AQPs基因尤其是TIPs亞類基因的克隆和研究甚少。此外,對(duì)該基因在甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)過程中水分調(diào)控的分子機(jī)制還不清楚。種子萌發(fā)的質(zhì)量直接決定幼苗的形態(tài)建成及后期的產(chǎn)量。因此,TIP基因的研究對(duì)于理解種子的萌發(fā)過程有重要意義。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料為當(dāng)年新收獲的甘藍(lán)型油菜種子。TRIzol總RNA抽提試劑盒、MMLV第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物公司,DNA凝膠回收試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,菌株為E.coliDH5α(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存),質(zhì)粒為pMD18-T Vector(Invitrogen),其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因的克隆

1.2.1試驗(yàn)材料培養(yǎng)與總RNA的提取甘藍(lán)型油菜種子置于23 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。收集吸水萌發(fā)后48h的種子,快速冷凍到液氮中,用于總RNA的提取。采用TRIzol法提取RNA,用紫外分光光度法測(cè)定RAN的OD值,檢測(cè)其純度。

1.2.2引物設(shè)計(jì)及RT-PCR擴(kuò)增根據(jù)TIPs基因進(jìn)化保守的特點(diǎn),利用ClustalX軟件對(duì)從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到的植物TIPs基因序列進(jìn)行同源性比較,在保守區(qū)域找出保守區(qū)段。利用Primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物用于RT-PCR分析,上游引物F:5′-AGTCCAATACTGGTCATCCG-3′;下游引物R:5′-GATTTTGAGGGAAGCGGT-3′,引物由華大基因合成。取2μg甘藍(lán)型油菜總RAN,根據(jù)MMLV第一鏈cDAN反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板,用合成的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增分析。PCR擴(kuò)增體系:cDNA2μL,F、R(10μmol/L)各1μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,Taq酶0.5μL,10×PCRBuffer2.5μL,dNTPMixture(2.5mmol/L)2μL,用滅菌超純水定量補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3min;94 ℃ 30s,64 ℃ 45s,72 ℃ 60s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃再延伸10min。獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照凝膠回收試劑盒(AxyGEN)說明進(jìn)行純化回收。

1.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建取2μL回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體,重組質(zhì)粒構(gòu)建按照說明書進(jìn)行。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,置于37 ℃ 培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒。

1.2.4測(cè)序分析挑取單克隆菌落,進(jìn)行PCR鑒定,并將陽性單克隆送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Blast算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行分析。

1.3TIP4;1基因的qRT-PCR分析

1.3.1特異性引物的設(shè)計(jì)由于TIPs基因家族高度保守性的特點(diǎn),因此進(jìn)行qRT-PCR分析時(shí)設(shè)計(jì)特異性的引物顯得非常關(guān)鍵。使用Primer5軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物,原則是設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避開這些保守區(qū)。為此,首先使用ClustalX軟件對(duì)NCBI上搜索到的植物TIPs基因進(jìn)行核酸序列的同源比對(duì),并找到這些序列的保守區(qū),在設(shè)計(jì)特異性引物時(shí)盡量避開這些保守區(qū)。另外,對(duì)于設(shè)計(jì)的每對(duì)引物,至少都要保證有一條引物的3′ 末端是高度特異的。設(shè)計(jì)出1對(duì)特異性引物,上游引物:5′-CTCGTGCTTGCTGTATCTT-3′;下游引物:5′-CGGGAGTGACTTATTCGG-3′。為了保證每對(duì)引物的特異性,需將每對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序。

1.3.2TIP4;1基因在不同組織的表達(dá)分析為了分析不同器官中TIPs基因的表達(dá)情況,收集了種植于大田的甘藍(lán)型油菜植株的根、莖、葉、花和21DAP種子的材料,用于總RNA的提取。

