豬博卡病毒不同基因型三重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

宏春慧,楊　兵,覃湘婕,周宏專(zhuān),徐福洲,蘇　霞,薛　靜,張曉東,王金洛

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京　102206;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京　100097;3.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,北京　100097)

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豬博卡病毒不同基因型三重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

宏春慧1,2,3,楊兵2,覃湘婕2,周宏專(zhuān)2,徐福洲2,蘇霞2,薛靜3,張曉東3,王金洛2

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京102206;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097;3.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,北京100097)

摘要：為鑒別豬博卡病毒1型、2型和3型3種基因型,根據(jù)豬博卡病毒基因序列分別設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)保守區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增目的片段大小分別為645 bp (PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)。通過(guò)引物濃度和退火溫度等條件優(yōu)化,首次建立了同時(shí)檢測(cè)豬博卡病毒3種基因型的三重PCR方法。所建立的三重PCR方法擴(kuò)增其他豬病病毒結(jié)果均為陰性,最低檢測(cè)限為8×10-7ng/μL。結(jié)果表明，該方法具有較好的特異性和敏感性。對(duì)臨床樣品進(jìn)行三重PCR和單項(xiàng)PCR檢測(cè),對(duì)比結(jié)果顯示符合率為100%。該方法的建立為豬博卡病毒3種不同基因型的鑒別檢測(cè)提供了有效手段。

關(guān)鍵詞：豬博卡病毒;基因型;三重PCR;檢測(cè)

博卡病毒(Bocavirus)為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬的成員。豬博卡病毒(Porcinebocavirus,PBoV)是2009年在患有仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬淋巴結(jié)中,通過(guò)隨機(jī)置換擴(kuò)增的方法和高通量測(cè)序技術(shù)在瑞典首次發(fā)現(xiàn)[1]。由于對(duì)PBoV的研究仍處于起步階段,其單獨(dú)的致病性仍未見(jiàn)報(bào)道,則有報(bào)道認(rèn)為其與患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、仔豬腹瀉等疾病相關(guān)[2-3]。臨床上,該病毒也可能與其他病原混合感染[4-5],進(jìn)而造成更嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PBoV基因組大小在5.2 kb左右,為無(wú)囊膜的單股線狀DNA病毒[6]。PBoV除了與細(xì)小病毒科其他成員共有2個(gè)開(kāi)放閱讀框外(編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白NS1的ORF1和編碼重疊的衣殼蛋白VP1和VP2的ORF2),其在非結(jié)構(gòu)性和結(jié)構(gòu)性編碼區(qū)之中有第3個(gè)博卡病毒特征性的開(kāi)放閱讀框ORF3,編碼一個(gè)高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)NP1[7-8]。

研究人員起初按照病毒發(fā)現(xiàn)時(shí)間的先后順序,根據(jù)ICTV(International Committee on Taxonomy of Viruses,http://www.ictvdb.org/)的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)NS1基因的核苷酸同源性低于95%時(shí),則定義為不同的基因型[4]。近年來(lái),新的序列甚至新的基因型不斷被發(fā)現(xiàn),研究人員通過(guò)對(duì)基因組序列及NS1/VP1/NP1基因序列遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),豬博卡病毒屬總能出現(xiàn)明顯的3個(gè)聚簇,根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序,研究人員將這些聚簇定為3個(gè)型:PBoV1、PBoV2和PBoV3[9-10]。

