H2S對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能異常的影響

盧根林，吳愛兵，王宏賓（.義烏市中心醫(yī)院 普通外一科，浙江 金華 000；.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤中心，廣東 湛江5808；.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，青海 西寧 8000）

?

H2S對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能異常的影響

盧根林1，吳愛兵2，王宏賓3
（1.義烏市中心醫(yī)院 普通外一科，浙江 金華 322000；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤中心，廣東 湛江523808；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，青海 西寧 810001）

［摘 要］目的：H2S對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能異常的影響及機(jī)制。方法：24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為A（假手術(shù)）組、B（缺血-再灌注）組和C（缺血-再灌注+NaHS）組。建立大鼠腸缺血-再灌注損傷模型，再灌注前10 min C組大鼠經(jīng)尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS并以1 mg/（kg·h）速度靜脈維持到再灌注2 h。RT-PCR、流式細(xì)胞儀法分別檢測(cè)單核細(xì)胞蛋白酶激活受體-1（PAR-1）、PAR-3 mRNA及蛋白表達(dá)；ELISA法檢測(cè)血組織因子（TF）、TNF-α、組織型纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）；敏感硫電極法測(cè)定血H2S；檢測(cè)凝血VIII因子活性（FVIII：C）、血管性血友病因子（vWF）、纖溶酶原活性（PLG：A）、抗凝血酶活性（AT：A）、血小板計(jì)數(shù)。結(jié)果：C組PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII：C、vWF、t-PA、PAI-1均低于B組、高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；C組H2S、PLG：A、AT：A低于A組、高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。H2S與PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII：C、vWF、t-PA、PAI-1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.58、-0.68、-0.62、-0.64、-0.73、-0.55、-0.57、-0.64，均P＜0.01），與PLG：A、AT：A呈正相關(guān)（r=0.57、0.61，均P＜0.01）。結(jié)論：H2S通過降低PAR-1、TF、TNF-α含量，改善大鼠腸缺血-再灌注損傷時(shí)的凝血功能異常。

［關(guān)鍵詞］腸缺血-再灌注損傷；硫化氫；凝血功能；大鼠

H2S由小腸組織胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化L-半胱氨酸生成［1］，對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用［1-2］，可改善腸缺血-再灌注損傷大鼠的凝血功能［3］，但具體機(jī)制未明。組織因子（TF）、單核細(xì)胞蛋白酶激活受體-1（PAR-1）、TNF-α表達(dá)上調(diào)加劇了炎癥級(jí)聯(lián)與凝血反應(yīng)的惡性循環(huán)［4-5］。本文在大鼠腸缺血-再灌注損傷模型上，觀察大鼠凝血功能和血中TF、PAR-1、PAR-3、TNF-α含量的變化及H2S的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，6周齡，體質(zhì)量200～250 g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：201001018），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并同意實(shí)施。

1.1.2主要試劑：敏感硫電極和PXS-270離子（上海雷磁儀器廠），組織型纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、TF、TNF-α ELISA試劑盒、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗鼠PAR-1、PAR-3抗體試劑盒（美國(guó)Santa Cruz司），Trizol（美國(guó)Promega公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理方法：將大鼠隨機(jī)分為A（假手術(shù)）組、B（缺血-再灌注）組，C（缺血-再灌注+NaHS）組，每組8只。剖腹及游離腸系膜上動(dòng)脈（SMA），無(wú)損傷動(dòng)脈夾鉗夾B、C組大鼠SMA 60 min和再灌注120 min，建立大鼠腸缺血-再灌注損傷模型［1-2］。在再灌注前10 min C組大鼠經(jīng)尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS并以1 mg/（kg·h）速度靜脈維持到再灌注2 h。A、B組大鼠經(jīng)尾靜脈注入相同體積的0.9%氯化鈉溶液，作用時(shí)間和持續(xù)時(shí)間均同C組［1-2］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取血離心分離血漿。