qRT-PCR分析方法如下:使用qRT-PCR特異性引物,以不同組織的cDNA第一鏈為模板,在StepOneReal-timePCRsystem(ABI)上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。本試驗(yàn)以甘藍(lán)型油菜的β-actin(序列號(hào)No.AF111812)作為內(nèi)參。qRT-PCR的擴(kuò)增程序如下(兩步法):95 ℃預(yù)變性10min;95 ℃ 15s,60 ℃ 60s,運(yùn)行40個(gè)循環(huán);接下來步驟是60～95 ℃的融解曲線。通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析甘藍(lán)型油菜TIPs基因的相對(duì)表達(dá)量,用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3種子萌發(fā)過程TIP4;1基因的qRT-PCR分析在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中鋪2層濾紙,用4mL滅菌去離子水充分浸潤(rùn)濾紙,挑選完整的甘藍(lán)型油菜種子50粒均勻排列在培養(yǎng)皿中(設(shè)置3個(gè)重復(fù)),于23 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。分別收集不同吸水時(shí)期(0,6,12,24,48,72,96,120h)的種子材料,快速冷凍到液氮中,用于總RNA的提取。qRT-PCR分析方法參見1.3.2。

1.3.4逆境脅迫下TIP4;1基因的qRT-PCR分析為了研究種子萌發(fā)過程中非生物脅迫對(duì)TIP基因表達(dá)的影響,設(shè)置了干旱、低溫和鹽脅迫3種處理。在PEG干旱脅迫處理中,使種子在20%PEG6000溶液中萌發(fā)。分別于PEG處理后的6,12,24,48,72h收集整個(gè)種子材料,快速冷凍于液氮中用于總RNA提取。在低溫脅迫處理中,將種子置于12 ℃的低溫下萌發(fā)。低溫脅迫取材時(shí)間與PEG脅迫處理時(shí)間相同,之后將材料快速冷凍于液氮中,用于總RNA的提取。在鹽脅迫處理中,將種子置于150mmol/LNaCl溶液中萌發(fā)。分別于NaCl脅迫處理后的6,12,24,48h收集整個(gè)種子并冷藏于液氮中,用于總RNA的提取。將種子置于純水中萌發(fā)相應(yīng)的時(shí)間(6,12,24,48,72h)作為對(duì)照。對(duì)于每種處理,均分3次收集材料作為生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR分析方法參見1.3.2。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA質(zhì)量檢測(cè)

將甘藍(lán)型油菜種子的總RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1),結(jié)果顯示28S、18S和5S條帶整齊清晰,且28S基本為18S亮度的2倍,表明所提總RNA完整性較好,沒有降解。紫外分光光度檢測(cè)OD260/280為1.8～2.0。檢測(cè)結(jié)果表明,總RNA的純度、完整性都比較高,適用于下一步的RT-PCR分析。

2.2甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因片段的PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDAN為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了600bp左右片段(圖2)。該片段與預(yù)期目的片段的大小相一致。對(duì)此擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收,將回收的產(chǎn)物連接到pMD18-T,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞中進(jìn)行菌落培養(yǎng),挑取白斑進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。得到的片段與上述以cDAN為模板得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度相同,證明PCR擴(kuò)增的片段已克隆到pMD18-T載體上。

圖1　總RNA的提取

M.DNA分子量(DL2000);1.TIP4;1基因;2.陰性對(duì)照。

2.3甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因的測(cè)序及分析

測(cè)序結(jié)果表明,所獲得基因長(zhǎng)度為599bp(圖3),編碼91個(gè)氨基酸殘基。Blast比較結(jié)果顯示:該片段的核苷酸序列與其他植物TIP4;1基因的核苷酸序列的同源性均為74%～99%,其中同源性最高的是甘藍(lán)型油菜,為99%(XM_013837778),與擬南芥的同源性為89%(NM_128141),所以將其命名為TIP4;1。為了獲得更準(zhǔn)確的信息,用BlastX繼續(xù)同源搜索,因?yàn)樵摮绦驅(qū)⒑怂嵝蛄蟹g成蛋白進(jìn)行搜庫,所以獲得的信息更準(zhǔn)確。BlastX同源搜索結(jié)果表明,所克隆的基因具有AQPs超基因家族特有的保守結(jié)構(gòu)域(圖4),因此,推測(cè)其為AQPs超基因家族的TIPs亞家族成員。

圖3　甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因序列

圖4　甘藍(lán)型油菜TIP4;1蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.4甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因表達(dá)的qRT-PCR分析