由于PBoV基因型眾多,給臨床檢測(cè)帶來(lái)一定困難。目前,檢測(cè)PBoV的方法主要有PCR檢測(cè)[11-13],實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[14-15]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)(LAMP)[16]及ELISA檢測(cè)[17]等,但未見(jiàn)能同時(shí)檢測(cè)區(qū)分PboV 3種不同基因型研究的報(bào)道。本研究根據(jù)GenBank公布的PBoV1、PBoV2和PBoV3 3種基因型參考序列的特征,在同源性分析的基礎(chǔ)上,找出保守區(qū),進(jìn)而設(shè)計(jì)引物,并優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)3種PBoV基因型的方法,可以同時(shí)檢測(cè)出PBoV的單獨(dú)或混合感染,為臨床檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試劑2×Es Taq MasterMix購(gòu)自康為世紀(jì)生物制品有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒、Top10感受態(tài)細(xì)胞、病毒DNA/RNA提取試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。DL2000 DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa有限公司。RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司。GoldScript cDNA合成試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2陽(yáng)性質(zhì)粒、病毒與臨床樣品分別含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白編碼片段的陽(yáng)性質(zhì)粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3由畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬庫(kù)布病毒(PKoV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)和偽狂犬病毒(PRV)的cDNA/DNA樣品和大腸桿菌(E.coli)K88由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯(lián)活疫苗購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)購(gòu)自上海海利生物技術(shù)股份有限公司。臨床糞便樣品來(lái)源于2015年2-8月京津冀地區(qū)的部分腹瀉豬場(chǎng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上公布的PBoV相關(guān)的序列信息(表1),利用Lasergene軟件套裝中的Megalign軟件,分析不同型PBoV的保守區(qū),在病毒保守區(qū)分析的基礎(chǔ)之上,利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表2),并由Invitrogen 公司合成。

表1　本試驗(yàn)參考的PBoV序列

表2　本試驗(yàn)所用的引物

注:引物位置分別對(duì)應(yīng)序列PBoV1(HQ291308)、PBoV2(HQ291309)和PBoV3(JF713714)。

Note:Positions correspond to PBoV1(HQ291308),PBoV2(HQ291309)and PBoV3(JF713714).

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備將含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白編碼片段的陽(yáng)性質(zhì)粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3,用核酸分析儀檢測(cè)濃度。根據(jù)濃度測(cè)定結(jié)果,將3種質(zhì)粒用ddH2O稀釋至濃度為20 ng/μL,再將其等量混合即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。1.2.3反應(yīng)條件的優(yōu)化本試驗(yàn)建立的PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中加入2×Es Taq Master Mix 12.5 μL,pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽(yáng)性混合質(zhì)粒模板3 μL,引物的起始濃度均為10 μmol/L,引物體積為0.5～2 μL調(diào)整,PBoV1/PBoV2/PBoV3引物量(10 μmol/L)選擇如下8種組合:0.5 μL/0.5 μL/1.5 μL、0.5 μL/0.5 μL/2 μL、0.5 μL/1 μL/1.5 μL、0.5 μL/1 μL/2 μL、1 μL/0.5 μL/1.5 μL、1 μL/0.5 μL/2 μL、1 μL/1 μL/1.5 μL和1 μL/1 μL/2 μL,以確定最適宜的引物體積。在最佳引物量確定的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)的退火溫度,退火溫度選擇在48～60 ℃內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化,以確定最適宜的退火溫度。

1.2.4特異性試驗(yàn)豬輪狀病毒(RV)樣品和豬瘟病毒(SFV)樣品RNA分別來(lái)源于豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯(lián)活疫苗和豬瘟活疫苗(細(xì)胞源),并按RNeasy Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提。相應(yīng)cDNA樣品按照GoldScript cDNA 合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得。大腸桿菌(E.coli)K88 DNA樣品按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)制備而成。獲取相應(yīng)模板后,利用建立的三重PCR體系,檢測(cè)pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3的陽(yáng)性質(zhì)粒模板和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒(RV)、豬庫(kù)布病毒(PKoV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(SFV)和大腸桿菌(E.coli)K88的cDNA/DNA樣品,以檢測(cè)所建立的三重PCR體系的特異性。

1.2.5敏感性試驗(yàn)將1.2.2中稀釋后等量混合的pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽(yáng)性質(zhì)粒模板(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品)10倍梯度稀釋后,加入到本試驗(yàn)建立的三重PCR體系,利用最佳引物體積和最適宜反應(yīng)溫度進(jìn)行擴(kuò)增,以檢測(cè)三重PCR體系的敏感性。

1.2.6三重PCR的初步應(yīng)用來(lái)自京津冀地區(qū)的臨床收集糞便樣品,以1∶5(m/V)的比例加入PBS稀釋,在渦旋儀上振蕩混合后,4 500 r/min,2 min離心后取上清液,分裝后存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用時(shí)按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA作為模板進(jìn)行三重PCR檢測(cè)。以部分檢出過(guò)PBoV的臨床樣品作為模板,使用建立的三重PCR方法和單項(xiàng)PCR方法分別檢測(cè),以比較檢測(cè)結(jié)果的符合情況。

