Mutator轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的玉米甜質(zhì)突變體側(cè)翼序列克隆

成　業(yè),么大軒,劉云婷,胡文靜,段會(huì)軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定　071001)

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Mutator轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的玉米甜質(zhì)突變體側(cè)翼序列克隆

成業(yè),么大軒,劉云婷,胡文靜,段會(huì)軍

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001)

摘要：為了探討Mu轉(zhuǎn)座子使玉米發(fā)生甜質(zhì)突變的分子機(jī)理,利用Mu-AFLP方法分離Mutator轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,并根據(jù)側(cè)翼序列的延伸設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1、P2,驗(yàn)證轉(zhuǎn)座子插入的真實(shí)性,同時(shí)對(duì)插入位點(diǎn)所在的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示:側(cè)翼序列長(zhǎng)299 bp,插入位點(diǎn)位于第3染色體,該轉(zhuǎn)座子的插入屬于真實(shí)插入;突變基因全長(zhǎng)5 746 bp,共編碼592個(gè)氨基酸;所編碼蛋白的理論分子量為67.5 kDa,疏水性氨基酸含量為42.06%,具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于親水性內(nèi)膜蛋白。該結(jié)果為更好地利用Mutator轉(zhuǎn)座子創(chuàng)制甜玉米新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ),也對(duì)揭示玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：甜玉米;Mutator轉(zhuǎn)座子;玉米;Mu-AFLP

甜玉米以其豐富的營(yíng)養(yǎng)及甜、嫩、香等特點(diǎn)成為一種大眾化蔬菜[1-3]。由于甜玉米的遺傳基礎(chǔ)較窄,又沒有像普通玉米那樣有現(xiàn)成的雜種優(yōu)勢(shì)模式可供應(yīng)用,還需要利用SSR[4]、SNP[5]等分子標(biāo)記去劃分雜種優(yōu)勢(shì)類群,這給甜玉米的選育[6-7]帶來了困難,甜玉米育種已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后生產(chǎn)的需求,因此，創(chuàng)制甜玉米種質(zhì)資源顯得尤為重要。

Mutator介導(dǎo)法是創(chuàng)造玉米突變體的最有效的技術(shù)之一[8]。在玉米突變體庫(kù)的構(gòu)建中有物理、化學(xué)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA[9-12]和轉(zhuǎn)座子插入突變等多種方法,其中Mutator具有較高的誘變頻率、低插入位點(diǎn)偏愛性和基因組內(nèi)拷貝數(shù)多等特點(diǎn)。獲得Mu因子誘導(dǎo)的突變體后,必須通過對(duì)Mu插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的生物信息學(xué)分析,才能預(yù)測(cè)突變基因功能。目前,用于分離Mu插入側(cè)翼序列的方法很多,主要包括PCR步移技術(shù)[13]、反向PCR技術(shù)[14-15]、熱不對(duì)稱交錯(cuò) PCR技術(shù)[16]、AFLP技術(shù)[17]等。其中AFLP所需DNA量少,擴(kuò)增效率高,標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定可靠,對(duì)Mu插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分離的準(zhǔn)確性和反應(yīng)的效率高,適合于分離Mu介導(dǎo)的玉米突變位點(diǎn)側(cè)翼序列。

本研究通過對(duì)Mutator轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的玉米甜質(zhì)突變體側(cè)翼序列克隆及突變基因生物信息學(xué)分析,為玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1供試材料

玉米優(yōu)良自交系綜31(Z31)為母本與具有原始來源活性的MuDR轉(zhuǎn)座子的Mu為父本進(jìn)行雜交構(gòu)建誘變?nèi)后wM1,M1自交獲得M2果穗,篩選出Mu轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的甜玉米突變體,作為本研究Mu-AFLP技術(shù)分離甜玉米突變體目標(biāo)基因的試材。提取母本Z31、父本Mu和突變體的DNA作為分離Mu插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的模板。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1玉米基因組DNA的提取和純化采用液氮研磨,CTAB抽提的方法[18]提取玉米基因組DNA,并放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Mu-AFLP方法分離插入位點(diǎn)側(cè)翼序列參照2008年,Wang等[19]的方法,研究分離Mu因子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。