2.4.1甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因在植株不同器官中的表達(dá)為了研究TIP4;1基因的表達(dá)模式,采用qRT-PCR方法分析了該基因在甘藍(lán)型油菜生殖生長(zhǎng)期植株不同器官的表達(dá)情況(圖5)。分別以根、莖、葉和花器官的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,TIP4;1基因在根、莖、葉和花器官都有表達(dá),且在花器官中的表達(dá)量最高。

栽種于大田間7月齡植株的上述器官用于總RNA的提取。甘藍(lán)型油菜β-actin作為內(nèi)參基因。相對(duì)表達(dá)量采用TIP4;1的表達(dá)量與β-actin的表達(dá)量之比(AQP/ACTIN)來表示?？v軸表示基因的相對(duì)表達(dá)量“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。圖6同。

TotalRNAwasextractedfromvarioustissuesof7-monthold

plantsgrowninfield.B.napus β-actinwasusedasaninternalcontrol.

ThetranscriptlevelsofTIP4;1genecomparedtoACTIN(AQP/ACTIN)

wereplottedastherelativeexpressionlevel.Theverticalcolumnindicates

therelativetranscriptlevel.Thevaluesaremeans±SDofthree

biologicalreplicates.ThesameasFig.6.

圖5TIP4;1基因在根、莖、葉、

花和受精21d的種子中的相對(duì)表達(dá)

Fig.5TherelativeexpressionlevelsofTIP4;1inroots,

stems,leaves,flowersand21DPAseedsbyqRT-PCR

2.4.2甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因在種子萌發(fā)過程中的表達(dá)為了進(jìn)一步研究TIP4;1基因的表達(dá)模式,采用qRT-PCR分析其在甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)過程及幼苗階段的表達(dá)(圖6)。分別以吸水0,6,12,24,48,72,96,120h的種子為材料提取總RNA,之后以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。通過種子萌發(fā)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)干種子吸水12h,萌發(fā)率達(dá)到56%;吸水24h,所有的種子已經(jīng)完成了萌發(fā)。定量分析結(jié)果表明,TIP4;1基因在干種子中不表達(dá),但吸水6h后檢測(cè)到該基因的表達(dá),且在吸水后12h達(dá)到最大水平,之后在幼苗階段(24～120h)維持相對(duì)高的轉(zhuǎn)錄本水平。

圖6　TIP4;1基因在種子萌發(fā)過程與幼苗階段的表達(dá)情況

2.4.3干旱、低溫和鹽脅迫對(duì)TIP4;1基因表達(dá)的影響為了進(jìn)一步研究逆境脅迫對(duì)TIP4;1基因表達(dá)的影響,分別用20%PEG6000和12 ℃低溫處理種子6,12,24,48,72h;用150mmol/LNaCl處理種子6,12,24,48h,之后按上述各處理時(shí)間分別提取總RNA。種子在正常情況下(21 ℃)萌發(fā)作為脅迫處理的對(duì)照。

結(jié)果顯示(表1),TIP4;1基因的轉(zhuǎn)錄水平在PEG處理12h之內(nèi)快速下降到對(duì)照的十分之一。在PEG處理24h后,TIP4;1基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯上調(diào),是對(duì)照的2倍,但之后快速下降到對(duì)照的二分之一。低溫脅迫處理后,TIP4;1基因的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),表達(dá)量最高可達(dá)對(duì)照的1.6倍。在150mmol/LNaCl的脅迫處理下,TIP4;1基因的表達(dá)快速上調(diào),可達(dá)對(duì)照的1.4倍。脅迫處理24h后,TIP4;1基因的表達(dá)再次上調(diào),是對(duì)照的3倍。