1.2.2血漿H2S濃度測(cè)定：參照文獻(xiàn)［6-7］，敏感硫電極法測(cè)定血漿H2S濃度。

1.2.3血漿抗凝血酶活性（AT∶A）、纖溶酶原活性（PLG∶A）、檢測(cè)凝血VIII因子活性（FVIII∶C）、血管性血友病因子（vWF）、血小板測(cè)定：參照文獻(xiàn)［8-9］，Sysmex CA-1500自動(dòng)血凝儀檢測(cè)血漿AT∶A、PLG∶A、FVIII∶C、vWF含量，血細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板。

1.2.4PAR-1、PAR-3表達(dá)：參照文獻(xiàn)［4-5］，采集外周血單核細(xì)胞，于細(xì)胞懸液中加入1 μg/106細(xì)胞FITC標(biāo)記抗鼠PAR-1、PAR-3抗體，4 ℃避光孵育15 min，加入2 mL PBS洗滌1次，加入0.4 mL PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5血漿TF、TNF-α、t-PA、PAI-1測(cè)定：嚴(yán)格按試劑盒說明，ELISA法檢測(cè)血漿TF、TNF-α、t-PA、PAI-1濃度。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)大鼠單核細(xì)胞PAR-1、PAR-3 mRNA的表達(dá)：大鼠PAR-1引物序列為5’-CAGCTCCTGG CTGACACTCTTGTCGGC-3’（上游），5’-CGAGCAGGGTTTC ATTGAGCACAT-3’（下游），擴(kuò)增片段為500 bP；PAR-3引物序列為5’-GGCTGGACAGGAGCCACGAT-3’（上游），5’-A GCGGTTGATGCTGATGCAGG-3’（下游），擴(kuò)增片段為403 bP；內(nèi)參β-actin引物序列為5’-AGGGGCCGG ACTCGTCATACT-3’（上游），5’-GGCGGCAACACCATGTACC CT-3’（下游），擴(kuò)增片段為202 bp。采集外周血單核細(xì)胞，一步法提取血單核細(xì)胞總RNA，電泳見28、18 s條帶，以5 μg總RNA為模板，以Random Premier為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min后，95 ℃變性30 s、（PAR-1）61 ℃/（PAR-3）58 ℃/（β-actin）55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用UVPGD800圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，以PAR-1、PAR-3/β-actin值表示PAR-1、PAR-3 mRNA含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用Q檢驗(yàn)，相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血FVIII：C、vWF、PLG：A、AT：A和血小板計(jì)數(shù)比較 C組FVIII∶C、vWF均顯著低于B組、高于A組，PLG∶A、AT∶A低于A組、高于B組（均P＜0.01），各組大鼠血小板計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組大鼠FVIII∶C、vWF、PLG∶A、AT∶A、t-PA、PAI-1和血小板檢測(cè)（n=8，±s）

表1　各組大鼠FVIII∶C、vWF、PLG∶A、AT∶A、t-PA、PAI-1和血小板檢測(cè)（n=8，±s）

與A組比：aP＜0.01；與B組比：bP＜0.01

組別　FVIII∶C（%）　vWF（%）　PLG∶A（%）　AT∶A（%）　　血小板（×109/L）　t-PA（μg/L）　PAI-1（ng/L）A　 89.2±12.4ab　76.4± 8.2ab　78.4±8.7ab　87.1±9.5ab　18.4±3.2　 4.5±0.5ab　427.4±24.3abB　150.6±22.6ab　142.5±12.5ab　50.7±6.2ab　67.2±7.2ab　16.6±2.4　12.7±1.2ab　854.2±41.7abC　120.5±19.8ab　112.6± 9.7ab　61.3±5.4ab　74.6±6.7ab　17.2±1.8　 6.4±0.8ab　642.7±32.1ab

2.2各組大鼠血t-PA、PAI-1的變化 C組t-PA、PAI-1均顯著低于B組、高于A組（均P＜0.01），B組t-PA/PAI-1值顯著高于A和C組（P＜0.01），見表1。