2結(jié)果與分析

2.1三重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

不同引物濃度的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示,當(dāng)PCR體系中PBoV1/PBoV2型引物量均為0.5 μL時(shí),PBoV3型條帶擴(kuò)增較好;且PBoV3型引物量為2 μL時(shí),PBoV1/PBoV2/PBoV3型3個(gè)目的條帶均能得到很好的擴(kuò)增,條帶大小分別為645,352,259 bp,與預(yù)期相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.PBoV1/PBoV2/PBoV3引物量:

在最適宜溫度的優(yōu)化試驗(yàn)中,使用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物在48～60 ℃內(nèi)均能擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶(圖2)。隨著溫度的不斷升高,PBoV1型目的條帶(645 bp)擴(kuò)增較好,但PBoV2目的條帶(352 bp)和PBoV3型目的條帶(259 bp)的信號(hào)先增強(qiáng)然后變?nèi)酢膱D2中可以看出當(dāng)溫度為57.8 ℃時(shí),PBoV1/PBoV2/PBoV3型3個(gè)目的條帶均能得到很好的擴(kuò)增,且條帶大小均與預(yù)期相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～12.退火溫度:48.0,48.3,49.0,50.2,

通過(guò)對(duì)引物濃度和退火溫度的優(yōu)化,最終確定三重PCR反應(yīng)體系為:2×Es Taq Master Mix 12.5 μL,PBoV1F/PBoV1R(10 μmol/L)各0.5 μL,PBoV2F/PBoV2R(10 μmol/L)各0.5 μL,PBoV3F/PBoV3R(10 μmol/L)各2 μL,模板3 μL,加雙蒸水補(bǔ)足至25 μL;最佳反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

2.2特異性試驗(yàn)

用建立的三重PCR方法檢測(cè)pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽(yáng)性混合質(zhì)粒和單個(gè)質(zhì)粒,均能得到預(yù)期的條帶;而對(duì)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)、豬庫(kù)布病毒(PKoV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(SFV)和大腸桿菌(E.coli)K88的cDNA/DNA樣品檢測(cè)則沒(méi)有條帶出現(xiàn)(圖3),說(shuō)明該方法具有較好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker;1.pEASY-BT1/pEASY-BT2/pEASY-BT3

2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用雙蒸水將pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽(yáng)性混合質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,使用建立的三重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。從圖4中可以看出,利用該三重PCR擴(kuò)增體系,陽(yáng)性模板稀釋106后,仍能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶,其最低檢測(cè)限為8×10-7ng/μL。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.100～107倍稀釋模板DNA。

2.4臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用建立的三重PCR方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)室2015年2-8月間從京津冀地區(qū)豬場(chǎng)采集到的12份PBoV陽(yáng)性糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果比較。結(jié)果顯示使用三重PCR體系的擴(kuò)增結(jié)果與單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果一致,符合率為100%(圖5)。

A.三重PCR檢測(cè);B.PBoV1型檢測(cè);C.PBoV2型檢測(cè);D.PBoV3

3討論

PBoV自2009年發(fā)現(xiàn)以來(lái),國(guó)內(nèi)外許多國(guó)家均報(bào)道了它的流行。然而,PBoV基因型較多,研究認(rèn)為,其可以分為PBoV1、PBoV2和PBoV 3型。其中,PBoV3型是最大的一個(gè)聚簇,其又分為PBoV3A、PBoV3B、PBoV3C、PBoV3D和PBoV3E 5個(gè)亞型,3型參考序列間同源性為76.0%～87.9%[10]。由于其基因型眾多,為臨床檢測(cè)帶來(lái)較大困難。本試驗(yàn)根據(jù)這一特性,在序列分析的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物。此外,在優(yōu)化引物濃度時(shí),由于PBoV3的引物中含有較多的簡(jiǎn)并堿基,而PBoV1和PBoV2的引物中含有的簡(jiǎn)并堿基較少或不含簡(jiǎn)并堿基。因此PBoV1和PBoV2的引物選擇0.5，1 μL(10 μmol/L)2個(gè)濃度梯度,而PBoV3的引物選擇1.5,2 μL(10 μmol/L)2個(gè)濃度梯度相互組合,用來(lái)篩選最適宜的引物濃度。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化建立了三重PCR檢測(cè)體系,其可以在同一反應(yīng)體系中,同時(shí)檢測(cè)3種亞型PBoV病毒,使得PBoV的檢測(cè)更加簡(jiǎn)捷。