3結(jié)論與討論

植物AQPs主要位于質(zhì)膜和液泡膜上,分別稱之為質(zhì)膜內(nèi)在蛋白PIPs和液泡膜內(nèi)在蛋白TIPs。根據(jù)C端和N端的特征,將分布于液泡膜上的TIPs分為TIP1～TIP5 5個(gè)亞類。植物中第一個(gè)水孔蛋白γ-TIP是由Maurel等[20]從擬南芥中分離出來,該基因在爪蟾卵母細(xì)胞中的異源表達(dá)證明它具有水分運(yùn)輸特征,屬于植物水孔蛋白中的TIPs。如今,許多模式植物整套水孔蛋白基因已經(jīng)被成功克隆和鑒定,而對(duì)于最重要的油料作物之一甘藍(lán)型油菜來說,由于缺乏詳細(xì)的基因組數(shù)據(jù)信息,其大部分水孔蛋白AQPs的序列信息至今仍然未知?；谝陨戏治?從甘藍(lán)型油菜種子中克隆1個(gè)TIP4;1基因,Blast比較分析表明該基因?qū)儆贏QPs基因家族的TIPs亞家族成員。

植物水孔蛋白AQPs有組織或器官表達(dá)的特異性[21]。近年來,有研究表明擬南芥AQPs基因主要在根和花中表達(dá),而在葉中無特異性表達(dá)[22]。2014年Ge等[23]的研究表明,BnPIP2;5、BnPIP2;7、BnPIP2;2和BnPIP2基因的轉(zhuǎn)錄本更豐富地在花中積累。本研究中,TIP4;1基因在根、莖、葉和花器官都有表達(dá),且在花器官中的表達(dá)量最高,但其在花器官中的作用有待于進(jìn)一步研究。

表1　甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因在干旱、低溫和鹽脅迫處理后的相對(duì)表達(dá)

注:處理時(shí)間如下:20 % PEG 6000處理和12 ℃低溫處理種子時(shí)間均是6,12,24,48,72 h;150 mmol/L NaCl處理種子時(shí)間是6,12,24,48 h。TIP4;1基因在正常情況下吸水相對(duì)應(yīng)時(shí)間的表達(dá)量作為對(duì)照。相對(duì)表達(dá)量為TIP4;1基因在脅迫處理下的表達(dá)與對(duì)照(正常情況)下表達(dá)的比值,“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

Note:Timegradienttreatments:seedsweredealtwith20%PEGor12 ℃coldfor6,12,24,48,72hrespectively;150mmol/LNaClfor6,12,24,48h.ExpressionlevelsofTIP4;1inseedsgerminatedundernon-stressedconditionatcorrespondingtimepointswereusedasacontrol.Therelativevaluesaretreated/controlratio(fold).Valuesaremeans±SDof3replicates.

種子萌發(fā)過程植物組織的含水量發(fā)生了極大變化,TIPs在種子萌發(fā)過程起著重要作用。擬南芥的TIP蛋白AtTIP1;2和AtTIP2;1在種子萌發(fā)階段大量表達(dá),Li等[24]證實(shí)了其對(duì)液泡滲透調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。Maurel[25]發(fā)現(xiàn)γ-TIP在種子萌發(fā)及幼苗期表達(dá),證實(shí)其參與了種子萌發(fā)過程細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)和幼苗初期細(xì)胞的伸長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),在干種子中未檢測(cè)到TIP4;1基因的表達(dá),而在種子萌發(fā)過程和早期幼苗階段其表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。尤其在胚根出現(xiàn)的前幾個(gè)小時(shí)(12h內(nèi)),TIP4;1基因的表達(dá)增強(qiáng),在吸水12h后達(dá)到最大表達(dá)量,這與胚根出現(xiàn)的時(shí)間恰巧一致。TIP4;1基因在吸水的種子中高表達(dá)可能與種子萌發(fā)初期階段水分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及促進(jìn)水分向不斷膨脹的組織供給有關(guān)。此外,種子吸水24h后TIP4;1基因表達(dá)上調(diào),這意味著除了參與種子的萌發(fā)過程,該基因可能同時(shí)也參與了幼苗初期階段的發(fā)育過程。TIP4;1基因在不同器官和種子萌發(fā)過程中的表達(dá)模式說明其表達(dá)是受發(fā)育調(diào)控的。