2.3各組大鼠PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α、H2S表達(dá)

C組PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α均顯著低于B組、高于A組，H2S低于A組、高于B組（均P＜0.01）；3組PAR-3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

表2　各組大鼠H2S、PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α檢測(cè)（n=8，±s）

表2　各組大鼠H2S、PAR-1、PAR-3、TF、TNF-α檢測(cè)（n=8，±s）

與A組比：aP＜0.01；與B組比：bP＜0.01

組別　H2S（μmol/L）　PAR-1（ng/L）　PAR-1 mRNA　 PAR-3（ng/L）　PAR-3 mRNA　 TF（ng/L）　TNF-α（ng/L）A　42.57±7.18ab　12.27±3.12ab　0.22±0.03ab　18.63±4.32　 0.27±0.02　 98.5±12.4ab　4.08±0.94abB　24.38±2.69ab　56.12±9.07ab　0.68±0.06ab　19.27±5.14　 0.26±0.03　 542.6±29.4ab　49.02±1.62abC　35.27±3.14ab　32.16±8.43ab　0.34±0.04ab　17.46±3.69　 0.28±0.04　 345.7±32.1ab　39.27±1.54ab

圖1　各組大鼠血單核細(xì)胞PAR-1、PAR-3 mRNA表達(dá)

2.4各指標(biāo)的相關(guān)性 H2S與PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1呈負(fù)相關(guān)（r= -0.58、-0.68、-0.62、-0.64、-0.73、-0.55、-0.57、-0.64，均P＜0.01），與PLG∶A、AT∶A呈正相關(guān)（r=0.57、0.61，均P＜0.01）。FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1與PAR-1呈正相關(guān)（r=0.56、0.62、0.67、0.54，均P＜0.01），與PAR-1 mRNA呈正相關(guān)（r=0.53、0.57、0.56、0.64，均P＜0.01），與TF呈正相關(guān)（r=0.72、0.59、0.72、0.75，均P＜0.01），與TNF-α呈正相關(guān)（r=0.63、0.71、0.73、0.67，均P＜0.01）。PLG∶A、AT∶A與PAR-1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.77、-0.69，均P＜0.01），與TF呈負(fù)相關(guān)（r=-0.61、-0.64，均P＜0.01），與TNF-α呈負(fù)相關(guān)（r=-0.55、-0.74，均P＜0.01）。

3　討論

缺血-再灌注損傷大鼠氧自由基、炎癥遞質(zhì)、細(xì)胞因子［1-2］、內(nèi)毒素等大量釋放引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損害。血管內(nèi)皮損傷暴露的膠原纖維，與膠原受體糖蛋白、整合素或與膠原連接的vWF和整合素結(jié)合并黏附血小板［8-10］。血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板α顆粒合成的糖蛋白vWF，保護(hù)FVIII的活性，促進(jìn)血小板黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，形成穩(wěn)定的不可逆轉(zhuǎn)的血栓；vWF和FVIII的增加反映了機(jī)體同時(shí)存在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凝血系統(tǒng)的激活［8-10］。抗凝血酶（AT）是主要的生理性抗凝物質(zhì)［8-9］。當(dāng)機(jī)體凝血功能亢進(jìn)、局部發(fā)生凝血時(shí)，與纖維蛋白結(jié)合的單鏈糖蛋白PLG，被組織纖溶酶原激活劑或單鏈尿激酶活化為纖溶酶，啟動(dòng)纖溶系統(tǒng)［11-12］。t-PA/PAI-1是衡量纖溶功能的指標(biāo)［11-12］。本研究結(jié)果顯示，B組FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1、t-PA/PAI-1顯著高于A組，PLG∶A、AT∶A低于A組，表明大鼠腸缺血-再灌注損傷時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凝血、纖溶系統(tǒng)激活，表現(xiàn)為凝血功能異常。