多重PCR引物的設(shè)計(jì),在普通PCR引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上,仍需要注意以下3點(diǎn):除每對(duì)引物不形成非特異性擴(kuò)增外,不同引物對(duì)之間在同一體系中,也不形成非特異性擴(kuò)增;每對(duì)引物形成的擴(kuò)增片段大小要合適,能夠在PCR后的凝膠電泳中區(qū)分開(kāi)各擴(kuò)增片段;每對(duì)引物間的退火溫度差異要小,以適合使用同一擴(kuò)增溫度進(jìn)行擴(kuò)增[18]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3對(duì)引物,在進(jìn)行三重PCR檢測(cè)時(shí),未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增,其擴(kuò)增片段大小分別為645,352,259 bp,能夠在凝膠電泳中區(qū)分目的片段,且在57.8 ℃退火條件下能夠擴(kuò)增出清晰條帶,達(dá)到了試驗(yàn)預(yù)期目的。

在利用本試驗(yàn)建立的三重PCR檢測(cè)體系檢測(cè)京津冀地區(qū)豬腹瀉樣品時(shí)發(fā)現(xiàn),所有基因型的PBoV均能在京津冀地區(qū)的豬腹瀉樣品中檢測(cè)到。同時(shí),一份臨床樣品中,經(jīng)常能檢測(cè)到不同亞型的PBoV感染,證明PBoV存在共感染的情況。Jiang等[19]的研究也揭示了共感染這一現(xiàn)象,PBoV的共感染在一定程度上,增加了不同PBoV基因型間發(fā)生重組的概率,易產(chǎn)生新的基因型,進(jìn)而加速PBoV的序列進(jìn)化。

本試驗(yàn)根據(jù)PBoV的序列特性,建立了PBoV的三重PCR方法,在同一體系中可以同時(shí)檢測(cè)3種基因型的豬博卡病毒。試驗(yàn)證實(shí)該方法具有較好的特異性和敏感性,并可用于臨床樣品的檢測(cè)。該方法的建立為豬博卡病毒3種不同基因型的高效檢測(cè)提供了有效手段。

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Development of a Triple PCR Method for Identifying Three Genotypes ofPorcinebocavirus

HONG Chunhui1,2,3,YANG Bing2,TAN Xiangjie2,ZHOU Hongzhuan2,XU Fuzhou2,SU Xia2,XUE Jing3,ZHANG Xiaodong3,WANG Jinluo2

(1.Animal Science and Technology College,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry,Beijing100097,China;3.Beijing Agro-biotechnology Research Center,Beijing100097,China)

Abstract：To develop a method for identifying three genotypes of Porcine bocavirus,3 pairs of primers against conserved regions were designed according to the published gene sequences of Porcine bocavirus,and the PCR products were 645 bp(PBoV1),352 bp(PBoV2),259 bp(PBoV3),respectively.By optimizing the reaction conditions,a triple PCR method for detecting all three genotypes of Porcine bocavirus was established for the first time.Results showed that no specific band was amplified from other porcine viruses by the triple PCR.The detection limit of the method was 8×10-7ng/μL.The results indicated that this method had not only good sensitivity but also high specificity.The clinical samples were used to detect three genotypes of Porcine bocavirus by the triple PCR and single PCR respectively with the coincidence of 100%.The establishment of the triple PCR method is helpful for identifying the three genotypes of Porcine bocavirus.

Key words:Porcine bocavirus;Genotype;Triple PCR;Detection

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.003

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78;S436

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0012-05

作者簡(jiǎn)介：宏春慧(1988-),女,河北衡水人,在讀碩士,主要從事免疫與動(dòng)物疫病防治研究。通訊作者：王金洛(1956-),男,四川自貢人,研究員,博士,主要從事畜禽疫病防治研究。

基金項(xiàng)目：北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(KJCX20140409);北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Z131100003113015)

收稿日期：2016-02-13