研究表明,水孔蛋白AQPs在植物的水分平衡中起著重要作用[22,26-27],環(huán)境刺激也在不同水平上調(diào)控TIPs的表達(dá)[28]。植物AQPs基因在擬南芥等植物中對(duì)逆境(低溫、干旱、鹽脅迫)表現(xiàn)出上調(diào)或者下調(diào)[26,29-31]。受到干旱脅迫,擬南芥AQPs基因的表達(dá)上調(diào)[22],本研究還表明,在干旱脅迫24h后，TIP4;1基因的表達(dá)是對(duì)照的2倍。植物在干旱脅迫下需要保持細(xì)胞內(nèi)一定的水分來維持正常的生理功能,這就需要在一些細(xì)胞和組織中提高水孔蛋白AQPs的表達(dá)[32]。水孔蛋白的上調(diào)表達(dá)使細(xì)胞膜對(duì)水分子的通透性加強(qiáng),可以增加細(xì)胞對(duì)水分的獲取。在低溫脅迫下,擬南芥的水孔蛋白AQPs的表達(dá)也受到一定的影響[21]。Ge等[23]發(fā)現(xiàn),冷脅迫處理6h后甘藍(lán)型油菜的BnTIP2基因表達(dá)量迅速增加到對(duì)照的46倍,本研究結(jié)果也得到類似結(jié)論。TIP4;1基因在冷脅迫下的表達(dá)持續(xù)上調(diào),在處理72h后表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的1.6倍。研究表明,植物對(duì)鹽脅迫最敏感的響應(yīng)是根的導(dǎo)水性受到抑制[33]。10mmol/LNaCl處理下,野生型擬南芥根的導(dǎo)水性快速下降;而水孔蛋白PIP2;5基因過量表達(dá)的擬南芥,其根的導(dǎo)水性不受影響[34]。Sutka等[33]認(rèn)為,細(xì)胞導(dǎo)水性的抑制作用是通過水孔蛋白的表達(dá)和活性來實(shí)現(xiàn)的[34]。在轉(zhuǎn)錄水平上,鹽脅迫也影響大多數(shù)AQPs基因的表達(dá)。本研究中,鹽脅迫初期(6h內(nèi)),甘藍(lán)型油菜TIP4;1基因的表達(dá)上調(diào)。隨后經(jīng)過短暫的表達(dá)量下降之后,在吸水24h后該基因的表達(dá)再次上調(diào)并達(dá)到最大(對(duì)照的3倍)。綜上所述,在非生物因素逆境脅迫下,TIP4;1基因的這種上調(diào)或者下調(diào)表達(dá),可能在脅迫處理的初期階段為減少水分的散失起到一定作用,同時(shí)加速處理后期的水分吸收過程,以此來保持甘藍(lán)型油菜在逆境條件下的水分平衡[26]。

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CloningandExpressionAnalysisofTIP4;1GenefromBrassica napus

GE Fengwei,JIANG Yi,ZHAO Huixin

(Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology,College of Life Science,Xinjiang Normal University,Urumqi830054,China)

Abstract：Aquaporins are channel proteins,which located in biological membranes including plasma membrane and tonoplast.It can highly facilitate water transportation across biological membranes.To investigate molecular mechanism of water regulation during seed germination,a tonoplast intrinsic proteins(TIPs)gene fragment TIP4;1 was isolated from Brassica napus seed by RT-PCR.The expression of TIP4;1 gene during seed germination and stresses treatment was analyzed by quantitative Real-time PCR(qRT-PCR).The transcription levels of TIP4;1 was analyzed during germination,and these results showed TIP4;1 expression levels was scarcely detected in dry seed,but was up-regulated during germination as well as early young seedlings.In addition,expression of TIP4;1 in response to abiotic stress was investigated,and results showed that TIP4;1 gene expression was upregulated under drought,cold and salt stress,suggesting that TIP4;1 may be involved in Brassica napus seed germination and stress response process.Aquaporin regulation mechanism would be further revealed in future,which had realistic significance for solving drought and salt stress problems.

Key words:Brassica napus;AQPs;TIPs;Seed germination;qRT-PCR

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.007

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0032-06

作者簡(jiǎn)介：葛風(fēng)偉(1976-),女,江蘇新沂人,講師,博士,主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。通訊作者：趙惠新(1975-),女,新疆奇臺(tái)人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室”項(xiàng)目(XJDX1414-2015-07);新疆師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(XJNUBS1541)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013211A024)

收稿日期：2016-02-10