PAR-1、PAR-3是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的重要成員，由凝血酶激活。PAR-1、PAR-3可激活血小板，促進(jìn)血小板聚集，參與凝血過程，參與細(xì)胞因子、遞質(zhì)的釋放；增加血管的滲出以及中性粒細(xì)胞的趨化，參與血管擴(kuò)張、血管收縮、細(xì)胞增生等炎癥及變態(tài)反應(yīng)的病理過程［13］。本研究發(fā)現(xiàn)：大鼠單核細(xì)胞可表達(dá)PAR-1、PAR-3，與Adams等［13］研究結(jié)果相一致。缺血-再灌注損傷大鼠小腸黏膜通透性增加，腸源性細(xì)菌移位［1-2］。機(jī)體在感染致病因子的刺激下，TF表達(dá)上調(diào)，啟動(dòng)內(nèi)、外凝血途徑激活凝血系統(tǒng)；TF與FVII結(jié)合形成TF-FVIIα復(fù)合物并激活凝血酶原形成凝血酶；TF-FVIIα復(fù)合物和凝血酶又可以結(jié)合單核細(xì)胞PAR-1，引起TNF-α的合成和釋放［4-5］。TNF-α激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)［14］，誘導(dǎo)TF表達(dá)，加劇炎癥級(jí)聯(lián)與凝血反應(yīng)的惡性循環(huán)［4-5］。本研究結(jié)果顯示B組TF、PAR-1、PAR-1 mRNA、TNF-α顯著高于A組，與PLG∶A、AT∶A負(fù)相關(guān)，與FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1正相關(guān)，提示腸缺血-再灌注損傷大鼠PAR-1、TF、TNF-α表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)凝血功能異常。

H2S由小腸組織CSE催化L-半胱氨酸生成，對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠小腸黏膜屏障、肝臟功能障礙起保護(hù)作用［1-2］；可改善腸缺血-再灌注損傷大鼠的凝血功能［3］。本研究結(jié)果顯示，A組血H2S顯著高于B組，表明內(nèi)源性H2S對(duì)維持凝血功能正常發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)C組FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1、t-PA/PAI-1顯著低于B組，PLG∶A、AT∶A、H2S顯著高于B組，提示予以外源性H2S供體（NaHS）后，血H2S濃度升高，改善大鼠腸缺血-再灌注損傷時(shí)的凝血功能異常。

本研究還發(fā)現(xiàn)：C組PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α顯著低于B組，而PAR-3基因表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示H2S下調(diào)腸缺血-再灌注損傷大鼠PAR-1、TF、TNF-α表達(dá)。相關(guān)分析研究顯示，H2S與PAR-1、PAR-1 mRNA、TF、TNF-α、FVIII∶C、vWF、t-PA、PAI-1負(fù)相關(guān)，與PLG∶A、AT∶A正相關(guān)，H2S通過降低PAR-1、TF、TNF-α含量，進(jìn)而改善大鼠腸缺血-再灌注損傷時(shí)的凝血功能異常。NaHS能否作為一種藥物用于治療大鼠腸缺血-再灌注損傷時(shí)的凝血功能異常，待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］閆興軍，盧根林，鄧勇. 硫化氫在腸缺血-再灌注損傷大鼠腸黏膜屏障功能障礙中的作用［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27（1）： 71-74.

［2］盧根林，閆興軍，鄧勇，等. 硫化氫在腸缺血-再灌注損傷大鼠肝臟功能障礙中的作用［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27（7）： 907-910.

［3］斯偉宏，盧根林，黃驚鴻，等. 血硫化氫與腸缺血-再灌注損傷大鼠凝血功能相關(guān)性研究［J］. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，4（1）： 16-17.

［4］歸詠剛，姚詠明，柴艷芬. 血必凈注射液對(duì)膿毒癥大鼠單核細(xì)胞組織因子及凝血功能的影響［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27（1）： 32-34.

［5］歸詠剛，姚詠明，柴艷芬. 血必凈注射液對(duì)內(nèi)毒素刺激大鼠單核細(xì)胞組織因子的影響［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009，26（3）： 289-291.