1.2.3差異片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增的差異片段,把Z31、Mu親本和突變體的選擇性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)突變體的差異片段,回收差異條帶,用選擴(kuò)體系及PCR程序再次擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖回收檢測(cè)后連接到PMG-T載體上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,藍(lán)白斑篩選陽性克隆,進(jìn)行菌液PCR鑒定重組子,之后送上海生工有限公司測(cè)序。

1.2.4側(cè)翼序列的基因比對(duì)將去除載體后的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)上與B73序列進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5插入位點(diǎn)真實(shí)性驗(yàn)證在MaizeGDB將側(cè)翼序列上下延伸100～200 bp,使用Primer Premier 6.0軟件對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物來進(jìn)行插入位點(diǎn)的真實(shí)性檢測(cè),并分別命名引物為P1、P2(圖1)。

圖1　Mu插入位點(diǎn)的真實(shí)性驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)示意圖

1.2.6ZmEMP70的生物信息學(xué)分析利用Mu-AFLP方法得到Mu轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,將所獲得的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)中比對(duì)基因組獲得基因的全長(zhǎng)。借助NCBI中的ORF Finder(http://www.nvbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具尋找基因完整的ORF并且利用EditSeq軟件對(duì)該基因ORF進(jìn)行分析。利用DNASTAR的Protean對(duì)蛋白質(zhì)所含的氨基酸殘基和理論分子量,以及等電點(diǎn)和組成氨基酸的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。利用http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/對(duì)ZmEMP70編碼的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用TMHMM-2.0對(duì)ZmEMP70 編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分離

預(yù)擴(kuò)增后吸取10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到彌散條帶(圖2),再進(jìn)行下一步選擇性擴(kuò)增。

1.DL2000 Marker;2.Mu親本;3.Z31親本;4.突變體。

通過選擇性擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見圖3。圖中明顯檢測(cè)到了突變體與親本的差異(A、B箭頭)條帶,并通過回收、測(cè)序等操作分離得到插入位點(diǎn)側(cè)翼序列為299 bp。

Z31.母本;Mu.父本;T.突變體。

2.2插入位點(diǎn)真實(shí)性檢測(cè)

利用P1、P2和S9、P2這2對(duì)引物分別對(duì)Mu活性親本、Z31、突變體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,以P1、P2為引物,Mu親本、Z31和突變體均有擴(kuò)增條帶;用S9、P2這對(duì)引物檢測(cè),Z31與Mu親本在約300 bp處均無帶而突變體有帶(圖4),證實(shí)其為真實(shí)插入。

1.Z31、2.Mu、3.突變體,是P1、P2擴(kuò)增引物檢測(cè)結(jié)果;

2.3生物信息學(xué)分析

2.3.1基因定位及基因全長(zhǎng)的獲得使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)去除載體序列,將去除載體后的序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org)上與B73序列進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)該側(cè)翼序列與B73第3染色體上的一段區(qū)域完全匹配并上下延伸獲得基因全長(zhǎng)(圖5)。

圖5　在基因組及染色體上的位置

2.3.2ZmEMP70的克隆及序列分析將側(cè)翼序列在MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)上進(jìn)行比對(duì)并延伸得到基因的全長(zhǎng)共5 746 bp。借助NCBI中的ORF Finder (http://www.nvbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具尋找完整的基因ORF 1 896 bp,編碼592個(gè)氨基酸,5′UTR 117 bp,3′UTR 230 bp。2.3.3ZmEMP70編碼蛋白質(zhì)的分析將ZmEMP70的1 896 bp的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并利用DNAStar的Protean進(jìn)行分析,得到該基因編碼的蛋白含有592個(gè)氨基酸殘基,理論分子量67.5 kDa,等電點(diǎn)7.814;在pH=7時(shí)帶電量為3.317;疏水性氨基酸含量為42.06%,為親水性蛋白;酸性氨基酸含量為7.60%,堿性氨基酸含量為7.49%,極性氨基酸含量為26.69%(表1)。

2.3.4ZmEMP70編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM-2.0對(duì)ZmEMP70編碼的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,可見該蛋白具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于內(nèi)膜蛋白(圖6)。