［6］斯偉宏. 硫化氫在急性腹膜炎患者血漿中的表達(dá)及意義［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，42（2）： 181-182.

［7］耿彬，杜軍保，唐朝樞. 敏感硫電極法在測(cè)定心血管組織細(xì)胞及血漿胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氫的應(yīng)用［J］. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，37（5）： 545-548.

［8］施紅旗，王明山，張啟瑜，等. 胃癌患者凝血功能變化的研究［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，34（4）： 182-184.

［9］計(jì)光，李玲文，王霄霞，等. 經(jīng)靜脈永久心臟起搏器植入前后凝血功能的變化及臨床意［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，37（3）： 212-214.

［10］謝耀盛，王明山，金艷慧，等. 子宮肌瘤患者雌激素水平對(duì)凝血纖溶功能的影響及其臨床意義［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，44（5）： 360-362.

［11］楊麗紅，郝秀萍，丁紅香，等. 兩個(gè)γTrp208Leu雜合突變導(dǎo)致的遺傳性低纖維蛋白原血癥家系表型和基因型分析［J］.溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，45（7）： 525-529.

［12］陶曉曉，王鵬，金云龍，等. 不同劑量烏拉地爾對(duì)急性缺血性卒中血壓和院內(nèi)時(shí)間延誤的影響［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，45（9）： 671-673.

［13］ADAMS M N，RAMACHANDRAN R，YAU M K，et al. Structure，function and pathophysiology of protease activated receptors［J］. Pharmacol Ther，2011，130（3）: 248-282.

［14］代佳，呂建祎，張敏，等. 人支氣管上皮細(xì)胞中苯并芘誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)的分子機(jī)制［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，44 （5）： 781-786.

（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Effects of hydrogen sulfide on coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Genlin1，WU Aibing2，WANG Hongbin3. 1.The First Department of General Surgery，Yiwu Central Hospital，Jinhua，322000； 2.Oncology Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，523808； 3.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，810001

Abstract:Objective: To study the effects of hydrogen sulfide on coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Methods: Twenty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups （8 in each group）: sham operation group （group A），ischemia-reperfusion group （group B），ischemia-reperfusion and sodium hydrosulfide group （group C）. The animal model of intestinal ischemia-reperfusion was established. Rats in Group C were received sodium hydrosulfide （100 μmol/kg bolus+1 mg·kg-1· h-1infusion） 10 min prior to the onset of reperfusion. Expressions of PAR-1 and PAR-3 were detected by RT-PCR and flow cytometry. Serum H2S was tested by sensitive sulfide electrode. Serum TF，TNF-α，t-PA，PAI-1 were determined by ELISA. PLG:A，F(xiàn)VIII:C，vWF，AT:A，platelet were measured. Results: PAR-1，PAR-1 mRNA，TF，TNF-α，F(xiàn)VIII:C，vWF，t-PA，PAI-1 in group C were significantly higher than those in group A，predominantly lower than those in group B （P＜0.01）. H2S，PLG:A，AT:A in group C were sharply higher than those in group B，strikingly lower than those in group A （P＜0.01）. H2S negatively correlated with PAR-1，PAR-1 mRNA，TF，TNF-α，F(xiàn)VIII:C，vWF，t-PA，PAI-1 （r=-0.58，-0.68，-0.62，-0.64，-0.73，-0.55，-0.57，-0.64，P＜0.01），positively correlating with PLG:A，AT:A （r=0.57，0.61，P＜0.01）. Conclusion: H2S attenuates coagulation dysfunction in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury by down-regulating PAR-1，TF，TNF-α.

Key words:intestinal ischemia-reperfusion injury； hydrogen sulfide； coagulation function； rats

作者簡(jiǎn)介：盧根林（1973-），男，浙江龍游人，副主任醫(yī)師，碩士。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（812016 72）；義烏市人才引進(jìn)立項(xiàng)項(xiàng)目（2012-R-04）。

收稿日期：2015-09-14

［中圖分類號(hào)］R656.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.007