表1　ZmEMP70編碼的氨基酸組成分析

圖6　ZmEMP70所編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

3討論

Mutator轉(zhuǎn)座子具有較高的突變頻率、較低的插入專一性、基因組拷貝數(shù)多等特點(diǎn),因此，能夠在較少的群體內(nèi)產(chǎn)生覆蓋全基因組的大量突變體[20-23],圍繞Mu轉(zhuǎn)座子,國(guó)內(nèi)外構(gòu)建了不少突變體庫(kù),如斯坦福大學(xué)的RescueMu突變體庫(kù)[24],冷泉港實(shí)驗(yàn)室的MTMdB突變體庫(kù)[25],華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室等單位構(gòu)建的Mu突變體庫(kù)[26]。通過Mu突變體庫(kù)己經(jīng)成功分離克隆了諸多基因。利用Mu突變體庫(kù)篩選甜玉米突變體進(jìn)行研究,將加速甜玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制。并有助于對(duì)玉米胚乳發(fā)育與淀粉合成機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究報(bào)道的甜玉米突變體,即是來自于Mu誘導(dǎo)的玉米突變體庫(kù)。

通過插入真實(shí)性檢測(cè)證明Mu轉(zhuǎn)座子插入到玉米基因組,該插入使得基因結(jié)構(gòu)改變而失活。普通玉米發(fā)生突變而變甜涉及復(fù)雜的生化過程,玉米的可溶性糖含量可能與胚乳發(fā)育機(jī)制、淀粉的生物合成等有關(guān)。推測(cè)該基因能影響玉米胚乳的發(fā)育,但該基因的具體功能以及作用機(jī)理尚未明確,有望通過RNAi技術(shù)[27-29]對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究,從而更好地從分子水平控制玉米淀粉的合成。

本研究利用玉米轉(zhuǎn)座子Mutator插入突變的方法獲得甜玉米,由于Mutator轉(zhuǎn)座子屬于玉米的內(nèi)源轉(zhuǎn)座子,所以不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全構(gòu)成威脅。然而,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可以有目的地創(chuàng)制甜玉米新種質(zhì),但當(dāng)前學(xué)術(shù)界對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性仍然存在很大爭(zhēng)議,并沒有一個(gè)確切的定論。就各國(guó)政府而言,各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品均抱有比較謹(jǐn)慎的態(tài)度。就我國(guó)而言,還是比較保守的,對(duì)于含有的任何轉(zhuǎn)基因成分,所有市售食品都必須明確標(biāo)注。同時(shí),大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因甜玉米品種還要防止基因污染,以免給生態(tài)環(huán)境帶來不良影響。因此,利用玉米內(nèi)源Mu轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座而誘導(dǎo)甜玉米的方法更為安全。

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Cloning Flanking Sequences Sweet Corn Mutant of Maize Inserted byMutatorTransposon

CHENG Ye,YAO Daxuan,LIU Yunting,HU Wenjing,DUAN Huijun

(Agricultural University of Hebei,North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry,Baoding071001,China)

Abstract：In order to investigate the molecular mechanism of Mu gene transfer in sweet corn mutant,the flanking sequence of the insertion site of Mutator gene was isolated by Mu-AFLP method,and the authenticity of transposon insertions was verified by a pair of specific primers P1 and P2 designed according to the extension of the flanking sequences.Meanwhile the genetic biological information of the insertion site was analyzed.The results showed that the flanking sequence was 299 bp,which was located on the third chromosome.The full length of the mutant gene was 5 746 bp,encoding 592 amino acid.The theoretical molecular weight of the encoding protein was 67.5 kDa,the hydrophobic amino acid content was 42.06%,which had 10 transmembrane.It belonged to hydrophilic membrane protein.This result laid a foundation for the better use of Mutator to create new germplasm of sweet corn and it was very important for the development of endosperm and starch synthesis in maize.

Key words:Sweet corn;Mutator transposons;Maize;Mu-AFLP

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.006

中圖分類號(hào)：Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0028-04

作者簡(jiǎn)介：成業(yè)(1992-),女,河北邢臺(tái)人,主要從事作物分子設(shè)計(jì)育種研究。通訊作者：段會(huì)軍(1965-),男,河北保定人,教授,博士,主要從事作物分子設(shè)計(jì)育種研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“糧食豐產(chǎn)科技工程”課題(2011BAD16B08;2012BAD04BO6;2013BAD07B05);河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目

收稿日期：2016-02-11